細胞工程習題-第十三章

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第十三章 復(fù)習題一、簡述胚胎干細胞體外培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)1、胚胎干細胞來源（1）胚胎內(nèi)細胞團（2）原始生殖細胞（3）胚胎瘤細胞2、胚胎干細胞的分離（1）免疫外科學(xué)法（2）組織培養(yǎng)法（3）顯微外科學(xué)法3、培養(yǎng)方法（1）有滋養(yǎng)層培養(yǎng)法（2）無滋養(yǎng)層培養(yǎng)法4、胚胎干細胞的鑒定（1）堿性磷酸酶活性（2）端粒酶活性 （3）干細胞標記物二、舉例說明怎樣分離鑒定成體干細胞骨髓造血干細胞分離 1、造血干細胞分離:抽取的患者骨髓液500 mL按41比例加入HES,自然沉降紅細胞后,分離上清。4,400 g離心10 min得細胞沉淀物,以1%白蛋白鹽水液洗滌細胞2次。percoll液密度梯度

2、離心法:按體積比為(11 52)1在骨髓液中加入淋巴細胞分離液。4,1 500 r/min,離心20 min。取單個核細胞層,以1%白蛋白鹽水液洗滌3次。 2、造血干細胞冷凍保存:將二甲基亞砜(DMSO)、HES、血清白蛋白配成終濃度分別為5%、6%、4%的混合冷凍保護液。在0冰水浴中,將分離的干細胞緩慢加入冷凍保護液中,使細胞濃度為1×10 9/L。采用程序降溫儀控制細胞溫度的下降速率:5/min下降到4,維持8 min;2/min下降到-30;1/min下降至-40;5/min下降至-80,維持5 min;將干細胞放入液氮罐中冷凍保存1年。3、造血干細胞的復(fù)蘇:細胞放入40水浴中

3、,控制在1 min內(nèi)使其快速融化。4、有核細胞(NC)及單個核細胞(MNC)計數(shù):采用血細胞計數(shù)池計NC及MNC總數(shù)。5、錐蟲藍活率測定:用0 1 4%錐蟲藍1滴加入9滴細胞懸液浸染細胞3 min。被染成淡藍色為死細胞,而活細胞拒染。用血細胞計數(shù)池計數(shù)未染色的細胞。根據(jù)下列公式計算細胞活率:活細胞率(%)=活細胞總數(shù)/(活細胞數(shù)+死細胞總數(shù))×100%。6、粒2巨噬細胞集落生成單位(GFU 2GM)培養(yǎng):采用甲·9 9 4·山西醫(yī)藥雜志2007年6月第36卷第6期Shanxi Med J,June 2007,Vol 36,No.6基纖維半固體培養(yǎng)基體系進行集落培養(yǎng)

4、。培養(yǎng)體系中含有50g/L重組干細胞生長因子(rhSCF)、10g/L rhGM 2CSF、10g/L重組白細胞介素(rhIL)2 3。在1 mL培養(yǎng)體系中加入1×10 5個有核細胞。5%CO 2,37條件下培養(yǎng)14 d,倒置顯微鏡下計數(shù)CFU 2 GM。7、CD34+細胞檢測:取100L細胞液體,加入50L異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗CD34+抗體。陰性對照加入50L IgG 2藻紅蛋白(PE)。室溫避光放15 min,加溶血素500L,避光30 min后流式分析。三、分析討論干細胞研究的優(yōu)點與存在的問題胚胎干細胞1.胚胎干細胞優(yōu)點：無限的分化潛能。2.胚胎干細胞問題（1）來

5、源限制：人類胚胎干細胞研究存在細胞來源限制問題。（2）體外培養(yǎng)困難：由于胚胎干細胞在體外培養(yǎng)會自發(fā)分化，而且機制還不非常清楚，控制胚胎干細胞分化的抑制的技術(shù)有待完善，例如飼養(yǎng)層細胞與條件培養(yǎng)基還不成熟。（3）安全性：胚胎干細胞和多能成體干細胞的自發(fā)分化方向是多向的，移植到體內(nèi)的干細胞的分化方向會與預(yù)期不同。干細胞移植后的成瘤性風險也比較大。異體移植仍能引起免疫排斥反應(yīng)。（4）倫理道德問題：獲取人的胚胎干細胞、建立胚胎干細胞系必須要破壞胚囊，體外培養(yǎng)的胚囊是否具有生命還存在著爭議，所以人類胚胎干細胞研究面臨倫理道德問題。成體干細胞1.成體干細胞優(yōu)點（1）來源方便：可以從自身獲得。（2）沒有倫理學(xué)

6、問題：成體干細胞來自成熟個體，不會損傷供體。（3）避免免疫排斥反應(yīng)：同種異體胚胎干細胞及其分化細胞用于臨床會引起免疫排斥。盡管通過采取自身供體細胞核通過治療性克隆可以得到自身胚胎干細胞，但是克隆技術(shù)的不成熟限制了目前的應(yīng)用。（4）比較安全：雖然胚胎干細胞能分化成各種細胞類型，但目前還不能完全控制胚胎干細胞的定向分化，容易導(dǎo)致畸胎瘤。相對而言，成體干細胞比較安全。成體干細胞問題（1）由于成體干細胞在組織中含量極少，又缺乏特異性檢測標志，因此很難從組織中分離純化出來。（2）成體干細胞的可塑性機制還不清楚。例如：脂肪組織來源的干細胞不能排除隨血液進入脂肪組織的造血干細胞或其他類型的干細胞。要確定一種成體干細胞的確切的組織來源還需要進行大量深入的研究。（3）還有待建立有效的使成體干細