急性期腦梗死與血清NGF的關(guān)系研究臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)

1、中文摘要急性期腦梗死與血清NGF的關(guān)系研究背景： 隨著國(guó)民生活質(zhì)量的提高以及生活節(jié)奏地加快，腦血管病在我國(guó)已升至疾病死亡原因的首位。近年來(lái)國(guó)內(nèi)腦梗死（cerebral infarction）的發(fā)病率高居不下，其病死率和致殘率也呈現(xiàn)連續(xù)攀升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類健康。其中高致殘率不但給病人身體和心理造成雙重壓力，而且使家庭背負(fù)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)變得沉重?，F(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)使腦梗死的防治有了明顯進(jìn)步，但最大限度地降低致殘率和死亡率，仍是臨床一線醫(yī)師的關(guān)注點(diǎn)。神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）可以調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)階段，其具有的促進(jìn)損傷神經(jīng)修復(fù)的生物學(xué)特性，使其具有了重

2、要的臨床意義。目前，眾多國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)對(duì)NGF進(jìn)行了深入地研究，其對(duì)于腦梗死的臨床價(jià)值也越來(lái)越受到關(guān)注，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于急性期腦梗死與血清NGF的關(guān)系研究甚少。目的：本研究通過(guò)檢測(cè)急性期腦梗死患者血清NGF含量，探討血清NGF與急性期腦梗死的關(guān)系。方法：研究組為發(fā)病24小時(shí)內(nèi)的急性期腦梗死患者，共90例，其中男性47人，女性43人，年齡在4378歲，平均年齡為62.19±6.34歲；對(duì)照組20人均為門診健康體檢者，其中男性11人，女性9人，年齡在4475歲，平均年齡在63.57±6.22歲。根據(jù)郭玉璞腦梗死病灶大小分型原則，將急性期腦梗死研究組分為小梗死灶組（病灶最大直徑15m

3、m）、中梗死灶組（15mm病灶最大直徑50mm）及大梗死灶組（病灶最大直徑50mm）。腦梗死組研究對(duì)象均于發(fā)病后1d、7d和14d清晨空腹采取靜脈血5ml，標(biāo)本置于-70冰箱中保存，后采用酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA）法測(cè)定血清NGF含量水平。用相同方法檢測(cè)對(duì)照組20例健康體檢者的血清NGF含量。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。結(jié)果：1.急性期腦梗死患者發(fā)病第1d、7d和14d血清NGF含量（ng/L）分別是16.04±1.33、12.26±

4、1.90、9.70±2.73，對(duì)照組為5.43±1.27，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示，急性期腦梗死發(fā)病第1d、7d和14d血清NGF含量均明顯高于對(duì)照組（P0.01）。同時(shí)，腦梗死組內(nèi)各發(fā)病時(shí)間點(diǎn)血清NGF含量均有明顯差異（P0.01）。2.急性期腦梗死不同病灶大小及不同發(fā)病時(shí)間患者血清NGF含量的變化，大梗死灶組患者發(fā)病第1d、7d和14d血清NGF含量（ng/L）分別為18.31±0.46、14.94±0.62、13.71±0.63；中梗死灶組患者發(fā)病第1d、7d和14d血清NGF含量（ng/L）分別為16.20±0.42、13.08&

5、#177;0.73、10.76±1.11；小梗死灶組患者發(fā)病第1d、7d和14d血清NGF含量（ng/L）分別為14.96±0.39、10.54±0.81、7.32±1.06。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示，不同發(fā)病時(shí)間點(diǎn)內(nèi)的大中小梗死灶三組患者血清NGF含量均有顯著差異（P0.01）。結(jié)論：1.急性期腦梗死患者血清NGF含量有先上升后下降的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。2.急性期腦梗死患者血清NGF含量與腦梗死灶大小呈正相關(guān)。3.檢測(cè)腦梗死患者急性期血清NGF水平對(duì)于評(píng)估病情嚴(yán)重程度可能有重要的參考價(jià)值。關(guān)鍵詞： 神經(jīng)生長(zhǎng)因子，急性期腦梗死，酶聯(lián)免疫吸附法。第1章 引言腦梗死

6、是指由于多種原因所致腦血液循環(huán)障礙，進(jìn)而引起相應(yīng)部位腦組織缺血、缺氧，最終發(fā)生組織壞死、軟化形成梗死的疾病，是臨床最常見(jiàn)的腦血管疾病，具有高病死率、高致殘率和高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)。近年來(lái)，由于醫(yī)學(xué)影像學(xué)的飛速發(fā)展，CT和MRI的普及讓罹患腦梗死的患者能夠及早及時(shí)地被檢出，這些在早期就被發(fā)現(xiàn)的腦梗死患者使得腦梗死的發(fā)病率大幅升高，患者不但要承受沉重的醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還要經(jīng)受疾病帶來(lái)的心理打擊，所以做好腦梗死預(yù)防和治療的工作就變得尤為重要，對(duì)腦梗死的進(jìn)一步探究和尋求更優(yōu)化的防治措施刻不容緩。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（neurotrophin, NT）是神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)與存活所必需的一類蛋白質(zhì)分子，NGF隸屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

7、家族，是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。NGF可以調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，維持成熟神經(jīng)細(xì)胞生存以及對(duì)損傷神經(jīng)的修復(fù)，它的這些特性使得眾多國(guó)內(nèi)外專家十分重視NGF在腦梗死領(lǐng)域的研究。隨著NGF的臨床價(jià)值不斷被挖掘，NGF有望成為診治腦梗死的新切入點(diǎn)，提高內(nèi)源性NGF的表達(dá)以及利用外源性NGF可能成為診治腦梗死、降低致殘率和死亡率的一種全新路徑。目前，眾多研究機(jī)構(gòu)對(duì)NGF進(jìn)行了研究與開(kāi)發(fā)，其重點(diǎn)多為外源性NGF，對(duì)于內(nèi)源性NGF的研究雖然也引起了許多專家學(xué)者的關(guān)注，但是與腦梗死相關(guān)方面的臨床研究甚少。本研究通過(guò)檢測(cè)腦梗死急性期患者血清NGF含量的變化，探討其與急性期腦梗死的關(guān)系。第1章 關(guān)于急性期腦

8、梗死與血清NGF關(guān)系的綜述2.1 NGF的生物學(xué)基礎(chǔ)2.1.1 NGF的基本結(jié)構(gòu)及分布NGF是由意大利科學(xué)家Rita Levi-Montalcini于1953年在小鼠肉瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的首個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子1，它屬于可溶性堿性蛋白質(zhì)，沉降系數(shù)為7S，基因編碼位于1號(hào)染色體（1P21-P22.1），遺傳信息經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯后形成、三個(gè)亞單位，在彼此非共價(jià)鍵的作用力下，按照222的形式連接成為多聚復(fù)合體，擁有140×10³k Da高相對(duì)分子質(zhì)量。其中，亞單位承擔(dān)了NGF絕大多數(shù)的活性功能，此亞單位擁有236個(gè)氨基酸，是由非共價(jià)鍵所維系的雙鏈多肽，生物學(xué)功能相關(guān)區(qū)域在進(jìn)化中高度保守。NGF內(nèi)

9、有6個(gè)特殊的半胱氨酸殘基，它們共組成3對(duì)二硫鍵，對(duì)NGF的生物活性起著至關(guān)重要的作用，二硫鍵一旦被水解，NGF也將失去生物活性2-3。NGF還具有高度同源性，特別是在分子生物學(xué)活性方面無(wú)明顯種屬特異性，從雄性小鼠頜下腺中分離純化出來(lái)的mNGF與人類NGF的同源性已達(dá)九成以上且作用于靶細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)無(wú)明顯差異，這一特點(diǎn)使得mNGF被廣泛地應(yīng)用于科學(xué)研究和臨床治療中4。在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，NGF主要在中樞膽堿能邁內(nèi)特基底核的投射區(qū)產(chǎn)生，所以膽堿能神經(jīng)細(xì)胞支配區(qū)是其主要分布區(qū)，大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)膽堿能神經(jīng)元含量非常豐富，所以腦內(nèi)的NGF在這兩個(gè)部位分布最高。NGF在腦內(nèi)其他部位的分布由高到低依次為：嗅球、

10、基底前腦、小腦和紋狀體，在腦內(nèi)的不均衡分布也體現(xiàn)了不同腦組織內(nèi)膽堿能神經(jīng)細(xì)胞的含量差異5。此外，NGF在體內(nèi)其他部位也有廣泛分布：如唾液腺、前列腺和胎盤組織等6。2.1.2 NGF的受體NGF的受體主要有兩種，分別為酪氨酸激酶A（tyrosine kinase receptor A，Trk A）和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素p75（neurotrophin receptor p75）7。前者親和力強(qiáng)，能夠與NGF特異性結(jié)合，引發(fā)相關(guān)蛋白酶活化，啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)的一系列通路，最終使NGF的生物學(xué)效應(yīng)得以表達(dá)，因此Trk A是NGF的功能性受體，遍布于NGF效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜上8。p75是富含半胱氨酸的一類跨膜糖蛋白，其

11、分布范圍非常廣，彌漫于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也有分布。它的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Trk A，與NGF結(jié)合后也無(wú)法直接產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，但它擁有許多無(wú)可替代的功能9：（1）能夠準(zhǔn)確辨識(shí)NGF家族，并與家族成員結(jié)合；（2）可對(duì)酪氨酸激酶的活性加以調(diào)控，增強(qiáng)Trk A與NGF的結(jié)合能力，使NGF的生物學(xué)效應(yīng)充分表達(dá)；（3）逆向輸送NGF，特別在修復(fù)病損的周圍神經(jīng)中表現(xiàn)明顯；（4）加劇神經(jīng)鞘磷脂的水解速率，引導(dǎo)細(xì)胞凋亡；（5）激發(fā)鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白耦聯(lián)機(jī)制，保證生物信號(hào)穩(wěn)定傳遞。2.1.3 NGF的信號(hào)傳導(dǎo)通路 NGF擁有Trk A和p75兩種受體，因?yàn)閮烧咴诟鞣矫嬗兄@著差異，所以它們各自介導(dǎo)著不同的信號(hào)通

12、路7。（1）Trk A一般介導(dǎo)正性信號(hào)，如促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)和分化等。Trk A與NGF結(jié)合后在膜上生成二聚體，引發(fā)Trk A 的多個(gè)酪氨酸殘基自動(dòng)磷酸化，進(jìn)而激活下游信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，依照酪氨酸殘基被激活的順序，Trk A介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路依賴于以下3種途徑的協(xié)同運(yùn)作：絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑：Trk A的殘基Y490首先被磷酸化，進(jìn)一步激活MAPK激酶，使MAPK通路開(kāi)放，MAPK開(kāi)啟B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)。磷酯酶C-（phosp

13、holipase C-，PLC-）途徑：Trk A殘基Y785磷酸化后激活PLC-，經(jīng)過(guò)一系列生化反應(yīng)最終激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK），產(chǎn)生增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞存活力和再生力的生物學(xué)效應(yīng)。磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）途徑：Trk A殘基Y751磷酸化后與PI3K相連，PI3K能激活PKB并且可以增強(qiáng)Bcl-2轉(zhuǎn)錄，PKB和Bcl-2共同增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的存活能力。 （

14、2）p75主要傳導(dǎo)誘發(fā)細(xì)胞凋亡的負(fù)性信號(hào)，但也能介導(dǎo)少量的促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生存的正性信號(hào)。p75與NGF結(jié)合后傳導(dǎo)信號(hào)的通路包括：核轉(zhuǎn)錄因子-B（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-B）途徑：邢雪松等人10在大鼠腦缺血再灌注模型的研究中發(fā)現(xiàn)NF-B調(diào)控的基因編碼產(chǎn)物具有抗氧化和增強(qiáng)細(xì)胞防御力的作用。激活NF-B能發(fā)揮其抵抗細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，同時(shí)可提高Trk A的活性。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）-p53-BAX途徑：此通路主要能提高細(xì)胞凋亡的速度，JNK

15、、p53、BAX依次被啟動(dòng)，其中p53的含量與細(xì)胞凋亡有直接聯(lián)系11。神經(jīng)酰胺途徑：此通路介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)具有雙重效果12，這一特性與蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)跟神經(jīng)酰胺相作用的濃度有關(guān)。低濃度的神經(jīng)酰胺可以激活PKC，能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育；而高濃度的神經(jīng)酰胺則降低PKC的活性，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞快速死亡。如前所述，Trk A介導(dǎo)正性信號(hào)，p75主要傳遞負(fù)性信號(hào)，但在絕大多數(shù)的細(xì)胞背景和環(huán)境下Trk A能有效地抑制p75誘導(dǎo)負(fù)性信號(hào)13，最終使NGF的生物學(xué)總效應(yīng)為促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和增強(qiáng)病損神經(jīng)的修復(fù)。2.2 NGF的生物學(xué)效應(yīng)（1）NGF在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的初期，

16、能通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化、刺激神經(jīng)纖維的定向生長(zhǎng)、調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的合成、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等途徑，擁有調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的存活數(shù)量，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化和發(fā)育的生物學(xué)效應(yīng)14、15。（2）NGF還能增強(qiáng)多種成熟神經(jīng)細(xì)胞的生存力，促進(jìn)成熟細(xì)胞的軸索與其他細(xì)胞間的聯(lián)系，因此具備了維持神經(jīng)系統(tǒng)成熟階段的生物學(xué)效應(yīng)16。（3）當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)遭遇損傷時(shí)，NGF的表達(dá)迅速升高，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周圍的環(huán)境來(lái)保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞。NGF促進(jìn)軸突定向再生17，使之能與靶細(xì)胞形成功能連接，同時(shí)增強(qiáng)髓鞘修復(fù)力18，最終使損傷的神經(jīng)細(xì)胞完成修復(fù)，達(dá)到改善神經(jīng)功能缺損癥狀的目的。NGF保護(hù)和修復(fù)病損神經(jīng)系統(tǒng)的生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)于中樞神經(jīng)和周

17、圍神經(jīng)均奏效。（4）另外，通過(guò)近年來(lái)對(duì)NGF的深入研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)非神經(jīng)系統(tǒng)也有一定作用，如調(diào)控免疫系統(tǒng)功能、促進(jìn)骨折愈合、影響炎性反應(yīng)等19。2.3 NGF的藥物學(xué)進(jìn)展 NGF因其獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，可能成為許多疾病的潛在治療藥物，如視神經(jīng)損傷、腦梗死、阿爾茨海默病、顱腦創(chuàng)傷、脊髓損傷和周圍神經(jīng)病等。雄性小鼠頜下腺提取的mNGF具有安全、有效和毒副作用低的特點(diǎn)，是最常用的能夠滿足科學(xué)研究和臨床應(yīng)用條件的NGF，注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（恩經(jīng)復(fù)）已在國(guó)內(nèi)上市，藥代動(dòng)力學(xué)顯示大鼠肌注后達(dá)峰時(shí)間越為4小時(shí)，24小時(shí)內(nèi)吸收率高于80%，主要從腎臟排泄，極少部分隨糞便排出。注射用鼠神經(jīng)生

18、長(zhǎng)因子具有治療正己烷中毒性周圍神經(jīng)病和促進(jìn)神經(jīng)損傷恢復(fù)等療效，給許多患者帶來(lái)了福音。現(xiàn)在臨床應(yīng)用的NGF多數(shù)經(jīng)肌肉注射給藥，絕大多數(shù)用來(lái)治療周圍神經(jīng)的病變，NGF相對(duì)分子質(zhì)量較大，自然狀態(tài)下難以透過(guò)血腦屏障（blood-brain barrier，BBB），對(duì)于大腦內(nèi)部疾患的治療效果甚微。BBB是血液與腦組織間的一種特殊屏障，由血管內(nèi)皮、基膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞終足構(gòu)成，能夠選擇性地限制部分物質(zhì)出入腦組織，對(duì)大腦具有一定的保護(hù)性。近年來(lái)，許多研究發(fā)現(xiàn)BBB在某些條件下能夠增加通透性：李兵等人發(fā)現(xiàn)顱腦損傷后BBB能夠一定程度上開(kāi)放，開(kāi)放的通透度與損傷程度呈正相關(guān)，NGF能隨著B(niǎo)BB的開(kāi)放而進(jìn)入腦組織發(fā)

19、揮作用20。周文莉、嚴(yán)超英研究組通過(guò)對(duì)大鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦組織缺氧能使BBB的通透性增加，利于外源NGF通過(guò)靜脈抵達(dá)腦組織發(fā)揮作用21。劉曾旭等人深入研究了血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接，發(fā)現(xiàn)若緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能因外傷、缺血、缺氧、感染、免疫及理化因素發(fā)生改變，會(huì)不同程度地造成BBB通透性升高22?；谝陨隙囗?xiàng)研究，可以推測(cè)NGF在腦缺血時(shí)能夠透過(guò)BBB的機(jī)制可能為：（1）BBB的結(jié)構(gòu)被破壞：血管內(nèi)皮和星形膠質(zhì)細(xì)胞終足是BBB的兩大組成結(jié)構(gòu)。血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接是BBB具有選擇性的基礎(chǔ)，當(dāng)腦缺血發(fā)生時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接變得寬大疏松，導(dǎo)致BBB通透性增加22。星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)維持BBB的功能

20、具有關(guān)鍵作用，腦缺血會(huì)使星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突變得腫大，引起血腦屏障通透性增高23。（2）特殊轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的開(kāi)啟：腦缺血能夠啟動(dòng)不飽和的跨膜擴(kuò)散和需特異轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的飽和運(yùn)輸24，使得NGF等大分子物質(zhì)能輕松通過(guò)BBB。腦缺血發(fā)生后，NGF從腦組織經(jīng)通透性增高的BBB進(jìn)入血液，使得NGF能夠在外周血中被檢測(cè)，因此缺血性腦血管疾病與血清NGF含量有密切聯(lián)系。盡管在一些條件下BBB會(huì)因通透性提高而開(kāi)放，NGF能自由進(jìn)出BBB，但是難以在腦組織中維持理想的濃度，使其發(fā)揮穩(wěn)定的生物學(xué)效應(yīng)。針對(duì)NGF在臨床應(yīng)用中面臨的困境，目前許多國(guó)內(nèi)外專家對(duì)NGF進(jìn)行了深入研究，提出了重組細(xì)胞注入法、置管腦外注藥法、特制眼液滴入

21、法、神經(jīng)通路給藥法、聚合物植入法、化學(xué)連接法、生物素-抗生物素蛋白技術(shù)等新的給藥途徑25-27；Ding Y等28通過(guò)大腦中動(dòng)脈短暫缺血模型研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)能提高顱內(nèi)NGF表達(dá)；黃國(guó)棟團(tuán)隊(duì)將NGF封存于納米柔性脂質(zhì)體內(nèi)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明載NGF納米柔性脂質(zhì)體能夠有效地促進(jìn)其突破BBB29，以上研究有望拓寬NGF的臨床應(yīng)用領(lǐng)域。2.4 缺血腦組織NGF的含量變化在正常生理狀態(tài)下，腦組織中NGF的含量較低，但對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、成熟和損傷后修復(fù)的意義重大。劉鵬研究組30發(fā)現(xiàn)使斯?jié)娎鄹?#183;多雷（Sprague-Dawley，SD）大鼠局灶性腦缺血后，皮層缺血半暗帶NGF陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目高于假手術(shù)

22、組，提示腦組織缺血能上調(diào)缺血半暗帶NGF表達(dá)水平，并推測(cè)腦組織在缺血情況下其內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的開(kāi)啟與腦內(nèi)NGF表達(dá)上調(diào)有關(guān)。Lindvall O等國(guó)外專家31發(fā)現(xiàn)腦缺血2小時(shí)后即出現(xiàn)NGF mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，表達(dá)程度取決于腦組織缺血時(shí)間及病損程度。我國(guó)張輝等32采用線栓法制作SD大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，在局灶性腦缺血后24h發(fā)現(xiàn)NGF在缺血邊緣區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)的表達(dá)均有明顯上調(diào)，其中單純腦缺血比合并其他疾病的腦缺血患者NGF表達(dá)更為明顯。魏孟琳、鄒玉安等33通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)也得出相似的NGF表達(dá)結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)

23、實(shí)驗(yàn)大鼠的腦組織梗死區(qū)NGF的表達(dá)在發(fā)病初期有所增加，并在22小時(shí)左右達(dá)到高峰，后逐漸下降。段淑榮、王海濤等人34則解剖了多例腦梗死患者大腦，研究了側(cè)腦室室管膜下區(qū)和海馬齒狀回在不同時(shí)間點(diǎn)NGF的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)腦組織在缺血后4.510小時(shí)NGF表達(dá)開(kāi)始增多，缺血后24 70小時(shí)達(dá)高峰，34天開(kāi)始下降，缺血56天仍有較多陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，提示NGF可能參與了缺血性腦損傷的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-（transforming growth factor-,TGF-）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在表達(dá)時(shí)間上與NGF相

24、重疊，三者對(duì)腦梗死后受損神經(jīng)的保護(hù)作用可能具有協(xié)同性。通過(guò)以上國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者的研究可以發(fā)現(xiàn)，腦組織缺血后可以提高NGF的釋放，使缺血腦組織NGF的含量升高。且NGF的表達(dá)具有一定的規(guī)律性。2.5展望NGF是一種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和修復(fù)作用的大分子蛋白，其獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)使其在治療神經(jīng)病變尤其對(duì)周圍神經(jīng)病變的治療中效果顯著。近年來(lái)，在探索治療中樞神經(jīng)病變的道路上，已有多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床治療病例35-37表明NGF在治療腦梗死等疾病中擁有巨大的應(yīng)用潛力。隨著NGF的研究重點(diǎn)由周圍神經(jīng)逐漸轉(zhuǎn)向中樞神經(jīng)，NGF與腦梗死的關(guān)系也愈加受到密切關(guān)注：應(yīng)用外源性NGF能使腦梗死病人在認(rèn)知、語(yǔ)言和運(yùn)動(dòng)等

25、方面有明顯改善，降低致殘率；通過(guò)檢測(cè)腦梗死病人血清NGF的含量可能對(duì)評(píng)估病情嚴(yán)重程度有重要的參考價(jià)值。第3章 實(shí)驗(yàn)研究3.1 資料與方法3.1.1 臨床資料腦梗死組患者的納入條件：2015年10月1日至2016年12月30日于我院神經(jīng)內(nèi)科住院的腦梗死急性期患者，且符合1995年中華醫(yī)學(xué)會(huì)第四屆全國(guó)腦血管學(xué)術(shù)會(huì)議制訂的各類腦血管病診斷要點(diǎn)診斷標(biāo)準(zhǔn)38。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）入院時(shí)尚在發(fā)病24小時(shí)內(nèi)；（2）行頭部核磁檢查，明確顯示腦部急性梗死灶；（3）具有明顯神經(jīng)功能缺損的定位體征。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有其他系統(tǒng)的危重疾病者，如嚴(yán)重的心肺疾病、嚴(yán)重肝腎功能異常；（2）伴發(fā)兇險(xiǎn)的感染性疾病者；（3）體內(nèi)代謝

26、障礙或旺盛，患有代謝性疾病者；（4）免疫調(diào)節(jié)失衡，免疫功能異常者；（5）具有腫瘤病史、器官移植史的患者；（6）近4周內(nèi)有手術(shù)、外傷史者；（7）嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良的患者。按照以上標(biāo)準(zhǔn)共納入患者90人，其中男性47人，女性43人。年齡在4378歲，平均年齡為62.19±6.34歲。根據(jù)郭玉璞39病灶大小分型法，將以上患者分為三組：小梗死灶組（病灶最大直徑15mm）、中梗死灶組（15mm病灶最大直徑50mm）和大梗死灶組（病灶最大直徑50mm）。經(jīng)既往病史詢問(wèn)、詳細(xì)體格檢查和多項(xiàng)輔助檢查排除器質(zhì)性疾病，共招納對(duì)照組20名同期健康體檢者，其中男性11人，女性9人，年齡在4475歲，平均年齡為63.

27、57±6.22歲。腦梗死組與對(duì)照組在年齡、性別上的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.1.2 標(biāo)本收集腦梗死組患者分別于發(fā)病第1d、7d和14d采集清晨空腹靜脈血5ml，血樣經(jīng)檢查無(wú)溶血后離心處理15分鐘，取上層血清置于Eppendorf管中放入-70冰箱保存。采集對(duì)照組健康體檢者的清晨空腹靜脈血1次，采集處理的過(guò)程與腦梗死組無(wú)差異。3.1.3 實(shí)驗(yàn)方法檢查各樣本無(wú)氣泡、渾濁沉淀和反復(fù)凍融后，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行血清NGF含量的測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度、對(duì)比度的吸光度（A）值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的A值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。3.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

28、實(shí)驗(yàn)所得的原始數(shù)據(jù)錄入SPSS22.0軟件中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩樣本之間的對(duì)比采用t檢驗(yàn)，用方差處理分析多組間的比較，用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來(lái)表示得到的計(jì)量數(shù)據(jù)，P0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2 結(jié)果3.2.1 腦梗死組患者發(fā)病第1d、7d和14d血清NGF含量的動(dòng)態(tài)變化急性期腦梗死患者發(fā)病第1d、7d和14d血清NGF的含量（ng/ L）分別為16.04±1.33、12.26±1.90、9.70±2.73，對(duì)照組為5.43±1.27。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后發(fā)現(xiàn)：腦梗死發(fā)病第1d、7d和14d血清NGF的含量均明顯高于對(duì)照組（P0.01），并且

29、腦梗死發(fā)病第1d、7d和14d血清NGF含量之間也有顯著性差異(P0.01)，詳見(jiàn)表3.1、圖3.1。表 3.1 急性期腦梗死患者不同發(fā)病時(shí)間血清NGF含量的動(dòng)態(tài)變化(±s，ng/ L)組 別 n NGF對(duì) 照 組 20 5.43±1.27梗死組1d 90 16.04±1.33*梗死組7d 90 12.26±1.90*梗死組14d 90 9.70±2.73*#注：*表示實(shí)驗(yàn)組各組與對(duì)照組比較P0.01，表示發(fā)病7d與發(fā)病1d比較P0.01，表示發(fā)病14d與發(fā)病7d比較P0.01。注：*表示實(shí)驗(yàn)組各組與對(duì)照組比較P0.01，表示發(fā)病7d與發(fā)病1d

30、比較P0.01，表示發(fā)病14d與發(fā)病7d比較P0.01。圖 3.1 急性期腦梗死患者不同發(fā)病時(shí)間血清NGF含量的動(dòng)態(tài)變化比較圖3.2.2 急性期腦梗死不同病灶大小及不同發(fā)病時(shí)間患者血清NGF含量的動(dòng)態(tài)變化大梗死灶組患者發(fā)病第1d、7d和14d血清NGF含量（ng/L）分別為18.31±0.46、14.94±0.62、13.71±0.63；中梗死灶組患者發(fā)病第1d、7d和14d血清NGF含量（ng/L）分別為16.20±0.42、13.08±0.73、10.76±1.11；小梗死灶組患者發(fā)病第1d、7d和14d血清NGF含量（ng/L）

31、分別為14.96±0.39、10.54±0.81、7.32±1.06。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，不同發(fā)病時(shí)間點(diǎn)內(nèi)的大中小梗死灶三組患者血清NGF含量均有顯著差異（P0.01）。詳見(jiàn)表 3.2、圖 3.2。表 3.2 急性期腦梗死不同病灶大小及不同發(fā)病時(shí)間患者血清NGF含量的動(dòng)態(tài)變化(±s，ng/ L)組 別 n 發(fā)病1d 發(fā)病7d 發(fā)病14d大梗死灶組 18 18.31±0.46 14.94±0.62 13.71±0.63中梗死灶組 30 16.20±0.42 13.08±0.73 10.76±1.11小梗

32、死灶組 42 14.96±0.39 10.54±0.81 7.32±1.06注：表示小梗死灶組與中梗死灶組比較P0.01；表示中梗死灶與大梗死灶組相比較P0.01。注：*表示各組間后一組與前一組比較P0.01。圖 3.2 急性期腦梗死患者發(fā)病不同時(shí)間不同梗死灶大小血清NGF含量動(dòng)態(tài)變化比較圖第3章 討 論NGF是神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族中最重要的神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子之一，主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)，尤其在大腦內(nèi)廣泛存在。NGF與相應(yīng)受體結(jié)合后，經(jīng)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用。在正常生理狀態(tài)下，NGF能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，維持神經(jīng)細(xì)胞的成熟40；當(dāng)機(jī)體處于病態(tài)時(shí)，NGF可以促

33、進(jìn)病損細(xì)胞修復(fù)，抑制細(xì)胞凋亡41。因此NGF擁有廣闊的臨床應(yīng)用前景。NGF的生物學(xué)特性主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的初期，NGF就已經(jīng)開(kāi)始發(fā)揮作用，能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和分化；NGF能提高成熟神經(jīng)細(xì)胞的生存力，可以維持神經(jīng)系統(tǒng)的成熟狀態(tài)；當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)，高表達(dá)的NGF可以穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)外的環(huán)境，促進(jìn)病損神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)；此外，NGF對(duì)于非神經(jīng)系統(tǒng)也有一定積極作用。腦組織缺血后，受堵塞的血管周圍有少量血液滲出，局部缺血腦組織出現(xiàn)水腫，大腦耐受缺血缺氧的程度較弱，短時(shí)間內(nèi)就能引發(fā)腦梗死42。腦梗死急性期病灶是由大量神經(jīng)細(xì)胞死亡的中央壞死區(qū)和周邊仍殘存部分側(cè)支代償性循環(huán)的缺血半暗帶組成，

34、盡可能地減少神經(jīng)細(xì)胞壞死、挽救缺血半暗帶是缺血腦組織上調(diào)NGF表達(dá)的原因，NGF能通過(guò)以下機(jī)制來(lái)保護(hù)和修復(fù)缺血腦組織43-45：維持胞內(nèi)Ca2+濃度穩(wěn)定：腦組織缺血會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外Ca2+超速內(nèi)流，使之在胞內(nèi)不斷積滯造成Ca2+超載。NGF通過(guò)對(duì)鈣調(diào)素、鈣通道和排鈣系統(tǒng)等方面的作用，維持胞內(nèi)Ca2+濃度穩(wěn)定，保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞；提高自由基清除率：自由基是體內(nèi)多種生化反應(yīng)的產(chǎn)物，具有強(qiáng)氧化性，絕大多數(shù)自由基能通過(guò)多種途徑攻擊人體。在健康人體內(nèi)，自由基處于平衡之中，腦組織缺血會(huì)打破原有的秩序引起自由基劇增，導(dǎo)致缺血腦組織的損傷。NGF能增強(qiáng)多種清除自由基的蛋白酶活性，提高自由基清除率，減輕受損細(xì)胞的危害

35、；降低谷氨酸濃度：谷氨酸作為一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛存在，且作用極強(qiáng)，能夠參與許多化學(xué)反應(yīng)。腦組織缺血時(shí)，細(xì)胞內(nèi)谷氨酸濃度往往超標(biāo)，造成神經(jīng)細(xì)胞壞死。NGF能通過(guò)多種途徑穩(wěn)定谷氨酸濃度，并進(jìn)一步減緩多種具有攻擊性的離子的濃度激增；抑制一氧化碳（NO）的負(fù)性作用：NO在腦缺血早期能發(fā)揮增強(qiáng)缺血半暗帶區(qū)域血液循環(huán)的正性作用，但晚期具有加重中央壞死區(qū)損害的負(fù)性作用。NGF可以降低生成NO的酶活性，減輕部分負(fù)性作用；減緩細(xì)胞凋亡速度：腦組織缺血缺氧的環(huán)境促使大量細(xì)胞凋亡的因子被激活，NGF控制Bcl-2等多種蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯，使神經(jīng)細(xì)胞凋亡速度明顯下降；其他機(jī)制：NGF能提高受損神經(jīng)細(xì)胞代

36、謝率，提高大分子物質(zhì)合成速度46。NGF能誘導(dǎo)血管再生47，促進(jìn)髓鞘形成48，抑制海馬神經(jīng)元瞬時(shí)受體電位通道7（transient receptor potential melastatin 7，TRPM7）的表達(dá)，延緩細(xì)胞死亡49。NGF還能刺激神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化為神經(jīng)細(xì)胞50，使其能部分替代已受損的神經(jīng)細(xì)胞，來(lái)改善神經(jīng)系統(tǒng)的功能缺損。通過(guò)本研究結(jié)果表3.1、圖3.1可以發(fā)現(xiàn)，急性期腦梗死組發(fā)病1d、7d和14 d血清NGF含量均高于健康對(duì)照組。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能如下：（1）當(dāng)腦梗死發(fā)生時(shí)，BBB的結(jié)構(gòu)被破壞，通透性大大增加，使腦內(nèi)的NGF能夠透過(guò)BBB進(jìn)入血液，導(dǎo)致血清中NGF含量增高。（2）缺血腦組織周邊區(qū)域中，特定的神經(jīng)細(xì)胞、部分星形膠質(zhì)細(xì)胞、活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞能夠強(qiáng)力上調(diào)NGF的表達(dá)51。（3）腦梗死發(fā)生后，激活SHH（sonic hedgehog）信號(hào)通路使NGF的表達(dá)增加52。（4）腦梗死發(fā)生后，會(huì)誘導(dǎo)一系列特殊基因的表達(dá)與蛋白的合成，如即早基因（immediate early genes，IEGs）、白細(xì)胞介素-1（Interleukin-1，IL-