高致病性PRRSV雙抗夾心ELISA抗原檢測試劑盒的研制及基因工程疫苗的研究

1、高致病性PRRS雙抗夾心ELISA抗原檢測試劑盒的研制及基因工程疫苗的研究豬繁殖與呼吸綜合征是目前危害全球養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的病毒性傳染病之一。自1987年首次在美國出現(xiàn)以來,一直是世界養(yǎng)豬業(yè)防控的難題。而在我國自2006年6月份以來高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒在湖北、湖南、江西、安徽等地的出現(xiàn)和流行更是給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了難以估量的損失。準(zhǔn)確、可靠的檢測技術(shù)和安全、高效的疫苗是預(yù)防和控制PRRS勺關(guān)鍵，也是目前豬病研究的熱點。本文用原核表達(dá)系統(tǒng)對豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF理因進(jìn)行高效可溶性表達(dá),并制備了抗豬繁殖與呼吸綜合征N蛋白單克隆抗體,以該單克隆抗體作為包被抗體建立了雙抗體夾心ELISA檢測

2、方法,并進(jìn)行了ELISA試劑盒的研制以期建立一套準(zhǔn)確、可靠、方便、快捷的檢測技術(shù)。另外,本研究還構(gòu)建了分別以偽狂犬病毒和桿狀病毒為載體的基因工程疫苗,并對疫苗的免疫效力進(jìn)行了研究。1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF7S因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）WUH1的核甘酸序列設(shè)計特異性引物，經(jīng)RT-PCRJ法擴(kuò)增獲得編碼核衣殼蛋白（N）的ORFS因,將ORF現(xiàn)因克隆至pGEM-T?asy載體上，獲得含有ORF理因的陽性重組質(zhì)粒pGEM-T-N經(jīng)測序證實無堿基誤配后，再將ORF理因亞克隆至原核表達(dá)載體pET-30a中，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-N,轉(zhuǎn)化E.co

3、liBL21（DE3）細(xì)胞,IPTG誘導(dǎo)后N蛋白得到表達(dá)，經(jīng)SDS-PAG電泳和WesternBlotting檢測證實N蛋白在大腸桿菌中主要以可溶性形式表達(dá)，并能與PRRSVG體陽性豬血清反應(yīng)，具有很好的免疫學(xué)活性。2、抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白單克隆抗體的制備以純化后的豬繁殖與呼吸綜合征病毒W(wǎng)UH株ORF現(xiàn)因的原核表達(dá)產(chǎn)物免疫Balb/c小鼠，將SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞融合。分別使用重組N蛋白和由Marc-145細(xì)胞擴(kuò)增的豬繁殖與呼吸綜合征病毒作為抗原建立間接ELISA方法進(jìn)行雙重篩選，通過有限稀釋法進(jìn)行克隆。最后發(fā)現(xiàn)N3H1刖N4D2價顯著高于其它雜交瘤細(xì)胞株，故將N3H1刖N

4、4D2用于后續(xù)研究。將N3H1牙口N4D2兩株細(xì)胞分別接種Balb/c小鼠，制備腹水，結(jié)果腹水抗體的的效價分別為100X214和100X215。3、豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法的建立及其應(yīng)用以由Marc-145細(xì)胞擴(kuò)增的PRRSVWUH1CH-1a株和Marc-145細(xì)胞分別作為抗原,以兩株純化的單抗互為包被抗體和酶標(biāo)記物進(jìn)行雙抗夾心ELISA檢測,結(jié)果以單抗N4D2t作為包被抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的單抗N3H1琳作為酶標(biāo)記物的結(jié)果明顯優(yōu)于以單抗N3H1琳作為包被抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的單抗N4D納作為酶標(biāo)記物的檢測結(jié)果。通過方陣滴定確定單抗的最佳包被濃度為21仙

5、g/mL,酶標(biāo)記物的最佳工作濃度為1:1000。試驗的最佳反應(yīng)條件為：28c包被14h,37c封閉1h,抗原與包被單抗37c作用1h,酶標(biāo)記物與抗原的最佳反應(yīng)時間為371h,底物的最佳反應(yīng)時間為15min。建立了雙抗體夾心ELISA診斷方法，并對其進(jìn)行了敏感性、特異性、重復(fù)性試驗。敏感性試驗的結(jié)果為該方法對重組N蛋白的最低檢測量可達(dá)6.8ng,對PRRSV的最低檢測量約為150TCID50,而RT-PCR式齊1J盒對PRRSVJ最低檢測量約為20TCID50,說明該方法具有良好的敏感性；特異性試驗表明除了陽性對照外，其它幾種病毒和陰性樣品檢測均為陰性：重復(fù)性試驗表明該方法的批間重復(fù)性和批內(nèi)重復(fù)

6、性都很好；用豬繁殖與呼吸綜合征病毒ELISA抗原檢測試劑盒和RT-PCR僉測試劑盒檢測127份臨床采集的血清樣品,兩種試劑盒的陽性符合率為84.6%,陰性符合率為86.4%,總符合率為85.8%。4、偽狂犬病毒為載體的PRRS厘組基因工程疫苗的研究在原有重組病毒rPRV-GP5m-M供表達(dá)GP5滸口M）的gG位點插入高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒W(wǎng)UH株的主要免疫原性基因ORF刎豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）修飾型ORF2（ORF2ml因的表達(dá)盒即CMV-ORF5-polyAF口CMV-ORF2m-poly構(gòu)建重組病毒rPRV-PRRSV-2另外在重組病毒rPRV-GP5m-M表達(dá)GP5話口M）

7、的gG位點插入CMV-SynORF5-polyA達(dá)優(yōu)化后的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ORF51因）,CMV-ORF4-polyA（表達(dá)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒W(wǎng)UH株ORF41因）和CMV-ORF5-ORF2m-polyAJ（合表達(dá)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒W(wǎng)UH的ORF51因和豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）修飾型ORF2（ORF2m烷達(dá)盒構(gòu)建重組病毒rPRV-PRRSV-3Westernblot表明,外源目的基因均能正確的表達(dá)。小鼠動物實驗證實,rPRV-PRRSV-2rPRV-PRRSV-3均能誘發(fā)免疫動物產(chǎn)生與親本株rPRV-GP5m-M相當(dāng)?shù)奶禺愋钥筆RM體，并觀察到誘發(fā)

8、不同程度的特異性抗PRRS的免疫應(yīng)答，其中rPRV-PRRSV-3夠誘發(fā)更高的中和抗體水平和細(xì)胞免疫水平。5、桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)介導(dǎo)的PRRSVI因工程疫苗研究由于桿狀病毒不能在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,對哺乳動物來說非常安全,所以可以用來作為將外源基因投送到體內(nèi)的載體。本研究利用VSV-G修飾過的桿狀病毒作為載體，消除了桿狀病毒的補(bǔ)體敏感性。在轉(zhuǎn)移載體pFast-VSV-G下游插入分別由CMVI動子驅(qū)動的編碼PRRSVORF3（截去疏水區(qū)2-64aa）、ORF4ORF5修飾后）、ORF61因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFast-CMV-ORF3456然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Ba速受態(tài)細(xì)胞獲得重組穿梭載體Bacmid-CMV-ORF3456g取Bacmid的基因組并經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染sf