cn含有枯草芽孢桿菌脂肪酶的洗滌劑組合物及其使用方法

1、(19)中民*CN102712878A*(12)發(fā)明專利申請(qǐng)(10)申請(qǐng)公布號(hào)(43)申請(qǐng)公布日CN 1027128782012.10.03A(21)申請(qǐng)?zhí)?01080058419.2(22)申請(qǐng)日2010.12.16(30)優(yōu)先權(quán)數(shù)據(jù)61/288,696 2009.12.21 US(85)PCT申請(qǐng)進(jìn)入2012.06.21階段日(86)PCT申請(qǐng)的申請(qǐng)數(shù)據(jù)PCT/US2010/060768 2010.12.16(87)PCT申請(qǐng)的公布數(shù)據(jù)WO2011/084599 EN 2011.07.14(71)申請(qǐng)人地址 美國(guó)科美國(guó)公司亞州(72)發(fā)明人 C·B·(74)專利機(jī)構(gòu)北京

2、市中咨11247人(51)Int.Cl.C11D 3/386 (2006.01)權(quán)利權(quán)要利求要書(shū)求書(shū)2 2頁(yè)頁(yè) 說(shuō)說(shuō)明明書(shū)書(shū)4455頁(yè)頁(yè)(54) 發(fā)明名稱含有枯草芽孢桿菌脂肪酶的洗滌劑組合物及其使用方法(57) 摘要本發(fā)明的組合物和方法涉及從枯草芽孢桿菌克隆的脂肪酶、編碼所述脂肪酶的多核苷酸以及其使用方法。所述組合物和方法特別適用于洗滌劑清潔組合物和方法中。CN 102712878 A權(quán)利要求書(shū)CN 102712878 A1/2 頁(yè)1. 一種洗滌劑組合物，其包含 ：來(lái)自枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) 的脂肪酶，和表面活性劑，其中所述洗滌劑組合物在去除待清潔表面的油漬方面比

3、不存在所述脂肪酶的洗滌劑組合物更有效。2. 根據(jù)權(quán)利要求 1 所述的洗滌劑組合物，其中所述脂肪酶為 LipA。3. 根據(jù)權(quán)利要求 2 所述的洗滌劑組合物，其中所述 LipA 多肽是包含 BCE103氨基末端片段的融合蛋白。素酶4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述脂肪酶包含與 SEQ ID NO ：3 或 SEQ ID NO ：4 具有至少 90氨基酸序列同一性的氨基酸序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求 4 所述的洗滌劑組合物，其中所述脂肪酶包含與 SEQID NO ：3 或 SEQ ID NO ：4 具有至少 95氨基酸序列同一性的氨基酸序列。6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗

4、滌劑組合物，其中所述脂肪酶是重組脂肪酶。7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述脂肪酶是在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的重組脂肪酶。8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述表面活性劑是離子型或非離子型表面活性劑。9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述表面活性劑是一種或多種選自陰離子型表面活性劑、陽(yáng)離子型表面活性劑、兩性離子型表面活性劑以及它們的組合的表面活性劑。10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述表面活性劑包含一種或多種選自如下的表面活性劑 ：十二烷基苯磺酸鈉、氫化椰油酸鈉、月桂基聚氧乙烯醚硫酸鈉、C12-14烷醇聚醚 -4

5、。醇聚醚 -7、C12-15醇聚醚 -7、C12-15醇聚醚硫酸鈉和 C14-15 鏈11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其是在約8.0 至約10.0 的pH 下配制。12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其是在約8.2 至約10.0 的pH 下配制。13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述洗滌劑組合物選自衣物洗滌劑、餐具洗滌劑和硬質(zhì)表面劑。14. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述組合物的形式選自液體、粉末、顆粒狀固體和片。15. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述洗滌劑組合物在約30至約 40的溫度下有效

6、水解脂質(zhì)。16. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其中所述洗滌劑組合物在水解 C4 至 C16 底物方面比包含代替枯草芽孢桿菌脂肪酶的類產(chǎn)堿假單胞菌 (Pseudomonas pseudoalcaligenes) 脂肪酶變體 M21L(LIPOMAXTM) 的等同洗滌劑組合物更有效。17. 根據(jù)權(quán)利要求 1-16 中任一項(xiàng)所述的洗滌劑組合物，其還包含蛋白酶。18. 根據(jù)權(quán)利要求 17 所述的洗滌劑組合物，其還包含枯草桿菌蛋白酶。22權(quán)利要求書(shū)CN 102712878 A2/2 頁(yè)19. 一種用于水解表面上的污垢或污漬中存在的脂質(zhì)的方法，其包括使所述表面與根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述

7、的洗滌劑組合物接觸。20. 一種用于進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的方法，其包括使供體所述的洗滌劑組合物接觸。21. 根據(jù)權(quán)利要求 20 所述的方法，其中所述供體22. 根據(jù)權(quán)利要求 21 所述的方法，其中所述供體與根據(jù)權(quán)利要求 1-18 中任一項(xiàng)包含 C4-C16 碳鏈。包含 C8 碳鏈。33說(shuō)明書(shū)CN 102712878 A1/45 頁(yè)含有枯草芽孢桿菌脂肪酶的洗滌劑組合物及其使用方法0001優(yōu)先權(quán)0002本專利申請(qǐng)要求 2009 年 12 月 21 日提交的系列號(hào)為 61/288,696 的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，藉此將該專利申請(qǐng)全文以的方式并入本文中。技術(shù)領(lǐng)域0003本發(fā)明的組合物和方法涉及從枯草芽孢桿

8、菌 (Bacillus subtilis) 克隆的脂肪酶、編碼所述脂肪酶的多核苷酸以及其使用方法。背景技術(shù)0004當(dāng)前的衣物洗滌劑和/ 或織物護(hù)理組合物包括諸如表面活性劑、酶 ( 蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和 / 或素酶)、漂白劑、助洗劑系統(tǒng) (builder system)、抑泡劑、懸污劑、去污劑、熒光增白劑、軟化劑、分散劑活性成分的復(fù)雜組合。轉(zhuǎn)移抑制化合物、研磨劑、殺細(xì)菌劑和芳香劑之類的0005 脂肪分解酶 ( 包括脂肪酶和角質(zhì)酶 ) 已被用于洗滌劑清潔組合物中，以通過(guò)水解甘油三酸酯產(chǎn)生脂肪酸來(lái)去除油漬。然而，清潔組合物中存在的表面活性劑和其它組分常常會(huì)抑制這些酶，干擾其除去油漬的能力。因此，

9、需要可在清潔組合物的苛刻環(huán)境中起作用的脂肪酶和角質(zhì)酶。0006還需要有效進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)以便制造生物、潤(rùn)滑劑以及其它和半烴的較為穩(wěn)健且有效的脂肪酶和角質(zhì)酶。優(yōu)選地，這些酶將利用天然存在或常用的原料，而且在反應(yīng)中不需要保護(hù)和去保護(hù)步驟，這些保護(hù)和去保護(hù)步驟會(huì)使廢產(chǎn)物。變得復(fù)雜以及導(dǎo)致產(chǎn)生發(fā)0007本發(fā)明組合物和方法涉及從枯草芽孢桿菌克隆的脂肪酶 A(LipA)。在一些實(shí)施方案中，LipA 與細(xì)菌酶是源自在位于荷蘭素酶催化結(jié)構(gòu)域的羧基末端融合。在一些實(shí)施方案中，細(xì)菌素(Baam，The Netherland) 的荷蘭生物科技培養(yǎng)物保藏中心 (Central Bureau voor Schimmelcu

10、ltures) 以 CBS 670.93( 稱為 BCE103) 保藏的芽孢桿菌屬 (Bacillus) 菌株。在一些實(shí)施方案中，LipA 通過(guò)可裂解連接物連接至 BCE103 纖維素酶。因此，在一些實(shí)施方案中，LipA 不是融合蛋白。0008 在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供了重組枯草芽孢桿菌 LipA 多肽。在一些實(shí)施方案中，重組 LipA 多肽與 SEQ ID NO ：3 的氨基酸序列具有 80至 99的同一性 ( 例如 80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或 99的同一性 )。在另外的實(shí)施方案中，重組 LipA 多肽是包含 BCE103素酶氨基末端片段的融合蛋白。

11、在一些實(shí)施方案中，重組 LipA 融合蛋白與 SEQ ID NO ：4 的氨基酸序列具有至少 80的同一性 ( 例如80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或 100的同一性 )。除非具體說(shuō)明，否則本文使用的術(shù)語(yǔ) LipA 多肽涵蓋 LipA 融合蛋白以及缺少融合搭配物的44說(shuō)明書(shū)CN 102712878 A2/45 頁(yè)成熟 LipA 多肽二者。在一些實(shí)施方案中，LipA 多肽是在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。本發(fā)明還提供了表達(dá)載體，其包含以有效方式與啟動(dòng)子組合的編碼 LipA 多肽的多核苷酸。0009在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，提供了洗滌劑組合物，其包含重組枯草芽孢桿菌 Lip

12、A 多肽。在一些實(shí)施方案中，重組 LipA 多肽與 SEQ ID NO ：3 的氨基酸序列具有至少 80的同一性 ( 例如 80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或 100的同一性)。在其它實(shí)施方案中，重組 LipA 多肽是包含 BCE103素酶氨基末端片段的融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，重組 LipA 融合蛋白與 SEQ ID NO ：4 的氨基酸序列具有至少 80的同一性 ( 例如 80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100的同一性 )。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含表面活性劑 ( 離子型或非離子型 )。在一些實(shí)施方

13、案中，表面活性劑包含選自如下的一者或多者 ：十二烷基苯磺酸鈉、氫化椰油酸鈉、月桂基聚氧乙烯醚硫酸鈉、C12-14醇聚醚 -7、C12-15醇聚醚 -7、C12-15醇聚醚硫酸鈉、C14-15醇聚醚 -4。在一些實(shí)施方案中，表面活性劑包含離子型表面活性劑。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，離子型表面活性劑選自陰離子型表面活性劑、陽(yáng)離子型表面活性劑、兩性離子型表面活性劑以及它們的組合。在一些實(shí)施方案中，洗滌劑是在 8.0 至 10.0 的 pH 值下配制。在一些實(shí)施方案中，洗滌劑選自衣物洗滌劑、餐具洗滌劑和硬質(zhì)表面劑。在一些實(shí)施方案中，洗滌劑是以選自液體、粉末、顆粒狀固體和小片的形式。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中

14、，在 30至 40的溫度下，LipA 多肽在洗滌劑中具有酶活性。0010 在相關(guān)的方面中，提供了洗滌劑組合物，其包含 ：來(lái)自枯草芽孢桿菌的脂肪酶和表面活性劑，其中所述洗滌劑組合物在去除待清潔表面的油漬方面比不含該脂肪酶的洗滌劑組合物更有效。0011 在一些實(shí)施方案中，脂肪酶是 LipA。在一些實(shí)施方案中，LipA 多肽是包含 BCE103素酶氨基末端片段的融合蛋白。0012 在一些實(shí)施方案中，脂肪酶包含與 SEQ ID NO ：3 或 SEQ ID NO ：4 具有至少 90氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，脂肪酶包含與 SEQ ID NO ：3 或 SEQ ID NO ：4 具

15、有至少 95氨基酸序列同一性的氨基酸序列。0013 在一些實(shí)施方案中，脂肪酶是重組脂肪酶。在一些實(shí)施方案中，脂肪酶是在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的重組脂肪酶。0014 在一些實(shí)施方案中，表面活性劑是離子型或非離子型表面活性劑。在一些實(shí)施方案中，表面活性劑是一種或多種選自陰離子型表面活性劑、陽(yáng)離子型表面活性劑、兩性離子型表面活性劑以及它們的組合的表面活性劑。在一些實(shí)施方案中，表面活性劑包含一種或多種選自如下的表面活性劑 ：十二烷基苯磺酸鈉、氫化椰油酸鈉、月桂基聚氧乙烯醚硫酸鈉、C12-14烷醇聚醚 -4。醇聚醚 -7、C12-15醇聚醚 -7、C12-15醇聚醚硫酸鈉和 C14-15 鏈0015在一些實(shí)

16、施方案中，洗滌劑組合物是在約 8.0 至約 10.0 的 pH 值下配制。在一些實(shí)施方案中，洗滌劑組合物是在約 8.2 至約 10.0 的 pH 值下配制。0016在一些實(shí)施方案中，洗滌劑組合物選自衣物洗滌劑、餐具洗滌劑和硬質(zhì)表面 劑。在一些實(shí)施方案中，所述洗滌劑組合物的形式選自液體、粉末、顆粒狀固體和片。0017在一些實(shí)施方案中，洗滌劑組合物在約 30至約 40的溫度下有效水解脂質(zhì)。55說(shuō)明書(shū)CN 102712878 A3/45 頁(yè)0018在一些實(shí)施方案中，與包含代替枯草芽孢桿菌脂肪酶的類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes) 脂肪酶變體 M21L(LIP

17、OMAXTM) 的洗滌劑組合物相比較， 所述洗滌劑組合物在水解 C4 到 C16 底物方面更有效。0019在一些實(shí)施方案中，洗滌劑組合物還包含蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，洗滌劑組合物還包含枯草桿菌蛋白酶。0020在另一個(gè)方面，提供了水解表面上的污垢或污漬中存在的脂質(zhì)的方法，其包括使所述表面與包含重組 LipA 多肽和表面活性劑的洗滌劑組合物接觸。前一段落、具體實(shí)施方例中的洗滌劑組合物適用于此目的。0021在另一個(gè)方面，提供了進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的方法，其包括使供體與包含重組 LipA多肽的組合物接觸。在一些實(shí)施方案中，供體具有 C4-16 碳鏈。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，供體具有 C8 碳鏈。0022根據(jù)

18、如下描述 LipA 組合物和方法的這些及其它方面將顯而易見(jiàn)。具體實(shí)施方式0023I. 引言0024 所描述的是涉及涉及從枯草芽孢桿菌克隆的脂肪酶 A(LipA) 的組合物和方法。這些組合物和方法部分基于以下觀察結(jié)果 ：克隆并表達(dá)的 LipA 在存在洗滌劑組合物的情況下具有羧酸酯水解酶活性。LipA 的這一特征使其特別適用于多種清潔應(yīng)用，在這些應(yīng)用中所述酶可在存在于洗滌劑組合物中的表面活性劑和其它組分的存在下水解脂質(zhì)。0025盡管 LipA 對(duì)多種天然和底物顯示出活性，但這種酶已顯示出對(duì) C4-C16 底物的偏好，對(duì) C8 底物具有峰值活性。這種特異性使得 LipA 特別適于水解短鏈甘油三酸酯以

19、及適于進(jìn)行涉及短鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。0026 II. 定義0027 在詳細(xì)描述本發(fā)明組合物和方法之前，為清楚起見(jiàn)定義了以下術(shù)語(yǔ)。未定義的術(shù)語(yǔ)和縮寫(xiě)應(yīng)符合其本領(lǐng)域所使用的通常含義 ：0028 如本文所用，“羧酸酯水解酶”(E.C.3.1.1) 是指作用于羧酸酯的酶。0029 如本文所用，“脂肪酶”、“脂酶”、“脂肪分解酶”、“脂肪分解多肽”或“脂肪分解蛋白”是指展現(xiàn)具有降解脂質(zhì)的能力 ( 如降解甘油三酸酯或磷脂的能力 ) 的酶、多肽或蛋白質(zhì)。脂肪分解酶可為例如脂肪酶、磷脂酶、酯酶或角質(zhì)酶。如本文所用，脂肪分解活性可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的任何程序確定 ( 例如參見(jiàn)古樸塔 (Gupta) 等人，生物技術(shù)

20、與應(yīng)用生物化學(xué)(Biotechnol Appl Biochem)，37 ：63-71，2003 ；美國(guó)專利號(hào)5,990,069 ；和國(guó)際公布號(hào)WO 96/18729A1)。0030 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“脂肪酸”是指源自動(dòng)物或植物脂肪或油或含于動(dòng)物或植物脂肪或油中的羧酸。脂肪酸由通常含有 4-22 個(gè)碳原子的烷基的鏈，并以末端羧基 (-COOH)為特征。脂肪酸可為飽和的或不飽和的，以及為固體、半固體或液體。0031 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“甘油三酸酯”是指脂肪酸與甘油形成的任何天然存在的酯。甘油三酸酯是脂肪和油的主要組分。其具有通式 CH2(OOCR1)CH(OOCR2)CH2(OOCR3)，其中 R1

21、、R2和 R3 可具有不同鏈長(zhǎng)度。0032 如本文所用，“?；笔怯袡C(jī)酸基團(tuán) (RCO-) 的通用名，通常是通過(guò)移除羧酸的 -OH66說(shuō)明書(shū)CN 102712878 A4/45 頁(yè)基團(tuán)獲得。0033如本文所用，術(shù)語(yǔ)“酰化”是指通常在 -OH 基團(tuán)側(cè)將?；脫Q / 添加到學(xué)轉(zhuǎn)化。中的化0034如本文所用，“?；湹孜铩笔囚人狨ニ饷? 例如角質(zhì)酶、脂肪酶、?；D(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)酯酶等) 的供體。這種底物可就其碳鏈長(zhǎng)度進(jìn)行描述。例如，C4 底物/ 供體具有 4 個(gè)碳的鏈長(zhǎng)度，C8 底物 / 供體具有 8 個(gè)碳的鏈長(zhǎng)度等等。0035如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)移酶”是指催化或基團(tuán) ( 例如?；?) 轉(zhuǎn)移至底物的酶。

22、0036如本文所用，“離去基團(tuán)”是指通過(guò)另一親核物質(zhì)取代質(zhì)。?；w裂解的親核物0037如本文所用，短語(yǔ)“洗滌劑穩(wěn)定性”是指洗滌劑組合物混合物中指定洗滌劑組合物組分 ( 如水解酶 ) 的穩(wěn)定性。0038如本文所用，“過(guò)水解酶”是能夠催化會(huì)導(dǎo)致形成適于諸如清潔、漂白和的應(yīng)用的過(guò)酸的反應(yīng)的酶。之類0039如本文所用，在短語(yǔ)“水性組合物”和“水性環(huán)境”中使用的術(shù)語(yǔ)“水性”是指由至少 50的水的組合物。水性組合物可含有至少 50的水、至少 60的水、至少 70的水、至少 80的水、至少 90的水、至少 95的水、至少 97的水、至少 99的少 99的水。甚至至0040如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”是指

23、本領(lǐng)域通常認(rèn)識(shí)到的具有表面活性性質(zhì)的任何化合物。表面活性劑一般包括陰離子型、陽(yáng)離子型、非離子型和兩性離子型化合物，本文中將進(jìn)一步進(jìn)行描述。0041如本文所用，“表面性質(zhì)”用于指靜電荷，以及蛋白質(zhì)表面所展現(xiàn)的諸如疏水性和親水性之類的性質(zhì)。0042術(shù)語(yǔ)“氧化穩(wěn)定性”是指本發(fā)明脂肪酶在本文中公開(kāi)的脂肪分解、水解、清潔或其它處理期間 ( 例如當(dāng)于漂白劑或氧化劑或者與漂白劑或氧化劑接觸時(shí) ) 常見(jiàn)的條件下，在給定時(shí)間段內(nèi)保留規(guī)定量的酶活性。在一些實(shí)施方案中，脂肪酶在與漂白劑或氧化劑接觸指定時(shí)間段 ( 例如至少約 1 分鐘、約 3 分鐘、約 5 分鐘、約 8 分鐘、約 12 分鐘、約 16 分鐘、約 20

24、 分鐘等) 后保留至少約 50、約 60、約 70、約 75、約 80、約 85、約 90、約 92、約 95、約 96、約 97、約 98或約 99的脂肪分解活性。0043術(shù)語(yǔ)“螯合劑穩(wěn)定性”是指本發(fā)明脂肪酶在本文中公開(kāi)的脂肪分解、水解、清潔或其它處理期間 ( 例如當(dāng)于螯合劑或與螯合劑接觸時(shí) ) 常見(jiàn)的條件下，在指定時(shí)間段內(nèi)保留指定量的酶活性。在一些實(shí)施方案中，脂肪酶在與螯合劑接觸指定時(shí)間段 ( 例如至少約 10 分鐘、約 20 分鐘、約 40 分鐘、約 60 分鐘、約 100 分鐘等) 后保留至少約 50、約 60、約 70、約 75、約 80、約 85、約 90、約 92、約 95、約

25、96、約 97、約 98或約99的脂肪分解活性。0044術(shù)語(yǔ)“熱穩(wěn)定性”和“熱穩(wěn)定度”是指本發(fā)明脂肪酶在本文中公開(kāi)的脂肪分解、水解、清潔或其它處理期間 ( 例如當(dāng)于改變的溫度時(shí) ) 常見(jiàn)的條件下于標(biāo)識(shí)溫度指定時(shí)間段后保留指定量的酶活性。變化的溫度包括增加或降低的溫度。在一些實(shí)施方案中，脂肪酶在于改變的溫度指定時(shí)間段( 例如至少約 60 分鐘、約 120 分鐘、約 180 分鐘、約240 分鐘、約 300 分鐘等) 后保留至少約 50、約 60、約 70、約 75、約 80、約 85、77說(shuō)明書(shū)CN 102712878 A5/45 頁(yè)約 90、約 92、約 95、約 96、約 97、約 98或約

26、 99的脂肪分解活性。0045術(shù)語(yǔ)“清潔活性”是指在本文中公開(kāi)的脂肪水解、水解、清潔或其它處理期間的常見(jiàn)條件下由脂肪酶實(shí)現(xiàn)的清潔性能。在一些實(shí)施方案中，清潔性能是通過(guò)應(yīng)用酶敏感性污漬 ( 例如草、血、奶或蛋蛋白 ) 的多種清潔測(cè)定法，在污漬經(jīng)歷標(biāo)準(zhǔn)洗滌條件后通過(guò)多種色譜法、分光光度法或其它定量方法測(cè)定。示例性的測(cè)定法包括 ( 但不限于 )WO99/34011 和美國(guó)專利6,605,458( 將二者以例中所包括的那些方法。的方式并入本文) 中所述的測(cè)定法，以及實(shí)0046術(shù)語(yǔ)脂肪酶的“清潔有效量”是指特定清潔組合物中實(shí)現(xiàn)所需水平酶活性的前文所述脂肪酶的量。這種有效量易于由本領(lǐng)域普通技術(shù)確定并且依據(jù)

27、許多因素，如所用的特定脂肪酶、清潔應(yīng)用、清潔組合物的具體組成以及需要液體組合物還是干燥 ( 例如顆粒狀、條狀 ) 組合物等。0047如本文所用，術(shù)語(yǔ)“清潔輔助材料”意指所需清潔組合物的特定類型和的形式 ( 例如液體、顆粒、粉末、條、糊狀物、噴霧、片、凝膠 ；或組合物 ) 選擇的任何液體、固體或氣體材料，這些材料還優(yōu)選與組合物中使用的脂肪酶相容。在一些實(shí)施方案中，顆粒狀組合物為“緊湊 (compact)”形式，而在其它實(shí)施方案中，液體組合物為“濃縮”形式。0048如本文所用，“清潔組合物”和“清潔制劑”是指可用于從待清潔物品如織物、器皿、隱形眼鏡、其它固體表面、毛發(fā)、皮膚、牙齒等去除不期望的化合

28、物 ( 例如污垢或污漬) 的化學(xué)成分的混合物。所述組合物或配方可視待清潔的表面、物品或織物以及組合物或制劑的所需形式而呈液體、凝膠、顆粒、粉末或噴霧形式。0049如本文所用，術(shù)語(yǔ)“洗滌劑組合物”和“洗滌劑制劑”是指擬用于供清潔染污物體的洗滌介質(zhì)中的化學(xué)成分的混合物。洗滌劑組合物 / 制劑一般包含至少一種表面活性劑，并且可任選包含水解酶、氧化 - 還原酶、助洗劑、漂白劑、漂白活化劑、上藍(lán)劑和熒光抗結(jié)塊劑、掩蔽劑、酶活化劑、抗氧化劑和增溶劑。、0050如本文所用，“餐具洗滌組合物”是指用于清潔餐具 ( 包括刀叉餐具 ) 的組合物的所有形式，包括 ( 但不限于) 顆粒和液體形式。在一些實(shí)施方案中，餐

29、具洗滌組合物是可用于自動(dòng)洗碗碟機(jī)中的“自動(dòng)餐具洗滌”組合物。無(wú)意于使本發(fā)明局限于任何特定類型或餐具洗滌組合物。實(shí)際上，本發(fā)明可用于清潔任何材料 ( 包括( 但不限于) 陶瓷、金屬、瓷杯、碗等 )器、丙烯酸樹(shù)脂等 ) 的餐具( 例如器皿，包括 ( 但不限于) 盤(pán)子、杯子和刀具( 例如刀叉餐具，包括 ( 但不限于) 匙、刀、叉、服務(wù)用具等 )。術(shù)語(yǔ)“餐具”在本文中用于指器皿和刀叉餐具二者。0051 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“漂白”是指在適宜的 pH 和溫度條件下處理材料 ( 例如織物、衣物、漿料等 ) 或表面足夠長(zhǎng)的時(shí)間以實(shí)現(xiàn)材料變亮( 即，變白 ) 和/ 或清潔。適于漂白的化學(xué)品的實(shí)例包括 ( 但不限于

30、 )ClO2、H2O2、過(guò)酸、NO2 等。0052 如本文所用，變體脂肪酶的“洗滌性能”是指變體脂肪酶對(duì)洗滌的貢獻(xiàn)，其為組合物中未添加變體脂肪酶的洗滌劑提供附加的清潔性能。洗滌性能是在相關(guān)的洗滌條件下比較。0053 術(shù)語(yǔ)“相關(guān)的洗滌條件”在本文中用于指在家居中實(shí)際用于器皿或衣物洗滌劑市場(chǎng)部分中的條件，尤其是洗滌溫度、時(shí)間、洗滌力學(xué)濃度、洗滌劑類型和水硬度。0054如本文所用，術(shù)語(yǔ)“”是指去除表面的污染物以及抑制或殺死物品表面上的微88說(shuō)明書(shū)CN 102712878 A6/45 頁(yè)生物。無(wú)意于本發(fā)明局限于任何特定的表面、物品或待去除的污染物或微生物。0055本文的清潔組合物的“緊湊”形式最佳由密

31、度反映，就組成來(lái)說(shuō)，由無(wú)機(jī)填料鹽的量反映。無(wú)機(jī)填料鹽是呈粉末形式的洗滌劑組合物的常規(guī)成分。在常規(guī)洗滌劑組合物中， 填料鹽是大量存在，通常為總組合物的約 17 重量到約 35 重量。相比之下，在緊湊組合物中，填料鹽以不超過(guò)總組合物的約15的量存在。在一些實(shí)施方案中，填料鹽以不超過(guò)所述組合物的約 10 重量，或更優(yōu)選不超過(guò)約 5 重量的量存在。在一些實(shí)施方案中，無(wú)機(jī)填料鹽選自堿金屬和堿土金屬硫酸鹽和氯化物。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選填料鹽為硫酸鈉。0056如本文所用，術(shù)語(yǔ)“紡織物”或“紡織材料”是指織造物，以及適于轉(zhuǎn)變成或用作紗線、機(jī)織材料、針織材料和非織造物的人造短和細(xì)絲。該術(shù)語(yǔ)涵蓋由天然以及( 例

32、如制造的 )制成的紗線。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“純化”和“分離”是指以物理方式使對(duì)象( 如 LipA 多肽) 與0057其它( 如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、培養(yǎng)基組分等 ) 分離。一旦純化或分離，對(duì)象占樣品中材料總量的至少 50，且甚至至少 60、至少 70、至少 80、至少 85、至少 90、至少 95或更高 ( 重量比 )。0058如本文所用，“多肽”是指包含多個(gè)通過(guò)肽鍵連接的氨基酸的。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用。蛋白質(zhì)可任選經(jīng)過(guò)修飾 ( 例如糖基化、磷酸化、?；愇煜┗?、磺酸化等 ) 以增加功能性。當(dāng)這些氨基酸序列展現(xiàn)活性時(shí)，其可稱為“酶”。使用氨基酸殘基的常規(guī)單字母或三字母代

33、碼，其中氨基酸序列是以標(biāo)準(zhǔn)的氨基至羧基末端取向 ( 即 N C) 給出。0059術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”涵蓋 DNA、RNA雙鏈體和能編碼多肽的。核酸可為單鏈或雙鏈的，而且可為化學(xué)修飾物。術(shù)語(yǔ)“核酸”與“多核苷酸”可互換使用。由于遺傳具有簡(jiǎn)并性，故可以使用不止一個(gè)子來(lái)編碼特定氨基酸，并且本發(fā)明組合物和方法涵蓋編碼特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作說(shuō)明，否則核酸序列是以 5至 3取向提供。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“野生型”和“天然的”是指自然界中存在的多肽或多核苷酸。關(guān)于多肽的術(shù)語(yǔ)“野生型”、“親本”或“參考”是指不在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處00600061包括的置換或的天然存在的多肽。類似地，關(guān)于多核苷酸的術(shù)

34、語(yǔ)“野生的核苷改變的天然存在的多核苷酸。然而，應(yīng)注型”、“親本”或“參考”是指不包括意，編碼野生型多肽、親本多肽或參考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而涵蓋編碼野生型多肽、親本多肽或參考多肽的任何多核苷酸。0062如本文所用，“變體多肽”是指通常利用重組DNA 技術(shù)，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、添加或而源于親本 ( 或參考 ) 多肽的多肽。變體多肽與親本多肽可能有少數(shù)氨基酸殘基不同，并且可通過(guò)其與親本多肽一級(jí)氨基酸序列的同源性 / 同一性水平來(lái)限定。優(yōu)選地，變體多肽與親本多肽具有至少 70、至少 75、至少 80、至少 85、至少 90、至少 91、至少 92、至少 93、至少 94

35、、至少 95、至少 96、至少 97、至少 98或甚至至少 99的氨基酸序列同一性。0063 序列同一性可使用諸如 BLAST、ALIGN 和 CLUSTAL 之類的已知程序，使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)測(cè)定。( 參見(jiàn)例如查 (Altschul) 等人，(1990)生物學(xué)雜志 (J.Mol.Biol.215 ：院刊 (Proc.Natl.Acad.403-410) ；赫(Henikoff) 等人，(1989) 美國(guó)99說(shuō)明書(shū)CN 102712878 A7/45 頁(yè)Sci.USA)89 ：10915(Higgins) 等人 (1988)(Karin) 等人，(1993) 美國(guó)院刊，90 ：5873 ；和海(Ge

36、ne)73 ：237-244)。執(zhí)行 BLAST 分析的軟件可通過(guò)美國(guó)生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information) 公開(kāi)可用。還可使用FASTA(Pearson) 等人 (1988) 美國(guó)院刊，85 ：2444-2448) 搜索數(shù)據(jù)庫(kù)。兩個(gè)多肽實(shí)質(zhì)上一致的一個(gè)指示是第一多肽與第二多肽在免疫上交叉反應(yīng)。通常，因保守氨基酸置換而不同的多肽具有免疫交叉反應(yīng)性。因此，一種多肽與第二多肽實(shí)質(zhì)上一致，例如，在此情況下兩個(gè)多肽僅因保守置換而不同。0064 如本文所用，“變體多核苷酸”編碼變體多肽 ；與親本多核苷酸具有指定程度的同源性/ 同一

37、性 ；或在嚴(yán)格條件下與親本多核苷酸或其互補(bǔ)序列雜交。優(yōu)選地，變體多核苷酸與親本多核苷酸具有至少 70、至少 75、至少 80、至少 85、至少 90、至少 91、至少 92、至少 93、至少 94、至少 95、至少 96、至少 97、至少 98或甚至至少 99 的核苷酸序列同一性。測(cè)定同一性百分比的方法是本領(lǐng)域已知的并且上文剛進(jìn)行描述。0065術(shù)語(yǔ)“源自”涵蓋術(shù)語(yǔ)“來(lái)源于”、“從獲得”、“可由獲得”、“分離自”和“由產(chǎn)生”，并且通常是指一種指定材料來(lái)源于另一指定材料或者具有可參照另一指定材料描述的特征。0066如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜交”是指用于使一條核酸鏈通過(guò)本領(lǐng)域已知的堿基配對(duì)與互補(bǔ)合的方法。

38、0067 如本文所用，短語(yǔ)“雜交條件”是指進(jìn)行雜交反應(yīng)的條件。這些條件通常根據(jù)測(cè)量雜交的條件的“嚴(yán)格性”程度來(lái)分類。嚴(yán)格性程度可例如基于核酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度 (Tm)。例如，“最高嚴(yán)格性”通常在約 Tm-5 ( 比探針的 Tm 低 5 ) 下發(fā)生 “；高嚴(yán)格性”通常在比 Tm 低約 5 至 10°下發(fā)生 “；中等嚴(yán)格性”通常在比探針 Tm 低約 10 到 20°下發(fā)生 ；且“低嚴(yán)格性”通常在比 Tm 低約 20 到 25°下發(fā)生。作為另一種選擇，或除此之外，雜交條件可基于雜交和 / 或一次或多次嚴(yán)格性洗滌的鹽或離子強(qiáng)度條件，例如 ：6×SSC

39、極低嚴(yán)格性 ；3×SSC 低至中等嚴(yán)格性 ；1×SSC 中等嚴(yán)格性 ；且 0.5×SSC 高嚴(yán)格性。在功能上，可以使用最高嚴(yán)格性條件來(lái)鑒別與雜交探針具有嚴(yán)格的同一性或接近嚴(yán)格的同一性的核酸序列 ；而高嚴(yán)格性條件用于鑒別與探針具有約 80或更高序列同一性的核酸序列。對(duì)于需要高選擇性的應(yīng)用，通常需要使用相對(duì)嚴(yán)格的條件來(lái)形成雜交物 ( 例如，使用相對(duì)較低的鹽和 / 或高溫條件 )。如本文所用，嚴(yán)格條件定義為 50和 0.2×SSC(1×SSC 0.15M NaCl、0.015M 檸檬酸鈉，pH7.0)。0068在關(guān)于至少兩條核酸或多肽的上下文中，短語(yǔ)

40、“實(shí)質(zhì)上相似和實(shí)質(zhì)上相同”意指， 多核苷酸或多肽包含與親本或參考序列具有至少約 90、至少約 91、至少約 92、至少 約 93、至少約 94、至少約 95、至少約 96、至少約 97、至少約 98或甚至至少約99的同一性，或者不包括在不增加功能性的情況下僅為避開(kāi)本描述所作的氨基酸置換、或修飾的序列。0069如本文所用，“表達(dá)載體”是指 DNA 構(gòu)建體，其含有編碼指定多肽且有效連接至能夠?qū)崿F(xiàn)該多肽在合適的宿主中表達(dá)的合適序列的 DNA 序列。這種序列包括實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子這種轉(zhuǎn)錄的任選的子序列、編碼合適的 mRNA 核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。載體可以是質(zhì)粒、噬菌體顆?；騼H僅是潛

41、在組物。一旦轉(zhuǎn)化進(jìn)適合宿主中，載體就可于宿主組和發(fā)揮作用，或者在一些情況下可整合進(jìn)組本身中。1100說(shuō)明書(shū)CN 102712878 A8/45 頁(yè)0070術(shù)語(yǔ)“重組”是指例如通過(guò)使編碼序列突變以產(chǎn)生該變的多肽、將編碼序列與另一的編碼序列融合、使處于不同啟動(dòng)子下、在生物體中表達(dá)、以降低或升高的水平表達(dá)、以不同于的天然表達(dá)譜的方式有條件地或組成地表達(dá)等，對(duì)遺傳物質(zhì)( 即，核酸、核酸編碼的多肽以及包含這些多核苷酸的載體和細(xì)胞 ) 進(jìn)行修飾以改變其序列或表達(dá)特征。一般說(shuō)來(lái)，重組核酸、多肽和基于它們的細(xì)胞已通過(guò)人進(jìn)行得其與自然界中存在的相關(guān)核酸、多肽和細(xì)胞不相同。0071“信號(hào)序列”是指結(jié)合至多肽的 N

42、 端部分，并且促進(jìn)成熟形式的蛋白質(zhì)從細(xì)胞使的氨基酸序列。細(xì)胞外蛋白質(zhì)的成熟形式?jīng)]有信號(hào)序列，其在過(guò)程期間被切除。0072術(shù)語(yǔ)“選擇標(biāo)記”或“可選標(biāo)記”是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)使得易于選擇含有所引入的核酸或載體的宿主的?？蛇x標(biāo)記的實(shí)例包括 ( 但不限于) 抗微生物物質(zhì)( 例如潮霉素、博來(lái)霉素或氯霉素 ) 和 / 或賦予宿主細(xì)胞代謝益處 ( 如營(yíng)養(yǎng)益處 ) 的。0073如本文所用，術(shù)語(yǔ)“調(diào)控元件”是指核酸序列表達(dá)的某一方面的遺傳元件。舉例來(lái)說(shuō)，啟動(dòng)子是促進(jìn)有效連接的編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控元件。另外的調(diào)控元件包括剪接信號(hào)、聚腺苷酸化信號(hào)和終止信號(hào)。0074如本文所用，“宿主細(xì)胞”一般為以使用本領(lǐng)域已

43、知的重組 DNA 技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或宿主。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞能夠編碼蛋白質(zhì)變體的載體或者表達(dá)所需的蛋白質(zhì)變體。在載體編碼蛋白質(zhì)變體的前體蛋白或前原蛋白形式的情況下，這些變體在表達(dá)時(shí)通常由宿主細(xì)胞0075在將核酸序列到宿主細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)“引入”意指轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)化的包括本領(lǐng)域已知的原生轉(zhuǎn)化法、氯化鈣沉淀法、電穿孔法DNA 法等等。( 參見(jiàn)常 (Chang) 和克汗 (Cohen)(1979)遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué) (Mol.Gen.Genet.)，168 ：111-115634 ；和(Plenum0076(Smith) 等人 (1986) 應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué) (Ap

44、pl.Env.Microbiol.)，51 ：(Ferrari) 等人所著的綜述文章，載于 Harwood，Bacillus，派拉蒙Publishing Corporation)，第 57-72 頁(yè)，1989)。公司如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可選標(biāo)記”或“可選擇產(chǎn)物”是指編碼酶活性的抗性。的使用，該酶活性給表達(dá)該可選標(biāo)記的細(xì)胞賦予抗生素或0077其它科技術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)通常所理解的相同 ( 例如參見(jiàn)立頓 (Singleton) 和(Sainsbury)，微生物學(xué)與生物學(xué)詞典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)，第 2 版

45、，約翰威立公司(John Wiley and Sons)，紐約 (1994) ；以及(Hale) 和(Marham)派斯生物學(xué)詞典 (The Harper Collins Dictionary of Biology)Perennial)，紐約 (1991)。(Harper0078除非文中另外明確說(shuō)明，否則單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括多個(gè)指示物。0079提供的小標(biāo)題是出于便利的目的，不應(yīng)解釋為限制。在一個(gè)小標(biāo)題下包括的描述可適用于本說(shuō)明書(shū)整體。0080III.LipA 多肽和多核苷酸0081A.LipA 多肽0082在一個(gè)方面，本發(fā)明組合物和方法提供了重組LipA 多肽或其變體。示例

46、性的LipA多肽是從枯草芽孢桿菌 168 分離的 (GENBANK 登錄號(hào) P37957)。成熟 LipA 多肽具有 SEQ ID1111說(shuō)明書(shū)CN 102712878 A9/45 頁(yè)NO ：3 的氨基酸序列。類似地，實(shí)質(zhì)上一致的 LipA 多肽可存在于自然界中，例如存在于枯草芽孢桿菌的其它菌株或分離株中。所公開(kāi)的 LipA 多肽也可與細(xì)菌素酶催化結(jié)構(gòu)域的羧基末端融合。例如，細(xì)菌素酶可源自在位于荷蘭的荷蘭生物科技培養(yǎng)物保藏中心以 CBS 670.93( 稱作 BCE103) 保藏的芽孢桿菌屬菌株。LipA 多肽還可通過(guò)可裂解的連接物連接至 BCE103肽。素酶。本發(fā)明組合物和方法涵蓋這些和其它

47、重組 LipA 多0083 在一些實(shí)施方案中，重組 LipA 多肽是與實(shí)例性 LipA 多肽具有指定程度的氨基酸序列同源性，例如與 SEQ ID NO ：3 的氨基酸序列具有至少 70、至少 75、至少 80、至少 85、至少 90、至少 91、至少 92、至少 93、至少 94、至少 95、至少 96、至少 97、至少 98或甚至至少 99序列同源性的變體 LipA 多肽。同源性可例如使用諸如BLAST、ALIGN 或 CLUSTAL 之類的程序 ( 如本文中所述 )，通過(guò)氨基酸序列比對(duì)來(lái)測(cè)定。0084在一些實(shí)施方案中，重組 LipA 多肽包括實(shí)質(zhì)上影響多肽的結(jié)構(gòu)和/ 或功能的置換。示例性的

48、置換是保守置換，如表 I 中所概述的。0085表 I. 氨基酸置換008600871122說(shuō)明書(shū)CN102712878A10/45 頁(yè)0088涉及天然存在的氨基酸的置換一般是通過(guò)使編碼重組 LipA 多肽的核酸突變，然后在生物體中表達(dá)變體多肽來(lái)進(jìn)行。涉及非天然存在的氨基酸的置換或氨基酸的化學(xué)修飾1133說(shuō)明書(shū)CN 102712878 A11/45 頁(yè)一般是在由生物體重組 LipA 多肽后通過(guò)以化學(xué)方式對(duì)所述多肽進(jìn)行修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)。0089在一些實(shí)施方案中，變體重組 LipA 多肽與 SEQ ID NO ：3 實(shí)質(zhì)上一致，意指其不包含顯著影響多肽的結(jié)構(gòu)、功能或表達(dá)的氨基酸置換或。此類變體重組 Lip

49、A多肽包括僅設(shè)計(jì)用于避開(kāi)本描述的多肽。0090 在一些實(shí)施方案中，重組 LipA 多肽 ( 包括其變體 ) 具有羧酸酯水解酶活性，所述羧酸酯水解酶活性包括脂肪酶、酯酶、轉(zhuǎn)酯酶和 / 或?；D(zhuǎn)移酶活性。羧酸酯水解酶活性可使用本文所述的測(cè)定法或通過(guò)本領(lǐng)域已知的其它測(cè)定法來(lái)測(cè)定和測(cè)量。在一些實(shí)施方案中，重組 LipA 多肽在存在洗滌劑組合物的情況下具有活性。0091 LipA 多肽包括“全長(zhǎng)”LipA 多肽中保持羧酸酯水解酶活性的片段。這些片段優(yōu)選保留全長(zhǎng)多肽的活性位點(diǎn)，但可具有非關(guān)鍵性氨基酸殘基的。這些片段的活性可使用本文所述的測(cè)定法或通過(guò)本領(lǐng)域已知的其它測(cè)定法容易地測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，Lip

50、A多肽的片段在存在洗滌劑組合物的情況下保持羧酸酯水解酶活性。0092在一些實(shí)施方案中，LipA 多肽與引導(dǎo) LipA 多肽的細(xì)胞外的信號(hào)肽融合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酶與細(xì)菌素酶的催化結(jié)構(gòu)域的羧基末端融合。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)菌素酶源自在位于荷蘭的荷蘭生物科技培養(yǎng)物保藏中心以 CBS 670.93( 稱作 BCE103) 保藏的芽孢桿菌屬菌株。在其它實(shí)施方案中，LipA 多肽通過(guò)可裂解的連接物連接至 BCE103素酶。編碼與 BCE103素酶的催化結(jié)構(gòu)域融合的LipA 的示例性多肽序列是 SEQ ID NO ：4。0093在一些實(shí)施方案中，LipA 多肽是在生物體 ( 即，除枯草芽孢桿

51、菌之外的生物體 ) 中表達(dá)。示例性的生物體是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，如地衣芽孢桿菌 (Bacilluslicheniformis)、遲緩芽孢桿菌 (Bacillus lentus)、短芽孢桿菌 (Bacillus brevis)、嗜熱脂肪地芽胞桿菌 (Geobacillus stearothermophilus)( 以前稱為嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌 (Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌 (Bacillus amyloliquefaciens)、凝結(jié)芽孢桿菌 (Bacillus coagulans)、環(huán)狀芽胞桿菌

52、(Bacillus circulans)、燦爛芽孢桿菌 (Bacillus lautus)、巨大芽孢桿菌 (Bacillusmegaterium)芽胞桿菌(Bacillus th uringiensis)、變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans) 或鼠灰鏈霉菌 (Streptomyces murinus) ；革蘭氏細(xì)菌，如大腸桿菌 ；酵母，如酵母菌屬 (Saccharomyces spp.) 或裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces spp.)，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ；和絲狀真菌，如曲霉菌屬(Aspergillus sp

53、p.)，例如米曲霉 (Aspergillus oryzae) 或黑曲霉 (Aspergillus niger) 和里氏木霉 (Trichodermareesei)。將核酸轉(zhuǎn)化進(jìn)這些生物體中的方法是本領(lǐng)域眾所宿主細(xì)胞的程序描述于 EP 238023 中。的。適用于轉(zhuǎn)化曲霉菌屬0094在特定的實(shí)施方案中，LipA 多肽在生物體中作為多肽表達(dá)，在此情形中，多肽的方法。所述組合物和方法涵蓋在0095B.LipA 多核苷酸生物體中將 LipA 多肽表達(dá)為0096所述組合物和方法的另一個(gè)方面是編碼 LipA 多肽 ( 包括其變體和片段 ) 的多核苷酸，所述多核苷酸在表達(dá)載體的背景中，是提供用于引導(dǎo) Lip

54、A 多肽在生物體 ( 例如本文中確定的那些 ) 中表達(dá)。編碼 LipA 多肽的多核苷酸可有效連接至調(diào)控元件 ( 例如啟動(dòng)子、終止子、增強(qiáng)子等 ) 以幫助表達(dá)編碼的多肽。1144說(shuō)明書(shū)CN 102712878 A12/45 頁(yè)0097編碼 LipA 多肽的示例性多核苷酸序列具有 SEQ ID NO ：1 的核苷酸序列。類似地，包括實(shí)質(zhì)上一致的編碼 LipA 多肽和變體的多核苷酸可存在于自然界中，例如存在于枯草芽孢桿菌的其它菌株或分離株中。鑒于遺傳的多核苷酸可編碼相同 LipA 多肽、變體或片段。的簡(jiǎn)并性，應(yīng)當(dāng)理解具有不同核苷酸序列0098 在一些實(shí)施方案中，編碼 LipA 多肽的多核苷酸與示例性的編碼 LipA 多肽的多核苷酸具有指定程度的氨基酸序列同源性，例如與 SEQ ID NO ：3 的氨基酸序列具有至少70、至少 75、至少 80、至少 85、至少 90、至少 91、至少 92、至少 93、至少94、至少 95、至少