醋酸纖維薄膜電泳實驗

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上醋酸纖維薄膜電泳實驗實驗目的1. 了解電泳儀的結構及工作原理2. 初步掌握電泳儀的基本操作。3. 了解常用的蛋白質(zhì)顯色方法。實驗器材醋酸纖維薄膜，pH8.6巴比妥緩沖液：稱取巴比妥鈉10.30g，巴比妥1.84g，溶于1000ml蒸餾水中，或者稱取10.3g巴比妥鈉，加1mol/L鹽酸8ml，加蒸餾水至1000ml。 染色液：氨基黑10B1g溶于10ml冰醋酸與90ml甲醇的混合液中。 洗滌液：冰醋酸10ml加甲醇90ml,或者甲醇50ml，冰醋酸10ml加蒸餾水40ml. 透明液：甘油溶液，或用苯甲醇，水楊酸甲醇等溶液。 微量注射器，蛋白質(zhì)樣品液和電泳儀一臺。實驗原

2、理以醇酸纖維等制成薄膜作為支持體的電泳儀稱為薄膜電泳。在一定酸堿度條件下，蛋白質(zhì)分子由于基團電離而帶有一定的電荷，在含有緩沖液的薄膜上，受電場力作用以一定的速度向一定的方向移動。不同的蛋白質(zhì)分子，由于所帶電荷的不同，移動的速度和方向也不同，從而達到分離。這種薄膜對蛋白質(zhì)樣品的吸附作用小，幾乎完全消除紙蛋白質(zhì)電泳中出現(xiàn)的拖尾現(xiàn)象，又因為薄膜的親屬性比較小，它所容納的緩沖液也少。電泳是的電流大部分是樣品在傳導，因此具有簡單，快速，區(qū)帶清晰，靈敏度高，易于定量和便于保存的特點。本方法樣品用量少，5ug的蛋白質(zhì)就能得到滿意的結果。因此特別適合于病理情況下微量蛋白檢測。以廣泛用于蛋白質(zhì)和同工酶的分離分析

3、，也可以用于免疫電泳等方面。實驗步驟1醋酸纖維薄膜的準備將醋酸纖維薄膜切成10cm*2.5cm的膜條，用鑷子夾住緩慢放入巴比妥緩沖液中30分鐘，充分浸透，取出用濾紙吸去多余的緩沖液。2點樣用微量吸管將5ug但白字樣品點在薄膜中英。3電泳儀濕潤的薄膜條置于電泳儀的長條架子上，薄膜條兩端與濾紙相接觸，拉直膜條，將濾紙條的另一端浸入緩沖液中，緩沖液兩槽的液面要水平，以避免虹吸現(xiàn)象。加蓋密封，注意防止緩沖液蒸發(fā)并避免水滴落在膜條上。靜止10分鐘。接通電源開始電泳，調(diào)節(jié)好電壓使之穩(wěn)定，以20mv/cm的電場強度電泳1小時左右。4. 顯色 電泳完畢后，取出膜條，用溴酚藍顯色法或者氨黑10B顯色法處理，取出

4、膜條后浸入氨基黑染液中染色510分鐘，然后用漂洗液洗5分鐘，直到區(qū)帶清晰為止。若要保存圖譜或使用分光光度計直接測定，則可在膜條染色后，洗褪底色，完全干燥后，置于透明液中5分鐘，取出，干后即可。思考題1醋酸纖維薄膜的特點及使用場合。2簡述醋酸纖維薄膜電泳原理。 3電泳操作時應該注意哪些問題？注意事項1、醋酸纖維素薄膜的預處理 市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的重要關鍵之一。將干膜片漂浮于電極緩沖液表面，其目的是選擇膜片厚薄及均勻度，如漂浮15s30s時，膜片吸水不均勻，則有白斑點或條紋，這提示膜片厚薄不勻，應舍去不用，以免造成電泳后區(qū)帶扭曲，界線不清，背景脫色困難，結果難

5、以重復。由于醋酸纖維薄膜親水性比紙小，浸泡30min以上是保證膜片上有一定量的緩沖液，并使其恢復到原來多孔的網(wǎng)狀結構。最好是讓漂浮于緩沖液的薄膜吸滿緩沖液后自然下沉，這樣可將膜片上聚集的小氣泡趕著走。點樣時，應將膜片表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免緩沖液太多引起樣品擴散。但也不能吸得太干，太干則樣品不易進入薄膜的網(wǎng)孔內(nèi)，而造成電泳起始點參差不齊，影響分離效果。吸水量以不干不濕為宜。為防止指紋感染，取膜時，應戴指套或用鑷子。 2、緩沖液的選擇 醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8.6巴比妥溶液，其濃度為0.05mol/L0.09mol/L。選擇何種濃度與樣品及薄膜的薄厚有關。選擇時，先初步定下某一濃度

6、，如電泳槽兩極之間的膜長度為8 cm10cm，則需電壓25V/cm膜長，電流強度為0.4mA/cm0.5mA/cm膜寬。當電泳達不到或超過這個值時，則應增加緩沖液濃度或進行稀釋。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動速度快，并由于擴散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動速度慢，區(qū)帶分布過于集中不易分辨。 3、加樣量 加樣品的多少與電泳條件、樣品的性質(zhì)、染色方法與檢測手段靈敏度密切相關。作為一般原則，檢測方法越靈敏，加樣量則越少，對分離更有利。如加樣量過大，則電泳后區(qū)帶分離不清楚，甚至互相干擾，染色也較費時。如電泳后用洗脫法定量時，每厘米加樣線上需加樣品0.1l0.5l約相當于5g1000g蛋白。血清蛋白常規(guī)電

7、泳分離時，每厘米加樣線加樣量不超過1l，相當于60g80g的蛋白質(zhì)。但糖蛋白和脂蛋白電泳時，加樣量則應多些。對每種樣品加樣量均應先作預實驗加以選擇。 點樣好壞是獲得理想圖譜的重要環(huán)節(jié)之一，以印章法加樣時，動作應輕、穩(wěn)，用力不能太重，以免將薄膜弄壞或印出凹陷而影響電泳區(qū)帶分離效果。 4、電量的選擇 電泳過程應選擇合適的電流強度，一般電流強度為0.4mA/cm0.5mA/cm寬膜為宜。電流強度高，尤其在溫度較高的環(huán)境中，可引起蛋白質(zhì)變性或由于熱效應引起緩沖液中水分蒸發(fā)，使緩沖液濃度增加，造成膜片干涸。電流過低，則樣品泳動速度慢且易擴散。 5、染色液的選擇 對醋酸纖維素薄膜電泳后染色應根據(jù)樣品的特點加以選擇。其原則是染料對被分離樣品有較強的著色力，背景易脫色；應盡量采用水溶性染料，不宜選擇醇溶性染料，以免引起醋酸纖維素膜溶解。 應控制染色時間。時間長，薄膜底色深不易脫去；時間短，著色淺不宜區(qū)分，或造成條帶染色不均，必要時可進行復染。 6、透明及保存 透明液應臨用前配制，以免冰乙酸及乙醇揮發(fā)影響透明效