打印 現(xiàn)在分子生物學(xué)

1、真核生物的啟動(dòng)子有其特殊性真核生物的啟動(dòng)子有其特殊性，真核生物有三種RNA聚合酶，每一種都有自己的啟動(dòng)子類型。以RNA聚合酶的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)為例，人們比較了上百個(gè)真核生物RNA聚合酶的啟動(dòng)子核苷酸序列伯發(fā)現(xiàn)；在-25區(qū)有TATA框，又稱為Hogness框或Goldberg-Hogness框。其一致序列為T(mén)28A97A93A85A63T37A83A50T37，基本上都由A，T堿基所組成，實(shí)驗(yàn)表明，TATA框決定了轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的選擇，天然缺少TATA框的基本可以從一個(gè)以上的位點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。在-75區(qū)有CAAT框，其一致的序列為GGTCAATCT。有實(shí)驗(yàn)表明CAAT框與轉(zhuǎn)錄起始頻率有關(guān)。三）原核基因轉(zhuǎn)錄的起始

2、三）原核基因轉(zhuǎn)錄的起始原核生物轉(zhuǎn)錄起始可分為四個(gè)階段： 核心酶在因子參與下接觸到DNA上；RNA聚合酶識(shí)別啟動(dòng)子并與之結(jié)合，形成封閉性的起始復(fù)合物；酶結(jié)合在-10區(qū)，啟動(dòng)子活化；然后解開(kāi)雙鏈，暴露模板鏈；酶移動(dòng)到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，加上第一個(gè)核苷三磷酸，形成三元復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄開(kāi)始。 四）真核基因轉(zhuǎn)錄的起始四）真核基因轉(zhuǎn)錄的起始真核生物轉(zhuǎn)錄起始十分復(fù)雜，往往需要多種蛋白因子的協(xié)助，已經(jīng)知道，在所有的細(xì)胞中有一類叫做轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)分子，它們與RNA聚合酶形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，共同參與轉(zhuǎn)錄起始的過(guò)程。 真核生物基因中，有專門(mén)為蛋白質(zhì)編碼的基因，這些基因由RNA聚合酶負(fù)責(zé)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始關(guān)鍵性作用。根據(jù)這些轉(zhuǎn)錄因

3、子的作用特點(diǎn)可大致分為二類；第一類為普遍轉(zhuǎn)錄因子，它們與RNA聚合酶共同組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄才能在正確的位置上開(kāi)始。普遍轉(zhuǎn)錄因子是由多種蛋白質(zhì)分子組成的，其中包括特異結(jié)合在TATA盒上的蛋白質(zhì)，叫做TATA盒結(jié)合蛋白，還有至成一組復(fù)合物叫做轉(zhuǎn)錄因子D。TFD再與RNA聚合酶結(jié)合完成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成。除TFD以外，在細(xì)胞核提取物中還發(fā)現(xiàn)TFA，TFF，TFE，TFH等，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄起始復(fù)合物組裝的不同階段起作用，像TFH就有旋轉(zhuǎn)酶活性，它可利用ATP分解產(chǎn)生的能量，介導(dǎo)起始點(diǎn)雙螺旋的打開(kāi)，使RNA聚合酶得以發(fā)揮作用。從中也不難看出真核細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的起始是基因的表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵，這么多蛋白質(zhì)

4、分子之間相互作用，以及這些蛋白質(zhì)分子DNA調(diào)控元件相結(jié)合，構(gòu)成控制基因轉(zhuǎn)錄開(kāi)始的復(fù)雜體系。 第二類轉(zhuǎn)錄因子為組織細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子或者叫可誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子，這此TF是在特異的組織細(xì)胞或是受到一些類固醇激素，生長(zhǎng)因子或其它刺激后，開(kāi)始表達(dá)某些特異蛋白質(zhì)分子時(shí)，才需要的一類轉(zhuǎn)錄因子。 一）原核生物一）原核生物mRNA的特征的特征1 原核生物的mRNA半衰期短2 許多原核生物mRNA以多順?lè)醋拥男问酱嬖? 原核生物mRNA5端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，3端沒(méi)有或只有較短的poly(A)結(jié)構(gòu)。原核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯不僅發(fā)生在同一個(gè)細(xì)胞空間里，而且這兩個(gè)過(guò)程幾乎是同步進(jìn)行的，蛋白質(zhì)合成往往在mRNA剛開(kāi)始轉(zhuǎn)錄

5、是被引發(fā)了。一個(gè)原核細(xì)胞的mRNA(包括病毒)有時(shí)可以編碼幾個(gè)多肽，而一個(gè)真核細(xì)胞的mRNA最多只能編碼一個(gè)多肽。1 半衰期較長(zhǎng)，幾乎都是單順?lè)醋拥男问酱嬖? 真核生物的mRNA的5端存在帽子結(jié)構(gòu)。帽子結(jié)構(gòu)可能使mRNA免遭核酸酶的破壞。mRNA的帽子結(jié)構(gòu)常常被甲基化3 絕大多數(shù)真核生物mRNA具有poly(A)尾巴真核細(xì)胞mRNA的最大特點(diǎn)在于它往往以一個(gè)較大分子質(zhì)量的前提RNA出現(xiàn)在核內(nèi)，只有成熟的，相對(duì)分子質(zhì)量明顯變小并經(jīng)化學(xué)修飾的mRNA才能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，參與蛋白質(zhì)的合成。所以，真核細(xì)胞的mRNA的合成和功能表達(dá)發(fā)生在不同的空間和時(shí)間范籌內(nèi)。二）二） 真核生物真核生物mRNA的特征的特征

6、3.4 原核生物與真核生物原核生物與真核生物mRNA的特征比較的特征比較一一 RNA中的內(nèi)含子中的內(nèi)含子 斷裂基因：斷裂基因的存在表明真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和mRNA合成過(guò)程比原核細(xì)胞要復(fù)雜的多，因?yàn)檎婧嘶虻谋磉_(dá)往往伴隨著RNA的剪接過(guò)程，從mRNA前體分子中切除被稱為內(nèi)含子的非編碼區(qū)，并使基因中被稱為外顯子的編碼區(qū)拼接形成成熟mRNA。真核基因大多是斷裂的，也就是說(shuō)一個(gè)基因可由多個(gè)內(nèi)含子和外顯子間隔排列而成。 外顯子：編碼蛋白質(zhì)的序列。 內(nèi)含子：初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物hnRNA加工產(chǎn)生成熟mRNA時(shí)被切除的間隔序列。研究表明，內(nèi)含子在真核基因中所占的比例非常高，甚至超過(guò)99%。3.5 內(nèi)含子的剪接編輯及

7、化學(xué)修飾內(nèi)含子的剪接編輯及化學(xué)修飾 研究表明，許多相對(duì)分子質(zhì)量較小的核內(nèi)RNA以及與 這些RNA相結(jié)合的核蛋白(被稱為snRNPs)參與RNA的 剪接。mRNA鏈上每個(gè)內(nèi)含子的5和3段分別與不 同的snRNPs相結(jié)合，形成RNA和RNP復(fù)合物。 在高等真核生物中，內(nèi)含子通常是有序或組成性地從 mRNA前體中被剪接，然而，在個(gè)體發(fā)育或細(xì)胞分化 時(shí)可以有選擇地越過(guò)某些外顯子或某個(gè)剪接點(diǎn)進(jìn)行變 位剪接，產(chǎn)生出組織或發(fā)育階段特異性mRNA，稱為 內(nèi)含子的變位剪接。一般情況下，由u1snoRNA以堿基互補(bǔ)的方式識(shí)別mRNA前體5剪接點(diǎn)，由結(jié)合在3剪接點(diǎn)上游富嘧啶區(qū)的u2AF識(shí)別3剪接點(diǎn)，并引導(dǎo)u2snR

8、NP與分支點(diǎn)相結(jié)合，形成剪接前體，并進(jìn)一步與 u4、 u5、 u6snRNP三聚體相結(jié)合，形成60s的剪接體，進(jìn)行RNA前體分子的剪接。二二 RNA的剪接的剪接 原核生物的結(jié)構(gòu)基因是連續(xù)編碼序列，而真核生物基因往往是斷裂基因，即編碼一個(gè)蛋白質(zhì)分子的核苷酸序列被多個(gè)插入片斷所隔開(kāi)，一個(gè)真核生物結(jié)構(gòu)基因中內(nèi)含子的數(shù)量，往往與這個(gè)基因的大小有關(guān)，例如胰島素是一個(gè)很小的蛋白質(zhì)，它結(jié)構(gòu)基因只有兩個(gè)內(nèi)含子，而有些很大的蛋白質(zhì)，它的結(jié)構(gòu)基因中可以有幾十個(gè)內(nèi)含子。經(jīng)過(guò)復(fù)雜的過(guò)程后，切去內(nèi)元，將有編碼意義的核苷酸片段（外顯子）連接起來(lái)（圖） RNA的編輯是某些RNA，特別是mRNA的一種加工方式，它導(dǎo)致了DNA

9、所編碼的遺傳信息的改變，因?yàn)榻?jīng)過(guò)編輯的mRNA的序列發(fā)生了不同于模版DNA的變化 RNA的編輯可能是充分發(fā)揮生理功能所必須的。載體蛋白mRNA中的C-U,谷氨酸受體蛋白mRNA中的A-I，都屬于脫氨基作用的結(jié)果，分別由胞嘧啶和腺嘌呤脫氨酶所催化。通常情況下，該酶促反應(yīng)的特異性不強(qiáng)，腺嘌呤脫氨酶可以作用于雙鏈RNA區(qū)的任何腺苷酸殘基。但是，RNA的編輯發(fā)生在帶有催化作用的脫氨酶亞基的復(fù)合體中，有附加的RNA結(jié)合區(qū)能幫助識(shí)別所編輯的特異性靶位點(diǎn)。 除了RNA的編輯之外，有些RNA，特別是前體rRNA和tRNA，還可能有特異性化學(xué)修飾如下：三三 RNA的的編輯和化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的生物合成步驟蛋白質(zhì)的生

10、物合成步驟蛋白質(zhì)的合成是一個(gè)比DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄更為復(fù)雜的過(guò)程。它包括： (1)翻譯的起始 核糖體與mRNA結(jié)合并與氨酰-tRNA生成起始復(fù)合物。 (2)肽鏈的延伸 由于核糖體沿mRNA5端向3端移動(dòng)，開(kāi)始了從N端向C端的多肽合成，這是蛋白質(zhì)合成過(guò)程中速度最快的階段。 (3)肽鏈的終止及釋放 核糖體從mRNA上解離，準(zhǔn)備新一輪合成反應(yīng)。 核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所。 mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板。 轉(zhuǎn)移RNA(transfer RNA，tRNA)是模板與氨基酸之間的接合體。第四章第四章 生物信息的傳遞（下）生物信息的傳遞（下） 在合成的各個(gè)階段有許多蛋白質(zhì)、酶和其他生物大分子參與。參與蛋白質(zhì)合成的

11、各種組分約占細(xì)胞干重的35%。在真核生物中有將近300種生物大分子與蛋白質(zhì)的生物合成有關(guān)。 蛋白質(zhì)合成是一個(gè)需能反應(yīng)，要有各種高能化合物的參與。細(xì)胞用來(lái)進(jìn)行合成代謝的總能量的90%消耗在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中。 在真核生物細(xì)胞核內(nèi)合成的mRNA，要運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)，才能翻譯生成蛋白質(zhì)。 所謂翻譯是指將mRNA鏈上的核苷酸從一個(gè)特定的起始位點(diǎn)開(kāi)始，按每3個(gè)核苷酸代表一個(gè)氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過(guò)程。 蛋白質(zhì)合成速度很高。大腸桿菌只需要5s就能合成一條由100個(gè)氨基酸組成的多肽。蛋白質(zhì)合成的生物學(xué)機(jī)制蛋白質(zhì)合成的生物學(xué)機(jī)制蛋白質(zhì)是生物活性物質(zhì)中最重要的大分子組分，生物有機(jī)體的遺傳學(xué)特性要通過(guò)蛋白質(zhì)

12、來(lái)得到表達(dá)。蛋白質(zhì)的生物合成包括氨基酸活化、肽鏈的起始、伸長(zhǎng)、終止以及新合成多肽鏈的折疊和加工。（1）氨基酸的活化：）氨基酸的活化：蛋白質(zhì)合成的起始需要核糖體大小亞基、起始tRNA和幾十個(gè)蛋白因子。在mRNA編碼區(qū)5端形成核糖體-mRNA-起始tRNA復(fù)合物并將甲硫氨酸放入核糖體P位點(diǎn)。（2）翻譯的起始：）翻譯的起始：細(xì)菌中翻譯的起始需要如下7種成分:30S小亞基，模板mRNA，fMet-tRNAfMet，3個(gè)翻譯起始因子(IF-l、IF-2和IF-3)，GTP，50S大亞基，Mg2。翻譯起始又可被分成3步。第一步，30S小亞基與翻譯起始因子IF-l，IF-3的作用下通過(guò)mRNA 的SD序列與

13、之相結(jié)合。第二步，在IF-2和GTP的幫助下，fMet-tRNAfMet進(jìn)入小亞基的P位，tRNA上的反密碼子與mRNA上的起始密碼子配對(duì)。第三步，帶有tRNA、mRNA及3個(gè)翻譯起始因子的小亞基復(fù)合物與50S大亞基結(jié)合；然后，釋放翻譯起始因子。（3）肽鏈的延伸）肽鏈的延伸：當(dāng)?shù)谝粋€(gè)氨基酸與核糖體結(jié)合以后，按照mRNA模板密碼子的排列，氨基酸通過(guò)新生肽鍵的方式被有序地結(jié)合上去。 每加一個(gè)AA是一個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括AA-tRNA與核糖體結(jié)合、肽鍵的生成和移位。（4）肽鏈的終止：）肽鏈的終止：肽鏈在延伸過(guò)程中，當(dāng)終止密碼子出現(xiàn)在核糖體的A位時(shí)，沒(méi)有相應(yīng)的AA-tRNA能與之結(jié)合，而釋放因子能識(shí)別

14、終止密碼子并與之結(jié)合，水解P位上多肽鏈與tRNA之間的酯鍵。新生的肽鏈和tRNA從核糖體上釋放，核糖體解體，蛋白質(zhì)合成結(jié)束。釋放因子RF催化GTP水解促使肽鏈與核糖體解離。（5）蛋白質(zhì)前體的加工：）蛋白質(zhì)前體的加工：新生多肽鏈大多數(shù)是沒(méi)有功能的，必須經(jīng)過(guò)加工修飾才能轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牡鞍踪|(zhì)。 1N端fMet或Met的切除； 2二硫鍵的形成 二硫鍵是蛋白質(zhì)合成后通過(guò)兩個(gè)半胱氨酸的氧化作用生成的。3特定氨基酸的修飾 氨基酸側(cè)鏈的修飾包括磷酸化(如核糖體蛋白質(zhì))、糖基化(如各種糖蛋白)、甲基化(如組蛋白、肌肉蛋白質(zhì))、乙基化(如組蛋白)、羥基化(如膠原蛋白)和竣基化等。蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制 蛋白

15、質(zhì)的合成位點(diǎn)與功能位點(diǎn)常常被細(xì)胞內(nèi)的膜所隔開(kāi)，蛋白質(zhì)需要運(yùn)轉(zhuǎn)。核糖體是真核生物細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所，任何時(shí)候都有許多蛋白質(zhì)被輸送到細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等各個(gè)部分，補(bǔ)充和更新細(xì)胞功能。細(xì)胞各部分都有特定的蛋白質(zhì)組分，蛋白質(zhì)必須準(zhǔn)確無(wú)誤地定向運(yùn)送才能保證生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。 蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)可分為兩大類: 1、翻譯運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制：蛋白質(zhì)的合成和運(yùn)轉(zhuǎn)同時(shí)發(fā)生，則屬于; 2、翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制：蛋白質(zhì)從核糖體上釋放后才發(fā)生運(yùn)轉(zhuǎn)。 分泌蛋白質(zhì)大多是以同步機(jī)制運(yùn)輸?shù)摹?在細(xì)胞器發(fā)育過(guò)程中，由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞器的蛋白質(zhì)大多是以翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制運(yùn)輸?shù)摹?參與生物膜形成的蛋白質(zhì)，依賴于上述兩種不同的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制鑲?cè)肽?nèi)

16、。1 翻譯翻譯-運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制運(yùn)轉(zhuǎn)同步機(jī)制分泌蛋白的生物合成開(kāi)始于核糖體，翻譯到大約50個(gè)氨基酸殘基，信號(hào)肽開(kāi)始從核糖體的大亞基露出，被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的受體識(shí)別并與之結(jié)合。信號(hào)肽過(guò)膜后被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的信號(hào)肽酶水解，新生肽隨之通過(guò)蛋白孔道穿越疏水的雙層磷脂。當(dāng)核糖體移到mRNA的“終止”密碼子，蛋白質(zhì)合成即告完成，翻譯體系解散，膜上的蛋白孔道消失，核糖體重新處于自由狀態(tài)。蛋白質(zhì)定位的信息存在于該蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)中，并且通過(guò)與膜上特殊受體的相互作用得以表達(dá)。信號(hào)肽緊接在起始密碼之后，大部分是疏水氨基酸。信號(hào)肽的長(zhǎng)度在1336個(gè)殘基。 信號(hào)肽的特點(diǎn)：1、1015個(gè)疏水氨基酸；2、N端有帶正電荷的氨基酸；3、C端

17、接近切割點(diǎn)處代數(shù)個(gè)極性氨基酸；4、C端氨基酸側(cè)鏈短。2 翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制 葉綠體和線粒體中有許多蛋白質(zhì)和酶是由細(xì)胞質(zhì)提供的，其中絕大多數(shù)以翻譯后運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞器內(nèi)。2.1 線粒體蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)線粒體蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)特征:1、通過(guò)線粒體膜的蛋白質(zhì)在運(yùn)轉(zhuǎn)之前大多數(shù)以前體形式存在，它由成熟蛋白質(zhì)和位于N端的一段前導(dǎo)肽(leader peptide)共同組成,前導(dǎo)肽約含2080個(gè)氨基酸殘基，當(dāng)前體蛋白過(guò)膜時(shí)，前導(dǎo)肽被多肽酶所水解，釋放成熟蛋白質(zhì)。 2、蛋白質(zhì)通過(guò)線粒體膜運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，首先由外膜上的Tom受體復(fù)合蛋白識(shí)別與分子伴侶相結(jié)合的待運(yùn)轉(zhuǎn)多肽，通過(guò)Tom和Tim組成的膜通道進(jìn)入線粒體內(nèi)腔。蛋

18、白質(zhì)跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)的能量來(lái)自線粒體Hsp70引發(fā)的ATP水解和膜電位差。2.2 前導(dǎo)肽的作用與性質(zhì)前導(dǎo)肽的作用與性質(zhì)擁有前導(dǎo)肽的線粒體蛋白質(zhì)前體能夠跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)進(jìn)人線粒體，在這一過(guò)程中前導(dǎo)肽被水解，前體轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓鞍?，則失去繼續(xù)跨膜能力。因此，前導(dǎo)肽對(duì)線粒體蛋白質(zhì)的識(shí)別和跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)起著關(guān)鍵作用。前導(dǎo)肽具有如下特性:帶正電荷的堿性氨基酸(特別是精氨酸)含量較為豐富，它們分散于不帶電荷的氨基酸序列之間;缺少帶負(fù)電荷的酸性氨基酸；羥基氨基酸(特別是絲氨酸)含量較高;有形成兩親(既有親水又有疏水部分)-螺旋結(jié)構(gòu)的能力3 核定位蛋白的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制核定位蛋白的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制蛋白質(zhì)一般通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核。核糖體蛋白首先在細(xì)胞質(zhì)

19、中合成，運(yùn)轉(zhuǎn)到細(xì)胞核內(nèi)，在核仁中被裝配成40S和60S核糖體亞基，然后運(yùn)轉(zhuǎn)回到細(xì)胞質(zhì)中去合成蛋白質(zhì)合成。RNA、DNA聚合酶、組蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶及大量轉(zhuǎn)錄、復(fù)制調(diào)控因子都必須從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核才能正常發(fā)揮功能。在多細(xì)胞真核生物中，每當(dāng)細(xì)胞發(fā)生分裂時(shí)，核膜被破壞，等到細(xì)胞分裂完成后，核膜被重新建成，分散在細(xì)胞內(nèi)的核蛋白必須被重新運(yùn)入核內(nèi)，因此，為了核蛋白的重復(fù)定位，這些蛋白質(zhì)中的信號(hào)肽被稱為核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)一般都不被切除。NLS可以位于核蛋白的任何部位。蛋白質(zhì)向核內(nèi)運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程蛋白質(zhì)向核內(nèi)運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程蛋白質(zhì)向核內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程需要核運(yùn)轉(zhuǎn)因子

20、、和一個(gè)GTP酶(Ran)。和組成的異源二聚體是核定位蛋白的可溶性受體，與核定位序列相結(jié)合的是亞基。由上述3個(gè)蛋白組成的復(fù)合物?？吭诤丝滋帲揽縍an GTP酶水解GTP提供的能量進(jìn)入細(xì)胞核，和亞基解離，核蛋白與亞基解離，和分別通過(guò)核孔復(fù)合體回到細(xì)胞質(zhì)中，起始新一輪蛋白質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)。4 蛋白質(zhì)的降解蛋白質(zhì)的降解甲基化：在核苷酸或核糖基上加一個(gè)或多個(gè)-CH3 。舉例：鳥(niǎo)嘌呤甲基化產(chǎn)物MTG去氨基化：從堿基上去掉氨基。舉例：鳥(niǎo)嘌呤去氨基后成為次黃嘌呤。硫代：用硫代取代堿基分子上的氧。舉例：4-硫脲嘧啶。堿基的同分異構(gòu)化：堿基環(huán)結(jié)構(gòu)上發(fā)生分子替代。舉例：脲嘧啶同分異構(gòu)化生成假脲嘧啶。二價(jià)鍵的飽和化把一個(gè)二

21、價(jià)鍵飽和。舉例：二氫脲嘧啶。核苷酸的替代：用不常見(jiàn)核苷酸替換常見(jiàn)核苷酸，舉例：荃荃嘧啶DNA甲基化可能存在于所有高等生物中并與基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)，DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。DNA甲基化能引起染色體結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。第六章第六章 原核基因表達(dá)調(diào)控原核基因表達(dá)調(diào)控 基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： 轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控(transcriptional regulation)； mRNA加工成熟水平上的調(diào)控(differential processing of RNA transcrip

22、t)； 翻譯水平上的調(diào)控(differential translation of mRNA). 原核生物中，營(yíng)養(yǎng)狀況(nutritionalstatus)和環(huán)境因素(environmental factor)對(duì)基因表達(dá)起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level)和發(fā)育階段(developmental stage)是基因表達(dá)調(diào)控的最主要手段，營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素的影響力大為下降。 1、真核與原核基因組結(jié)構(gòu)差異真核：真核：真核基因組結(jié)構(gòu)龐大真核基因組結(jié)構(gòu)龐大: 如人類細(xì)胞單倍體基因組就包含如人類細(xì)胞單倍體基因組就包含3109bpDNA，約為大腸桿菌總，約為大

23、腸桿菌總DNA的的800倍倍單順?lè)醋訂雾樂(lè)醋踊虿贿B續(xù)性基因不連續(xù)性:斷裂基因（斷裂基因（interrupted gene）、內(nèi)含子）、內(nèi)含子(intron)、 外顯子外顯子(exon)非編碼區(qū)較多非編碼區(qū)較多 多于編碼序列多于編碼序列(9:1)含有大量重復(fù)序列含有大量重復(fù)序列原核： 基因組很小，大多只有一條染色體 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)煉 存在轉(zhuǎn)錄單元多順?lè)醋?有重疊基因第七章第七章 基因的表達(dá)與調(diào)控基因的表達(dá)與調(diào)控(下下) 真核生物基因調(diào)控可分為兩大真核生物基因調(diào)控可分為兩大類類：第一類是瞬時(shí)調(diào)控或稱可逆性調(diào)控，它相當(dāng)于原核生物細(xì)胞對(duì)環(huán)境條件所做出的反應(yīng)，包括某種底物或激素水平升降時(shí)，或細(xì)胞周期不同階段中

24、酶活性的調(diào)節(jié)；第二類是發(fā)育調(diào)控或稱不可逆調(diào)控，使真核基因調(diào)控的精髓部分，它決定真核細(xì)胞生長(zhǎng)分化發(fā)育的全部進(jìn)程。二、真核細(xì)胞與原核細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及二、真核細(xì)胞與原核細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及DNA的空間結(jié)構(gòu)方面存在以的空間結(jié)構(gòu)方面存在以下幾個(gè)方面的差異下幾個(gè)方面的差異 在真核細(xì)胞中，一條成熟的在真核細(xì)胞中，一條成熟的mRNA鏈只能翻譯出一條多肽鏈，很少存在鏈只能翻譯出一條多肽鏈，很少存在原核生物中常見(jiàn)的多基因操縱子形式。原核生物中常見(jiàn)的多基因操縱子形式。 真核細(xì)胞真核細(xì)胞DNA與組蛋白和大量非組蛋白相結(jié)合，只有一小部分與組蛋白和大量非組蛋白相結(jié)合，只有一小部分DNA是裸是裸露的。露的。 高等真

25、核細(xì)胞高等真核細(xì)胞DNA中很大部分是不轉(zhuǎn)錄的，大部分真核細(xì)胞的基因中間中很大部分是不轉(zhuǎn)錄的，大部分真核細(xì)胞的基因中間還存在不被翻譯的內(nèi)含子。還存在不被翻譯的內(nèi)含子。 真核生物能夠有序地根據(jù)生長(zhǎng)發(fā)育階段的需要進(jìn)行真核生物能夠有序地根據(jù)生長(zhǎng)發(fā)育階段的需要進(jìn)行DNA片段重排，還能片段重排，還能在需要時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)某些基因的拷貝數(shù)。在需要時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)某些基因的拷貝數(shù)。 在真核生物中，基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)相對(duì)較大，它們可能遠(yuǎn)離啟動(dòng)子達(dá)幾在真核生物中，基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)相對(duì)較大，它們可能遠(yuǎn)離啟動(dòng)子達(dá)幾百個(gè)甚至上千個(gè)堿基對(duì)，這些調(diào)節(jié)區(qū)一般通過(guò)改變整個(gè)所控制基因百個(gè)甚至上千個(gè)堿基對(duì)，這些調(diào)節(jié)區(qū)一般通過(guò)改變整個(gè)所控制基

26、因5上游區(qū)上游區(qū)DNA構(gòu)型來(lái)影響構(gòu)型來(lái)影響RNA聚合酶與它的結(jié)合。聚合酶與它的結(jié)合。 在原核生物中，轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)都很小，大都位于啟動(dòng)子上游不遠(yuǎn)處，在原核生物中，轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)都很小，大都位于啟動(dòng)子上游不遠(yuǎn)處，調(diào)控蛋白結(jié)合到調(diào)節(jié)位點(diǎn)上可直接促進(jìn)或抑制調(diào)控蛋白結(jié)合到調(diào)節(jié)位點(diǎn)上可直接促進(jìn)或抑制RNA聚合酶與它的結(jié)合。聚合酶與它的結(jié)合。 真核生物的真核生物的RNA在細(xì)胞核中合成，只有經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)核膜，到達(dá)細(xì)胞質(zhì)后，在細(xì)胞核中合成，只有經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)核膜，到達(dá)細(xì)胞質(zhì)后，才能被翻譯成蛋白質(zhì)，原核生物中不存在這樣嚴(yán)格的空間間隔。才能被翻譯成蛋白質(zhì)，原核生物中不存在這樣嚴(yán)格的空間間隔。 許多真核生物的基因只有經(jīng)過(guò)復(fù)雜

27、的成熟和剪接過(guò)程，才能順利地翻譯許多真核生物的基因只有經(jīng)過(guò)復(fù)雜的成熟和剪接過(guò)程，才能順利地翻譯成蛋白質(zhì)成蛋白質(zhì)。增強(qiáng)子、特點(diǎn)、作用原理增強(qiáng)子、特點(diǎn)、作用原理增強(qiáng)子是指能使與它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加的DNA序列。增強(qiáng)子特點(diǎn)： 增強(qiáng)效應(yīng)十分明顯，一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻率增加10-200倍 增強(qiáng)效應(yīng)與其位置和取向無(wú)關(guān)，不論增強(qiáng)子以什么方向排列（53或35），甚至和靶基因相距3kb，或在靶基因下游，均表現(xiàn)出增強(qiáng)效應(yīng)；大多為重復(fù)序列，一般長(zhǎng)約50bp，適合與某些蛋白因子結(jié)合。其內(nèi)部常含有一個(gè)核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），該序列是產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)時(shí)所必需的； 增強(qiáng)效應(yīng)有嚴(yán)密的組織和細(xì)胞特異性

28、，說(shuō)明增強(qiáng)子只有與特定的蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子）相互作用才能發(fā)揮其功能； 沒(méi)有基因?qū)Ｒ恍?，可以在不同的基因組合上表現(xiàn)增強(qiáng)效應(yīng)； 許多增強(qiáng)子還受外部信號(hào)的調(diào)控，如金屬硫蛋白的基因啟動(dòng)區(qū)上游所帶的增強(qiáng)子，就可以對(duì)環(huán)境中的鋅、鎘濃度做出反應(yīng)。作用原理：增強(qiáng)子可能有以下三種作用機(jī)制：作用原理：增強(qiáng)子可能有以下三種作用機(jī)制：v影響模版附近的影響模版附近的DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致雙螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNADNA雙螺旋彎折或在反式因子的雙螺旋彎折或在反式因子的參與下，以蛋白質(zhì)之間的相互作用為媒介形成增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間參與下，以蛋白質(zhì)之間的相互作用為媒介形成增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間“成環(huán)成環(huán)”連接，活化基因轉(zhuǎn)錄；連接，活

29、化基因轉(zhuǎn)錄；v將模版固定在細(xì)胞核內(nèi)特定位置，如連接在核基質(zhì)上，有利于將模版固定在細(xì)胞核內(nèi)特定位置，如連接在核基質(zhì)上，有利于DNADNA拓拓?fù)洚悩?gòu)酶改變撲異構(gòu)酶改變DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的張力，促進(jìn)雙螺旋結(jié)構(gòu)的張力，促進(jìn)RNARNA聚合酶聚合酶在在DNADNA鏈上的鏈上的結(jié)合和滑動(dòng)；結(jié)合和滑動(dòng)；v增強(qiáng)子區(qū)可作為反式作用因子或增強(qiáng)子區(qū)可作為反式作用因子或RNARNA聚合酶聚合酶進(jìn)入染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的進(jìn)入染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的“入入口口”7.4 真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要模式真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要模式細(xì)胞除通過(guò)細(xì)胞除通過(guò)DNA復(fù)制和隨后的細(xì)胞分裂將本身所固有的遺傳信息由親復(fù)制和隨后的細(xì)胞分裂將本身所固有的遺傳信息由親代

30、傳至子代，它們還不斷地代傳至子代，它們還不斷地“感知感知”環(huán)境的各種變化，并對(duì)其作出特環(huán)境的各種變化，并對(duì)其作出特有的應(yīng)答。細(xì)胞應(yīng)答可分為三個(gè)階段：有的應(yīng)答。細(xì)胞應(yīng)答可分為三個(gè)階段：v外界信息的感知，既由細(xì)胞膜到細(xì)胞核內(nèi)的信息傳遞；外界信息的感知，既由細(xì)胞膜到細(xì)胞核內(nèi)的信息傳遞；v染色質(zhì)水平上的基因活性調(diào)控；染色質(zhì)水平上的基因活性調(diào)控；特定基因的表達(dá)。特定基因的表達(dá)。4.1 蛋白質(zhì)磷酸化、信號(hào)傳導(dǎo)及基因的表達(dá)蛋白質(zhì)磷酸化、信號(hào)傳導(dǎo)及基因的表達(dá)蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化過(guò)程是生物體內(nèi)普遍存在的信息傳導(dǎo)方式，蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化過(guò)程是生物體內(nèi)普遍存在的信息傳導(dǎo)方式，幾乎涉及所有的生理及病理過(guò)程。幾乎

31、涉及所有的生理及病理過(guò)程。細(xì)胞表面受體與配體分子的高親和力特異性結(jié)合，能誘導(dǎo)蛋白構(gòu)想細(xì)胞表面受體與配體分子的高親和力特異性結(jié)合，能誘導(dǎo)蛋白構(gòu)想變化，使細(xì)胞外信號(hào)順利通過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，或是受體發(fā)生寡聚變化，使細(xì)胞外信號(hào)順利通過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，或是受體發(fā)生寡聚化而被激活。一般情況下，受體分子活化細(xì)胞功能的途徑有兩條：化而被激活。一般情況下，受體分子活化細(xì)胞功能的途徑有兩條：一是受體本身或受體結(jié)合蛋白具有內(nèi)源酪氨酸激酶活性，胞內(nèi)信號(hào)一是受體本身或受體結(jié)合蛋白具有內(nèi)源酪氨酸激酶活性，胞內(nèi)信號(hào)通過(guò)酪氨酸激酶途徑得到傳遞；二是配體與細(xì)胞表面受體結(jié)合，通通過(guò)酪氨酸激酶途徑得到傳遞；二是配體與細(xì)胞表面受體結(jié)

32、合，通過(guò)過(guò)G蛋白介導(dǎo)的效應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生介質(zhì)，活化絲氨酸蛋白介導(dǎo)的效應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生介質(zhì)，活化絲氨酸/蘇氨酸或酪氨酸激蘇氨酸或酪氨酸激酶，從而傳遞信號(hào)。酶，從而傳遞信號(hào)。4.2 激素及其影響激素及其影響 許多類固醇激素（如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮激素和雄激素）許多類固醇激素（如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮激素和雄激素）以及一般代謝性激素的調(diào)控都是通過(guò)啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)的。靶細(xì)以及一般代謝性激素的調(diào)控都是通過(guò)啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)的。靶細(xì)胞具有專一的細(xì)胞受體，可與激素形成復(fù)合物，導(dǎo)致三維結(jié)構(gòu)甚至胞具有專一的細(xì)胞受體，可與激素形成復(fù)合物，導(dǎo)致三維結(jié)構(gòu)甚至化學(xué)性質(zhì)的變化。經(jīng)修飾的受體與激素復(fù)合物通過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞

33、核化學(xué)性質(zhì)的變化。經(jīng)修飾的受體與激素復(fù)合物通過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并與染色質(zhì)的特定區(qū)域相結(jié)合，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的起始或關(guān)閉內(nèi)，并與染色質(zhì)的特定區(qū)域相結(jié)合，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的起始或關(guān)閉許多類固醇激素（如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮激素和雄激素）以許多類固醇激素（如雌激素、孕激素、醛固酮、糖皮激素和雄激素）以及一般代謝性激素的調(diào)控都是通過(guò)啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)的。三種假及一般代謝性激素的調(diào)控都是通過(guò)啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)的。三種假說(shuō)：受體流動(dòng)假說(shuō)、中介物假說(shuō)、鄰位互調(diào)假說(shuō)。說(shuō)：受體流動(dòng)假說(shuō)、中介物假說(shuō)、鄰位互調(diào)假說(shuō)。熱激蛋白誘導(dǎo)的基因表達(dá)熱激蛋白誘導(dǎo)的基因表達(dá)1 基因工程與基因治療的差別基因工程與基因治療的差別基因

34、工程是將具有應(yīng)用價(jià)值的基因，即“目的基因”，裝配在具有表達(dá)元件的特定載體中，導(dǎo)入相應(yīng)的宿主如細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，在體外進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)分離、純化后獲得其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物。基因治療是將具有治療價(jià)值的基因，即“治療基因”裝配于帶有在人體細(xì)胞中表達(dá)所必備元件的載體中，導(dǎo)入人體細(xì)胞，直接進(jìn)行表達(dá)?？纱蟠蠼档椭委煶杀?。因?yàn)榛蛑委煵恍枰蚬こ讨泻馁Y最大的器材與材料費(fèi)用，顯著降低了工業(yè)化的成本。基因工程的“目的基因”主要是可分泌蛋白，如生長(zhǎng)因子、多肽類激素、細(xì)胞因子、可溶性受體等，對(duì)于非分泌性蛋白質(zhì)，由于它們往往不能有效地進(jìn)入細(xì)胞而不能被應(yīng)用于基因工程。但基因治療不受上述限制。幾乎所有的基因，只要它具

35、有治療作用，理論上均可應(yīng)用于基因治療。因此，基因治療具有更大的潛力?；蚬こ痰牟僮魅吭隗w外完成，基因治療則必須將基因直接導(dǎo)入人體細(xì)胞。這不僅在技術(shù)上具有很大的難度，而且在安全性與有效性方面提出了更為苛刻的要求?；蚬こ桃呀?jīng)有三四十年的歷史，技術(shù)已比較成熟；基因治療僅有十多年的歷史，不少技術(shù)還不夠成熟。所以，它遇到的風(fēng)險(xiǎn)更大。2 2 基因治療的概念和策略基因治療的概念和策略u(píng) 基因治療(gene therapy)就是用正?；蛞吧?wild type)基因矯正或置換致病基因的一種治療方法。在這種治療方法中，目的基因被導(dǎo)入到靶細(xì)胞（target cells）內(nèi)，它們或與宿主細(xì)胞（host cel

36、l）染色體整合成為宿主遺傳物質(zhì)的一部分，或不與染色體整合而位于染色體外，但都能在細(xì)胞中得到表達(dá)，起到治療疾病的作用。 u 目前基因治療的概念了較大的擴(kuò)展，凡是采用分子生物學(xué)的方法和原理，在核酸水平上開(kāi)展的疾病治療方法都可稱為基因治療。隨著對(duì)疾病本質(zhì)的深入了解和新的分子生物學(xué)方法的不斷涌現(xiàn)，基因治療方法有了較大的發(fā)展。根據(jù)所采用的方法不同，基因治療的策略大致可分為以下幾種基因治療的策略大致可分為以下幾種：基因置換（gene replacement）：基因置換就是用正常的基因原位替換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)。這種治療方法最為理想，但目前由于技術(shù)原因尚難達(dá)到。 基因修復(fù)

37、（gene correction）：基因修復(fù)是指將致病基因的突變堿基序列糾正，而正常部分予以保留。這種基因治療方式最后也能使致病基因得到完全恢復(fù)，操作上要求高，實(shí)踐中有一定難度。 基因修飾（gene augmentation）又稱基因增補(bǔ)，將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物能修飾缺陷細(xì)胞的功能或使原有的某些功能得以加強(qiáng)。在這種治療方法中，缺陷基因仍然存在于細(xì)胞內(nèi)，目前基因治療多采用這種方式。如將組織型纖溶酶原激活劑的基因?qū)胙軆?nèi)皮細(xì)胞并得以表達(dá)后，防止經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)誘發(fā)的血檢形成。u 基因失活（gene inactivation）：利用反義技術(shù)能特異地封閉基因表達(dá)特性，

38、抑制一些有害基因的表達(dá)，已達(dá)到治療疾病的目的。如利用反義RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化。用此技術(shù)還可封閉腫瘤細(xì)胞的耐藥基因的表達(dá)，增加化療效果。 u 免疫調(diào)節(jié)（immune adjustment）：將抗體、抗原或細(xì)胞因子的基因?qū)爰踩梭w內(nèi)，改變病人免疫狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。如將白細(xì)胞介素-2導(dǎo)入腫瘤病人體內(nèi)，提高病人IL-2的水平，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性，達(dá)到防治腫瘤復(fù)發(fā)的目的。 u 其它：增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療或化療的敏感性：采用給予前體藥物的方法減少化療藥物對(duì)正常細(xì)胞的損用力。如向腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入單純皰疹病毒胸苷激酶基因，然后給

39、予病人無(wú)毒性GCV藥物，由于只有含HSV-TK基因的細(xì)胞才能將CGV轉(zhuǎn)化成有毒的藥物。因而腫瘤細(xì)胞被殺死，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響。3 3 基因治療的基本程序基因治療的基本程序（1）目的基因的選擇和制備： 可用于基因治療的基因需滿足以下幾點(diǎn)：在體內(nèi)僅有少量的表達(dá)就可顯著改善癥狀；該基因的過(guò)高表達(dá)不會(huì)對(duì)機(jī)體造成危害。 在確定欲選目的基因后，就要制備目的基因。正向表達(dá)的基因可以是cDNA，也可是基因組DNA片段?？捎脗鹘y(tǒng)的方法獲取，也可采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等新技術(shù)進(jìn)行體外擴(kuò)增。部分反義基因也可采用此法獲得，但多數(shù)情況下采用人工合成的方式制備 （2）基因的轉(zhuǎn)運(yùn) 目前已有多種基因轉(zhuǎn)運(yùn)的方式，其基本原

40、則是將外源基因運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。已使用的有病毒載體和非病毒載體兩大類。 病毒載體：病毒具有一些獨(dú)特的性質(zhì)如多數(shù)病毒可感染特異的細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)不易降解；RNA病毒能整合到染色體以及基因水平較高等。因此病毒載體是良好的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。目前已被用作載體的病毒有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)的病毒、皰疹病毒和肝炎病毒等。逆轉(zhuǎn)錄病毒用作載體時(shí)需進(jìn)行幾步改造： A：將天然的野生型RNA前病毒轉(zhuǎn)變成DNA載體，并插入欲轉(zhuǎn)移的相關(guān)外源基因。其基本原則是用標(biāo)記基因和外源基因替代病毒的編碼基因。B：制備輔助細(xì)胞為載體DNA提供其喪失的功能 C：將載體DNA導(dǎo)入輔助以產(chǎn)生病毒載體。 D：病毒載體感染靶細(xì)胞，外源基因在細(xì)胞內(nèi)得以

41、表達(dá)。（3）靶細(xì)胞的選擇 理論上講，無(wú)論何種細(xì)胞均具有接受外源DNA的能力，目前基因治療中禁止使用生殖細(xì)胞作為靶細(xì)胞，而只能使用體細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)基因的體細(xì)胞必須取材方便，含量豐富，容易培養(yǎng)，壽命較長(zhǎng)?？蛇x擇的細(xì)胞有淋巴細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等。在實(shí)際上應(yīng)用中應(yīng)具體根據(jù)目的條件選擇。 （4）細(xì)胞轉(zhuǎn)染（tansfection） 將目的基因?qū)氚屑?xì)胞的方法很多，大致可分為物理學(xué)方法、化學(xué)方法、融合法和病毒感染法四類。病毒法已在本節(jié)的“基因的轉(zhuǎn)運(yùn)”中有基因介紹。目前較多使用的是脂質(zhì)體法。 （5）外源基因的表達(dá)及檢測(cè) 在篩選出轉(zhuǎn)化分子后還需要鑒

42、定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中外源基因的表達(dá)狀況。其中包括對(duì)目的基因和標(biāo)記基因表達(dá)的鑒定。常用方法有原位雜交，Northrn雜交，NRA打點(diǎn)雜交，免疫組織化學(xué)染色等，前幾項(xiàng)是檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA，后者則是檢測(cè)外源基因翻譯出的蛋白質(zhì)。流式細(xì)胞儀是一種較為客觀準(zhǔn)確的儀器，可定量分析外源基因的表達(dá)狀況。 4 基因治療的兩大途徑基因治療的兩大途徑基因治療的兩條主要途徑：即 ex vivo 與 in vivo 方式 ex vivo 途徑 這主要是將含外源基因的載體在體外導(dǎo)入人體自身或異體細(xì)胞，這種細(xì)胞被稱為“基因工程化的細(xì)胞”，經(jīng)體外細(xì)胞擴(kuò)增后輸回人體。這種方法易于操作，不易產(chǎn)生副作用，安全性好。但是，這種方法不易形成規(guī)模，而且必須有固定的臨床基地。In vivo 這是將外源基因裝配于特定的真核細(xì)胞表達(dá)載體上，直接導(dǎo)入人體內(nèi)。這種方式非常有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。但是，對(duì)這種方式導(dǎo)入的治療基因以及其載體必須證明其安全性，而且導(dǎo)入人體之后必須能進(jìn)入靶細(xì)胞，有效的表達(dá)并達(dá)到治療的目的。因此，在技術(shù)上要求很高，其難度明顯高于上一種模式。用于基因治療的病毒載體應(yīng)具備以下基本條件：用于基因治療的病毒載體應(yīng)具備以下基本條件：攜帶外源基因并能裝配成病毒顆粒；介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá)