微生物實(shí)驗(yàn)考核內(nèi)容及匯總

1、微生物實(shí)驗(yàn)考核內(nèi)容及匯總考核一1.1 大體觀1.1.1葡萄球菌鑒別  （ 白色 金黃色 檸檬黃）1.1.2血瓊脂平板1.1.3 SS瓊脂平板1.1.4 生化管試驗(yàn)（1）糖發(fā)酵試驗(yàn)原理:多糖單糖丙酮酸酸性產(chǎn)物(或產(chǎn)酸產(chǎn)氣)pH 指示劑呈酸性變色(若產(chǎn)氣者有氣泡出現(xiàn))培養(yǎng)基：糖發(fā)酵管、半固體發(fā)酵管、微量發(fā)酵管（我們實(shí)驗(yàn)一般只用糖發(fā)酵管，不區(qū)分產(chǎn)氣與否）試劑：酚紅、溴甲酚紫等結(jié)果：若糖發(fā)酵管顏色呈 紫色，則為陰性；呈 黃色，則為陽性應(yīng)用：觀察細(xì)菌對糖度的 分解情況，常用于腸道桿菌的鑒定注：鐘

2、老師在課上，還提到一種雙糖試驗(yàn)。如果現(xiàn)象為培養(yǎng)基為黃色，則為腸道非致病菌，上紅下黃色，則為腸道致病菌，其他的記不得。（2）硫化氫試驗(yàn)：原理：細(xì)菌分解蛋白質(zhì)中的含硫氨基酸，生成硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的鐵鹽或鉛鹽結(jié)合生成黑色絡(luò)合物。培養(yǎng)基：含硫酸亞鐵或醋酸鉛的培養(yǎng)基結(jié)果：培養(yǎng)基  變黑 為陽性；不變黑 為陰應(yīng)用：常用于腸道桿菌的鑒定（3）靛基質(zhì)試驗(yàn)（吲哚試驗(yàn)）：原理：細(xì)菌產(chǎn)生色氨酸酶，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基質(zhì)（吲哚），靛基質(zhì)與試劑對二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基質(zhì)。培養(yǎng)基：蛋白胨水試劑：靛基質(zhì)試劑（含對二甲基氨基苯甲醛）結(jié)果：加入試劑后，培養(yǎng)基交界面出

3、現(xiàn)玫瑰紅色，為陽性培養(yǎng)基交界面為黃色或淺紅色：為陰性 （注：如果要鑒別，要自己動(dòng)手加試劑哦）應(yīng)用：用于腸道桿菌的鑒定（4）尿素酶試驗(yàn)原理：產(chǎn)生脲酶的細(xì)菌，能水解尿素生成氨和CO2，氨使培養(yǎng)基呈堿性變色。培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基試劑：酚紅指示劑結(jié)果：培養(yǎng)基變紅：陽性培養(yǎng)基不變色 陰性應(yīng)用：腸桿菌科屬間鑒定總結(jié)陽性現(xiàn)象：糖發(fā)酵 黃色；硫化氫 黑色；靛基質(zhì)加試劑變玫瑰紅 ； 尿素酶 紅色1.1.5 動(dòng)力實(shí)驗(yàn)動(dòng)力陽性  穿刺線清晰周圍培養(yǎng)基澄清動(dòng)力陰性  穿刺線模糊細(xì)菌向周圍擴(kuò)散生長，培養(yǎng)基渾濁1.1.6 真菌菌落真菌

4、能分泌酶使有機(jī)物降解成可溶性營養(yǎng)成分，吸收至細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行新陳代謝。大多數(shù)真菌營養(yǎng)要求不高，在沙保氏培養(yǎng)基(Sabouraud's smedium 含4%葡萄糖 1.0%蛋白胨 pH4.06.0 )，2228生長良好。大多于12周出現(xiàn)典型菌落。真菌菌落一般有三種類型。1酵母型菌落，為單細(xì)胞真菌的菌落，形態(tài)與一般細(xì)菌菌落相似，以出芽形式繁殖，如新型隱珠菌。2類酵母型菌落，外觀似酵母菌落，但可見伸入培養(yǎng)基中的假菌絲，它是由伸長的芽生孢子形成，如白色念珠菌。3絲狀菌落，為多細(xì)胞真菌的菌落，由許多菌絲體組成。菌絲多數(shù)有隔分成多個(gè)細(xì)胞稱有隔菌絲，有的

5、菌絲無隔，稱無隔菌絲。部分菌絲伸入培養(yǎng)基中吸收營養(yǎng)和水分，稱營養(yǎng)菌絲；另一部分菌絲向空間生長稱氣中菌絲，能產(chǎn)生孢子的氣中菌絲稱生殖菌絲。有些真菌的氣中菌絲形狀特殊，呈球拍狀、螺旋狀、鹿角狀等是各種皮膚絲狀菌鑒別的依據(jù)之一。絲狀菌落呈棉絮狀、絨球狀、粉末狀或石膏粉樣，在下面和背面可顯示各稱不同色素。（找不到類酵母型的圖，若某看客找到，希望與空間主人聯(lián)系，先行謝過！）1.1.7亞碲酸鉀血瓊脂平板含有0.033%亞碲酸鉀血清培養(yǎng)基上，白喉棒狀桿菌 在生長繁殖能吸收碲鹽，并還原為金屬碲，使菌落呈黑色，為本屬其他棒狀桿菌共同特點(diǎn)。且亞碲酸鉀能抑制標(biāo)本中其他細(xì)菌的生長，故亞碲酸鉀血瓊脂平板可作為

6、棒狀選擇培養(yǎng)基。1.2鏡下觀鞭毛 莢膜  異染顆粒（不算細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)，但是考試有要求）藍(lán)色（下圖為葡萄球菌）紅色考核二：油鏡使用（1）將集光器上升到最高位置，光圈開到最大。（2）轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器，使高倍鏡頭離開通光孔，在需觀察部位的玻片上垂直滴加一滴香柏油，然后慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)油鏡，在轉(zhuǎn)換油鏡時(shí)，從側(cè)面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而又不以壓破載玻片為宜。（3）用左眼觀察目鏡，并慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器至物象清晰為止。（4）觀察，分辨視野中的為革蘭陽性菌（藍(lán)色），還是陰性菌（紅色），并填在卷子上（5）油鏡使用完畢，先用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭上和標(biāo)本上的香柏油擦去，然后再用

7、干擦鏡紙擦干凈?？己巳?.1接種細(xì)菌（詳情可見實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)P6365，以下內(nèi)容較繁瑣）（一）平板分區(qū)劃線分離培養(yǎng)法【材料】1大腸埃希菌和葡萄球菌混合液2瓊脂平板【方法】        瓊脂平板培養(yǎng)的方法很多，現(xiàn)以分區(qū)劃線接種法為例。此方法可通過劃線分離，充分利用培養(yǎng)基表面，分離出單個(gè)生長的菌落。1.在平板的底部用記號筆寫上組別、標(biāo)本名稱或編號、日期等記號。（實(shí)驗(yàn)考忽略本步驟）2.右手握持接種環(huán) (執(zhí)筆式)通過火焰滅菌，冷卻后，取一接種環(huán)上述細(xì)菌混合液。3.再以左手握持平板培養(yǎng)基，使平板略呈垂直方向，并靠近火焰周圍，以免

8、空氣中雜菌落入。然后將蘸有菌液的接種環(huán)，先在培養(yǎng)基一角涂成薄膜，即1區(qū)。4.燒灼接種環(huán)，以殺死環(huán)上剩余的細(xì)菌，冷卻后，將接種環(huán)再通過區(qū)薄膜處作連續(xù)劃線（使環(huán)面與平板表面成45度角，以腕力在平板表面進(jìn)行劃線，注意勿使培養(yǎng)基劃破），劃出約占總表面積五分之一的區(qū)，同法，再分別劃出區(qū)及區(qū)、區(qū)(見圖3-1)。注意區(qū)勿與區(qū)接觸。(考試中可一般劃4個(gè)區(qū)，除非前4區(qū)忘記灼燒，在第4區(qū)劃好后，進(jìn)行一次灼燒，劃第5區(qū))5.將劃好的平板倒置(于37培養(yǎng)箱，培養(yǎng)1824h后觀察菌落的形狀、大小、邊緣、顏色、濕潤度、透明度等，比較兩種菌落的差異)。（二）純種細(xì)菌接種法    &#

9、160;   細(xì)菌經(jīng)分離培養(yǎng)出單個(gè)菌落后，常需再移種至其他培養(yǎng)基中，以進(jìn)一步鑒定或保存菌種。根據(jù)接種培養(yǎng)基之物理性狀，純種細(xì)菌接種法可分為斜面培養(yǎng)基接種、液體培養(yǎng)基接種和半固體培養(yǎng)基穿刺接種法三類。1、斜面培養(yǎng)基接種法        斜面培養(yǎng)基接種法一般用于純培養(yǎng)。從平板上挑取單個(gè)菌落接種至斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后獲得大量純種細(xì)菌（有菌苔生長），可進(jìn)一步對細(xì)菌進(jìn)行鑒定或作為菌種保存?！静牧稀?大腸埃希菌斜面菌種2瓊脂斜面培養(yǎng)基【方法】1左手持菌種管與待接種的培養(yǎng)管，將兩管并列，略傾斜，瓊脂的斜面部均向上。2右

10、手持接種環(huán)，在火焰上燒灼滅菌，待冷。3以右手掌與小指、小指與無名指分別撥取并挾持兩管蓋塞，將兩管口迅速通過火焰滅菌。4用無菌冷卻了的接種環(huán)伸入菌種管，從斜面上刮取菌苔少許，立即移入待接種的培養(yǎng)基管，自斜面底部向上劃一直線，然后再由底部向上蜿蜒劃線 (見圖3-2)。取出接種環(huán)，管口通過火焰滅菌，塞回蓋塞。作好標(biāo)記后培養(yǎng)。次日觀察細(xì)菌菌苔生長情況。 2、液體培養(yǎng)基接種法液體培養(yǎng)基接種法，主要用于增菌培養(yǎng)或細(xì)菌鑒定。若接種于肉湯培養(yǎng)基，經(jīng)37培養(yǎng)1824h后，可觀察細(xì)菌的不同生長現(xiàn)象。其他的液體培養(yǎng)基，如葡萄糖蛋白胨水、各種單糖發(fā)酵管等，接種后大多供測定細(xì)菌生化反應(yīng)之用?！静牧稀?/p>

11、1大腸埃希菌斜面菌種2肉湯培養(yǎng)基【方法】1取接種環(huán)火焰燒灼滅菌，冷卻。2按照上述“雙管接種法”一樣的操作手法，左手持細(xì)菌斜面菌種和肉湯培養(yǎng)基兩支試管，右手持接種環(huán)，按無菌操作取少量細(xì)菌，按圖3-3所示在傾斜的管壁與液面交界處輕輕地研勻，試管直立時(shí)粘附管壁上的細(xì)菌浸入液體中，管口火焰滅菌，塞瓶塞，接種后放于37溫箱中培養(yǎng)1824h后取出。3、半固體穿刺接種法半固體穿刺接種法，主要用于保存菌種或檢查細(xì)菌有無動(dòng)力，無動(dòng)力的細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中沿穿刺線生長，有動(dòng)力的細(xì)菌在半固體培養(yǎng)中呈擴(kuò)散生長，甚至使培養(yǎng)基變得混濁。另外，此法也可用于細(xì)菌生化反應(yīng)的檢測，如接種于醋酸鉛培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基等?！静牧稀堪牍?/p>

12、體培養(yǎng)基，痢疾志賀菌斜面培養(yǎng)物、大腸埃希菌斜面培養(yǎng)物。【方法】1.將接種針經(jīng)火焰燒灼滅菌冷卻后，從斜面培養(yǎng)物上沾取細(xì)菌。2.用無菌操作穿刺接種，將接種針刺入半固體培養(yǎng)基的正中央，深度達(dá)距管底0.5厘米處為止，然后順原路退出，穿刺時(shí)要直進(jìn)直出（圖3-4）。接種針經(jīng)火焰滅菌后放回原處。3.管口經(jīng)火焰滅菌后，塞回蓋塞，培養(yǎng)于371824h后觀察結(jié)果。注：平板分區(qū)劃線要記得在劃好2區(qū)后灼燒一次接種環(huán)；除了半固體的動(dòng)力實(shí)驗(yàn)用的是接種針其他時(shí)候用的均為接種環(huán)；操作要在酒精燈旁；用右手的小指持培養(yǎng)基管的膠塞，不能置于桌面上，且管口要記得過火焰三次左右的滅菌。3.2染色3.2.1革蘭染色步驟一、制片（1）涂片

13、：左手持菌液試管，右手持接種環(huán)，用接種環(huán)從試管培養(yǎng)液中取一環(huán)菌，于載玻片中央涂成薄層（事先在背面做好標(biāo)記圓圈）即可，或先滴一小滴無菌水于載玻片中央，用接種環(huán)從斜面上挑出少許，與載玻片上的水滴混合均勻，涂成一薄層。 拔或塞試管塞時(shí)，應(yīng)將試管口通過火焰略加燒灼，最后將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。（2）干燥：涂片后在室溫下自然干燥，也可在酒精燈上略加溫，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。（3）固定：常用高溫進(jìn)行固定。即手持載玻片一端，標(biāo)本面朝上，在燈的火焰外側(cè)快速來回移動(dòng)34次，共約34秒。要求玻片溫度不超過60，以玻片背面觸及手背皮膚不覺過燙為宜，放置待冷后染色。二、染色（1）初染： 加結(jié)晶紫液34滴（其實(shí)覆蓋滿細(xì)菌圈即可），染1min，細(xì)水沖洗，甩去積水。（2）媒染： 滴加盧戈碘液，染1min，細(xì)水沖洗，甩去積水。（3）脫色： 滴加95%酒精，輕晃玻片，再沖洗，反復(fù)滴加沖洗2次，共30S，甩去積水。（4）復(fù)染： 滴加稀釋石炭酸復(fù)紅溶液，染色30s，細(xì)水沖洗，甩去積水,濾紙吸干。三、油鏡觀察3.2.2抗酸染色步驟一、制片：同上二、染色：