基因工程大題

1、2基因工程操作的基本步驟是什么？ 施工材料的準(zhǔn)備，即目的基因、載體、工具酶和受體細(xì)胞（宿主）的準(zhǔn)備。用限制性內(nèi)切酶分別將外源DNA 和載體分子切開。（切） 目的基因與載體 DNA 的體外重組，形成重組DNA 分子。（接） 把重組的 DNA 分子引入受體細(xì)胞，并建立起無性繁殖系。（轉(zhuǎn)和擴(kuò) 篩選出所需要的無性繁殖系，并保證外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳、正確表達(dá)。（檢）3如何理解基因工程的兩個特點(diǎn)？答：基因工程的兩個基本特點(diǎn)是分子水平的操作和細(xì)胞水平的表達(dá)。分子水平的操作包括DNA 分離、切割和連接（還有其他一些DNA 的修飾等）。由于體外重組DNA 的最終目的是要改變生物的遺傳性，所以分子水平的操

2、作和細(xì)胞水平的表達(dá)是基因工程的兩個最基本的特點(diǎn)。4基因克隆是如何使含有單個基因的DNA 片段得到純化的？答：大分子質(zhì)量的DNA 會含有許多特殊限制性內(nèi)切核酸酶的限制位點(diǎn)，因此用一種限制 酶處理一完整染色體或整個基因組會產(chǎn)生許多不同的DNA 片段，每一個片段帶有基因組的一個不同的基因或一個不同的小片段。當(dāng)全部片段與用同種限制酶處理過的載體分子混合時(shí)（如圖所示），每個片段將插入一個不同的載體分子(如一個質(zhì)粒)。同樣地，當(dāng)用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時(shí)，每個宿主細(xì)胞將只接收一個質(zhì)粒DNA 分子，而篩選出的含重組質(zhì)粒的每個菌落實(shí)際上會含有某一特異的供體DNA 片段的多個拷貝。一旦帶有待研究的特定基因的克隆被

3、確認(rèn)了，此重組DNA 分子可從宿主細(xì)胞中提取出來進(jìn)行純化。5比較遺傳工程、基因工程和生物技術(shù)。答：遺傳工程是遺傳學(xué)和工程學(xué)相結(jié)合的一門技術(shù)科學(xué)。借用工程技術(shù)上的設(shè)計(jì)思想，在離體條件下，對生物細(xì)胞、細(xì)胞器、染色體或DNA 分子進(jìn)行按圖施工的遺傳操作，以求定向地改造生物的遺傳性。遺傳工程的概念有廣義和狹義之分。狹義的遺傳工程就是指基因工程?；蚬こ蹋╣ene engineering）又稱基因操作（gene manipulation）、重組DNA（recombinant DNA）。基因工程是以分子遺傳學(xué)理論為基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法手段，將不同來源的基因(DNA 分子)，按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)

4、圖，在體外構(gòu)建雜種DNA 分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品，或是研究基因的結(jié)構(gòu)和功能。生物技術(shù)又稱生物工藝學(xué)，生物工程學(xué)。是根據(jù)生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)的原理進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的經(jīng)營和開發(fā)微生物、動植物細(xì)胞及其亞細(xì)胞組分，進(jìn)而利用生物體所具有的功能元件(如基因、蛋白質(zhì))等來提供商品或社會服務(wù)的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。它包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程等。6說明Sanger DNA 測序法的原理。答：Sanger DNA 測序法建立在兩個基本原理之上：核酸是依賴于模板在聚合酶的作用下由5端向3端聚合；可延伸的引物必須能提供游離的3羥基末端，雙脫氧核苷酸由于缺少游離

5、的3羥基末端，因此會終止聚合反應(yīng)的進(jìn)行。如果分別用四種雙脫氧核苷酸終止反應(yīng)，則會獲得四組長度不同的DNA 片段。通過比較所有DNA 片段的長度可以得知核苷酸的序列。11當(dāng)兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時(shí)，若要進(jìn)行雙酶切，應(yīng)采取什么措施? 為什么?答：注意星號活性；先低鹽，后高鹽；先低溫酶，后高溫酶；并且可以直接在換酶前將第一種酶失活，再加第二種酶，否則，易產(chǎn)生星號活性，或使用通用緩沖液。12何謂限制性物理圖譜？答：限制性物理圖譜即限制性內(nèi)切核酸酶作圖(restriction mapping)。簡單地說就是DNA 分子中限制性內(nèi)切核酸酶切割位點(diǎn)的定位，即DNA 分子中各種不同限制性內(nèi)切核酸酶

6、的酶切位點(diǎn)的線性排列圖。標(biāo)明限制酶在DNA 分子上的限制性位點(diǎn)的數(shù)目、限制性片段大小及其線性排列的順序。13什么是細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng) (Restriction ModificationSystem，R-M system)?答：細(xì)菌中有作用于同一DNA 的兩種酶，即分解DNA 的限制酶和改變DNA 堿基結(jié)構(gòu)使其免遭限制酶分解的修飾酶。而且，這兩種酶作用于同一DNA 的相同部位，把這兩種酶所組成的系統(tǒng)稱為限制與修飾系統(tǒng)。14細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)有什么意義?答：不同種的細(xì)菌或不同的細(xì)菌菌株具有不同的限制酶和修飾酶組成的限制與修飾系統(tǒng)。修飾的本質(zhì)是通過甲基化酶將DNA 中某些堿基進(jìn)行甲基化修飾，由于宿主

7、自身DNA 上的這些位點(diǎn)進(jìn)行了修飾，限制酶就不能進(jìn)行切割。而外來的DNA 在相應(yīng)的堿基上沒有被甲基化，宿主的限制酶通過對該位點(diǎn)的識別來分辨敵我，并將入侵的外來DNA 分子降解掉。所以DNA 限制作用和修飾作用為細(xì)胞提供了保護(hù)。15說明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點(diǎn)。答：基本原則：屬名+種名+株名十序號。首字母：取屬名的第一個字母，且斜體大寫。第二個字母：取種名的第一個字母，斜體小寫。第三個字母：取種名的第二個字母，斜體小寫。第四個字母：若有株名，株名則作為第四個字母，用正體。順序號：若在同一菌株中分離了幾種限制酶，則按先后順序冠以I、II、III 等，用正體。所有的限制酶，前面還應(yīng)帶有系統(tǒng)的名

8、稱,如限制性核酸內(nèi)切酶 R. Hind III。修飾酶則在前面加上甲基轉(zhuǎn)移酶M，如甲基轉(zhuǎn)移酶M. Hind III。在上下文已清楚只涉及限制酶的地方，R 可被省去。16何謂限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率?答：切割頻率是指限制性內(nèi)切核酸酶在某DNA 分子中預(yù)測的切點(diǎn)數(shù)。由于DNA 是由四種類型的單核苷酸組成，假定DNA 的堿基組成是均一的，而限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點(diǎn)是隨機(jī)分布的，那么對于任何一種限制酶的切割頻率，理論上應(yīng)為14n，n 表示該限制酶識別的堿基數(shù)。如識別4 個堿基的限制酶，其切割頻率應(yīng)為每256 個堿基有一個識別序列和切點(diǎn)（144 = 1256），識別5 個堿基的限制性內(nèi)切核酸酶，其切

9、割頻率應(yīng)為每1024 個堿基有一個識別序列和切點(diǎn)，余類推。18雙酶消化法（double digest）繪制限制性內(nèi)切核酸酶酶譜的原理是什么?答：雙酶消化法是繪制DNA 中兩個或兩個以上限制性內(nèi)切核酸酶圖譜所采用的方法。做法是在兩個限制性內(nèi)切核酸酶分別單獨(dú)消化DNA 分子的基礎(chǔ)上，再用這兩個酶同時(shí)或先后消化DNA，根據(jù)它們的結(jié)果構(gòu)建物理圖譜。17什么是限制性內(nèi)切核酸酶的星號活性？受哪些因素的影響?答：II 類限制酶雖然識別和切割的序列都具有特異性，但是這種特異性受特定條件的限制，即在一定環(huán)境條件下表現(xiàn)出來的特異性。條件發(fā)生改變，限制酶的特異性就會松動，識別的序列和切割都有一些改變。改變后的活性通

10、常稱第二活性，而將這種因條件的改變會出現(xiàn)第二活性的酶的右上角加一個星號表示，因此第二活性又稱為星號活性。誘發(fā)星號活性的因素有如下幾種：高甘油含量(5，vv)；限制性內(nèi)切核酸酶用量過高(100UgDNA)；低離子強(qiáng)度(25mmolL)；高pH(80 以上)；含有有機(jī)溶劑，如DMSO、乙醇等；有非Mg2+的二價(jià)陽離子存在（如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等）。19什么是DNA 多態(tài)性 (DNA polymorphism)?答：在正常人群中，各個體DNA 分子的某些位點(diǎn)可以發(fā)生中性改變，這些改變雖然會使DNA 一級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定變化，但不影響基因的表達(dá)，如果這種中性突變在人群中的頻率不低于1，

11、這一現(xiàn)象被稱為多態(tài)性。DNA 多態(tài)性本質(zhì)上是染色體DNA 中核苷酸數(shù)目或排列順序的個體差異，這些差異多數(shù)為中性突變，不引起表型改變。20什么是限制性片段長度多態(tài)性 (restriction fragment lengt hpolymorphism，RFLP)？答：當(dāng)DNA 序列的差異發(fā)生在限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點(diǎn)時(shí)，或當(dāng)DNA 片段的插入、缺失或重復(fù)導(dǎo)致基因組DNA 經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶酶解后，其片段長度的改變可以經(jīng)凝膠電泳區(qū)分時(shí)，DNA多態(tài)性就可應(yīng)用限制性內(nèi)切核酸酶進(jìn)行分析，這種多態(tài)性稱為限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)。22何為回文序列？答：回文序列（palindromic sequenc

12、e）是一段自我互補(bǔ)的序列，即同其互補(bǔ)鏈一樣的序列（兩者的閱讀方向都是從53，)。根據(jù)回文序列的結(jié)構(gòu)可分為：完全的回文序列、不完全的回文序列和間斷的回文序列。完全回文序列（如GAATTC），通常是限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列；不完全的回文序（TACCTCCAT,CGTGATA），常是其他蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)(如阻抑蛋白)，在基因表達(dá)調(diào)控中有重要作用；間斷的回文序列（如GGTTXXXAACC，有一段是顛倒的重復(fù)），它可使單鏈的核苷酸有可能在tRNA 中所見到的一樣，形成發(fā)夾環(huán)的結(jié)構(gòu)。23DNA 連接酶的連接機(jī)理是什么？答：DNA 連接酶是利用ATP 或NAD+煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)提供的能量催化

13、DNA 雙鏈間的缺口形成磷酸二酯鍵。在連接反應(yīng)中，首先ATP (NAD+)與DNA 連接酶反應(yīng)，同連接酶生成一種共價(jià)結(jié)合的酶-AMP 復(fù)合物。其中AMP(腺苷一磷酸)通過一種磷酸酰胺鍵同DNA 連接酶的賴氨酸殘基的-氨基相連。同時(shí)釋放出焦磷酸或煙酰胺單核苷酸（NMN）。AMP 激活DNA 一條鏈的5-末端磷酸基團(tuán), 并轉(zhuǎn)移到磷酸基團(tuán)上，形成DNA-腺苷一磷酸復(fù)合物。最后，3-OH 對激活的磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵，同時(shí)釋放出AMP。連接反應(yīng)是由在形成酶-腺苷酸復(fù)合體時(shí)，焦磷酸水解和釋放提供的能量驅(qū)動下進(jìn)行的。在以ATP作為能源的連接酶中，一個磷酸二酯鍵的形成消耗掉兩個高能磷酸鍵。29列

14、舉質(zhì)粒載體必須具有的基本條件。答：(1)能獨(dú)立復(fù)制；(2)具有選擇標(biāo)記；(3)有獨(dú)特的酶切位點(diǎn)；(4)能轉(zhuǎn)化但不擴(kuò)散。24DNA 連接酶的作用特點(diǎn)有哪些？ 連接反應(yīng)需要在一條DNA 鏈的3末端具有一個游離的-OH, 而另一條DNA 鏈的5 末端具有一個磷酸基團(tuán)(-P)的情況下，才能發(fā)揮其連接DNA 分子的功能作用，而在末端帶有5-羥基和3-羥基；5-磷酸和3-二脫氧核苷基團(tuán)的兩個DNA 片段之間不起連接作用。 連接反應(yīng)中需要 ATP 或NAD+ 和Mg2+ 為輔助因子和激活因子； DNA 連接酶不能夠連接兩條單鏈的DNA 分子，被連接的DNA 鏈必須是雙螺旋的一部分。 DNA 連接酶只封閉雙螺

15、旋DNA 骨架上的缺口 (Nick)，即在雙鏈DNA 的某一條鏈上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂，而不能封閉雙鏈DNA 的某一條鏈上失去一個或數(shù)個核苷酸所形成的裂口25影響DNA 連接酶連接反應(yīng)的因素主要有哪些？答：1) 反應(yīng)溫度：最佳反應(yīng)溫度37，但黏性末端之間退火形成的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定，連接黏性末端的最佳溫度，一般認(rèn)為420比較合適。2) DNA 片段末端：不僅要考慮反應(yīng)體系中DNA 末端的總濃度，還要考慮載體與插入片段的末端濃度的比例。原則上應(yīng)保證一個DNA 分子的末端有較高的幾率與另一 DNA 分子連接，減少同一個分子兩個末端之間的自身連接。載體與插入片段 3：1

16、1：3。3) 連接酶濃度：平末端DNA 分子的連接反應(yīng)，最適酶量大約是12 單位；而黏末端DNA 片段間的連接，在同樣的條件下，僅為 0.1 單位時(shí)，便能得到最佳連接效率。28切口平移法制備DNA 探針的原理是什么？答：在Mg 離子存在時(shí)，用低濃度的DNA 酶I（DNase I）處理雙鏈DNA，使之隨機(jī)產(chǎn)生單鏈斷裂。然后用DNA 聚合酶I 的 5' 3'外切酶活性可以從斷裂處的 5' 端除去一個核苷酸，而其聚合酶活性則將一個單核苷酸添加到斷裂處的 3' 端。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，即5' 端核苷酸不斷去除，而 3' 端核苷酸同時(shí)摻入，導(dǎo)致斷裂形成的切口沿

17、著DNA 鏈按合成的方向移動，這種現(xiàn)象稱為切口平移。如果在反應(yīng)體系中加入放射性同位素標(biāo)記的核苷酸，則這些標(biāo)記的核苷酸將取代原來的核苷酸殘基，產(chǎn)生帶標(biāo)記的DNA 分子，用作DNA 分子雜交探針。27堿性磷酸酯酶主要有兩種，細(xì)菌堿性磷酸酯酶（BIP）和小牛腸堿性磷酸酯酶（CIP），二者有什么不同？在基因工程中有什么用途？答：主要差別是CIP 在68時(shí)失活，而BAP 在68穩(wěn)定，且耐酚抽提。應(yīng)用：dsDNA 的5端脫磷酸，防止DNA 的自身連接。但是用CIP 處理后，最好將CIP 除去，再進(jìn)行連接反應(yīng)。DNA 和RNA 脫磷酸，然后用于多核苷酸激酶進(jìn)行末端標(biāo)記。30舉例說明什么是穿梭載體？答：穿梭載

18、體是含有細(xì)菌質(zhì)粒和克隆的真核生物DNA 片段的雜種質(zhì)粒，有兩個復(fù)制起點(diǎn)和能在兩種不同細(xì)胞中進(jìn)行選擇的選擇標(biāo)記，所以，很容易從一宿主轉(zhuǎn)到另一個宿主 (來回穿梭)。38質(zhì)粒制備的基本原理？答：帶有質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞在SDS 作用下裂解，并在堿性條件下使DNA 變性。調(diào)節(jié)pH 值至中性時(shí)，質(zhì)粒DNA 首先復(fù)性，而細(xì)菌基因組DNA 不能復(fù)性而與SDS-蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，可以被離心沉淀除去。上清液中的質(zhì)粒DNA 分子可被酒精沉淀或其他方法沉淀純化出來。26什么是Klenow 酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？答：Klenow 酶是1974 年Klenow 用枯草桿菌蛋白酶水解DNA 聚合酶I，得到的兩

19、個片段。其中大片段的分子質(zhì)量為75kDa，它具有53聚合酶和35外切核酸酶的活性，小片段具有53外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA 聚合酶I 中會降解5引物的53外切核酸酶活性，所以在基因工程中更有用。Klenow 酶主要有下列用途：(1) 修復(fù)反應(yīng)，制備平末端?？捎肒lenow 酶修復(fù)限制性內(nèi)切核酸酶或其他方法產(chǎn)生的5或3突出端，制備平末端，這樣可以使原來具有不相容的黏性末端的DNA 片段通過平末端重組。如在反應(yīng)系統(tǒng)中加入放射性同位素標(biāo)記的脫氧核苷酸，用這種末端填補(bǔ)的方法可以制備3端標(biāo)記的探針。用Klenow 酶修復(fù)5突出端的反應(yīng)主要是利用了Klenow 酶的DNA 聚合酶活性，是填補(bǔ)反

20、應(yīng)；而修復(fù)3突出端則是用Klenow 酶的35外切核酸酶的活性，是切割反應(yīng)。用Klenow 酶的切割反應(yīng)來修復(fù)3突出端是不理想的，改用T4 DNA聚合酶或其他的酶是更好的選擇。(2) 標(biāo)記DNA 3突出端 (protruding end)。該反應(yīng)分兩步進(jìn)行：先用35的外切核酸酶活性除去3突出端，產(chǎn)生3隱含末端，然后在高濃度的標(biāo)記底物 (32P-dNTP) 存在下，使降解35) 作用與聚合 (53) 作用達(dá)到平衡。這種反應(yīng)也叫交換或取代反應(yīng) (exchangereplacement reaction)。不過這一反應(yīng)用T4 DNA 聚合酶的效果更好，因它的35的外切核酸酶活性較強(qiáng)。(3)其他的一些

21、用途。包括用雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA 序列分析、用于cDNA 第二鏈的合成、在定點(diǎn)突變中用于合成第二鏈、用引物延伸法 (primer extension) 制備單鏈DNA 探針等。31YAC 載體具有什么樣的？為什么在克隆大片段時(shí)，YAC 具有優(yōu)越性？答：（1）功能性DNA 序列:來自于酵母的125bp DNA 片段的著絲點(diǎn)序列 (CEN4)。來自酵母的自主復(fù)制序列 (ARS1)，起始在酵母中的DNA 復(fù)制。來自酵母的端粒序列，它是 (5-TGTGGGTGTGGTG-3) 的多拷貝重復(fù)，它對染色體的復(fù)制和維持是必需的。在酵母中進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因，URA3（尿嘧啶生物合成基因）和TRP1（色氨

22、酸合成基因）。寄主是這些基因的營養(yǎng)缺陷性，只有帶有這些基因的轉(zhuǎn)化體才能在選擇培養(yǎng)基上生活具有細(xì)菌的復(fù)制起始點(diǎn)和選擇標(biāo)記基因。YAC 載體通常含有ColE1 的ori 和氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因，可以在大腸桿菌中復(fù)制和繁殖，所以它也是一種穿梭載體。（2）優(yōu)越性：YAC 能夠容納長達(dá)上千kb 的外源DNA，這是質(zhì)粒和黏粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時(shí)能夠減少完整基因組文庫所需的克隆數(shù)目。40為什么野生型的噬菌體DNA 不宜作為基因工程載體?答：(1) 噬菌體DNA 沒有容載能力，因?yàn)槭删w的頭部對DNA 包裝的量是有限制的，不能大于基因組的1

23、05，所以要將噬菌體改造成載體，必須削減本身的分子大??；(2) 野生型的DNA 對于一些常用的酶都有多個識別和切割位點(diǎn)，不便于克?。?3) 沒有可供選擇的標(biāo)記；(4) 野生型的噬菌體具有感染性，因此不夠安全。33什么是YAC？YAC 克隆載體常出現(xiàn)哪些問題？答：YAC 即酵母人工染色體（Yeast Artificial Chromosome）的縮寫，是人工構(gòu)建的染色體樣大容量克隆載體，基本組成有著絲點(diǎn)、能在細(xì)菌和酵母中進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制起始點(diǎn)和選擇標(biāo)記及端粒。最大DNA 克隆片段可達(dá)到2000kb。問題有：(1) YAC 有嵌合現(xiàn)象，一個YAC 中克隆的DNA 片段可能來自兩個或多個不同的染色體。

24、在基因組文庫中，嵌合體占克隆總數(shù)的1060。(2) YAC 內(nèi)部有重組現(xiàn)象，插入的DNA 較大，序列發(fā)生重排，導(dǎo)致和原來染色體的序列不一致，重組很難檢出。(3) YAC 還有缺失現(xiàn)象，影響YAC 文庫的代表性。(4) YAC 結(jié)構(gòu)和酵母天然染色體結(jié)構(gòu)相似，使用常規(guī)方法不易將YAC 和酵母天然染色體分開。(5) 構(gòu)建好的YAC 轉(zhuǎn)化原生質(zhì)化的酵母菌，轉(zhuǎn)化效率低。(6) 建好庫后保存方便，但要篩選某個基因時(shí)工作量大32由于基因工程是人為改變遺傳信息的操作，因此必須注意被操作基因的安全。進(jìn)行嚴(yán)格地監(jiān)控對質(zhì)粒載體的安全是十分重要的。請問質(zhì)粒載體的安全條件包括哪幾個方面?答：(1) 非傳遞性和不被帶動轉(zhuǎn)

25、移。對于多數(shù)基因克隆操作來說，都不希望載體能夠進(jìn)行自主傳遞，也不希望被帶動轉(zhuǎn)移。(2) 具有條件致死突變，如溫度敏感質(zhì)粒pJC307 (ColE1 的衍生質(zhì)粒) 在哺乳動物正常體溫下就喪失復(fù)制能力，可防止克隆基因擴(kuò)散，只存在于限定的宿主細(xì)胞中。(3) 一般情況下不希望與宿主染色體發(fā)生重組，因?yàn)橹亟M后有可能給宿主帶來突變。(4) 有較小的宿主范圍。34什么是 BAC？BAC 載體的組成與優(yōu)缺點(diǎn)有哪些？ 細(xì)菌人工染色體（BAC）是從大腸桿菌F 因子改造構(gòu)建而來的，能夠攜帶大約300kb 的DNA 插入片段。 載體具有 F 因子的復(fù)制起始點(diǎn)（oriS），可使載體維持每個細(xì)胞一個拷貝的水平。 載體包括

26、有 4 個維持DNA 復(fù)制和拷貝數(shù)目的基因，repE, parA, parB and parC。 具有一個抗生素選擇標(biāo)記基因，和 lacZ基因。在lacZ基因中組裝有一多克隆位點(diǎn)，便于外源片段的插入和藍(lán)白反應(yīng)篩選克隆子。 插入的 DNA 片段非常穩(wěn)定，可以在大腸桿菌細(xì)胞中維持?jǐn)?shù)百代，而且不易發(fā)生重組和從寄主細(xì)胞中丟失。 主要缺點(diǎn)是每個細(xì)胞中的拷貝數(shù)少（12 個），使得分離和篩選較為困難。35利用pBR322 質(zhì)粒插入失活分離帶有外源DNA 片段的重組克隆的原理是什么？ 外源 DNA 片段插入在pBR322 質(zhì)粒tetr 基因的編碼序列內(nèi)（BamHI）位點(diǎn)，使該基因失活； 體外重組反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化

27、大腸桿菌 ampstets 菌株，并涂布在amp 瓊脂平板上，凡獲得了pBR322質(zhì)粒和重組質(zhì)粒(AmprTets)的寄主細(xì)胞都可長成菌落； 將 amp 瓊脂上的菌落原位影印在tet 瓊脂平板上生長，對比這兩個平板的菌落生長情況，凡在amp平板上能夠生長而在tet 平板上不能生長的菌落，便是屬于帶有重組體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子克?。惶舫鲞@樣的陽性克隆，擴(kuò)增分離帶有外源DNA 插入片段的重組體質(zhì)粒。46分離DNA 時(shí)，為什么要在緩沖液中加入一定濃度的EDTA 和蔗糖？答： EDTA 是螯合劑，可同Mg2+螯合，使核酸酶失去了作用的輔助因子，而被抑制活性。 蔗糖增加緩沖液的黏度，保護(hù)DNA 不易斷裂。36p

28、UC 質(zhì)粒利用-互補(bǔ)作用篩選重組子原理是什么？答：pUC 系列質(zhì)粒載體是在pBR322 質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上改造來的，它用lacZ基因取代了pBR322質(zhì)粒載體上的tetr 基因。lacZ基因編碼-半乳糖苷酶的N 末端1-63 個氨基酸(-肽鏈)的DNA 片段, 在lacZ基因內(nèi)組入了一個多克隆位點(diǎn)（MCS），但不影響lacZ基因的功能。 pUC 載體的宿主（E. coli）攜帶一個編碼-半乳糖苷酶C 端序列的基因片段, 它們本身用這個基因片段產(chǎn)生的-半乳糖苷酶片段是無活性的, 但它們可以通過-互補(bǔ)作用在體內(nèi)相互彌補(bǔ), 即兩部分產(chǎn)物可以結(jié)合形成有活性的-半乳糖苷酶。當(dāng)pUC 質(zhì)粒引入大腸桿菌中，在含

29、有指示劑X-gal 和 IPTG 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，菌落成藍(lán)色。如果在MCS 插入外源DNA 片段（基因），破壞了lacZ基因的功能（插入失活），不再產(chǎn)生-肽鏈，不能和宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽片段形成有活性的-半乳糖苷酶，形成的菌落是無(白)色的。因此，根據(jù)這種-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，便可以檢測出含有外源DNA 插入序列的重組體克隆。37自然界中具備理想條件的質(zhì)粒載體為數(shù)不多，即使是ColE1 和pSCl01 這兩個自然質(zhì)粒也不盡如人意，通常需要進(jìn)行改造。請問質(zhì)粒改造包括哪些基本內(nèi)容?答：基本內(nèi)容包括：(1) 刪除一些非必要的區(qū)段及對宿主有不良影響的區(qū)段；削減載體的分子質(zhì)量，使載體具有更大的容納

30、外源片段的能力。(2) 加上易于選擇或檢測的標(biāo)記。(3) 限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)的改造，便于外源基因插入到載體中的特定位置。(4) 加上一些調(diào)控元件，有利于克隆基因的表達(dá)。(5) 安全性改造，限定載體的宿主范圍。42噬菌體載體具有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足?答：優(yōu)點(diǎn)：(1) 基因組中有13 的非必需區(qū)可以被置換。改造成載體后，克隆的片段較大(可 達(dá)20kb)，而質(zhì)粒載體的克隆片段只有幾個kb；(2) 用噬菌體DNA 作為載體，即使不進(jìn)行體外包裝，轉(zhuǎn)染的頻率也比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的效率高，包裝后的效率就更高了；(3) 可通過溶原化反應(yīng)整合到寄主染色體上，當(dāng)不需要外源基因大量表達(dá)時(shí)，可讓 它以溶原性存在，若要表達(dá)，

31、可通過誘導(dǎo)即可進(jìn)入裂解途徑，釋放出大量的噬菌體，得到的重組DNA 的拷貝數(shù)就會很多。缺點(diǎn)：(1) 包裝比較麻煩，包裝率不穩(wěn)定，購買包裝蛋白的費(fèi)用高；(2) 沒有質(zhì)粒的用途廣泛。43以置換型噬菌體作為載體進(jìn)行克隆時(shí)，為什么說能夠形成噬菌斑的就一定是重組體?答：改造的置換型噬菌體載體，重組入外源片段之后，總體積不能超過入基因組的105，不能小于又基因組的75。以置換型噬菌體DNA 作為載體，首先要分離左、右兩臂同外源DNA 重組。如果沒有外源片段，僅是兩臂連接，長度短于久基因組的75，不能被包噬菌體顆粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后，總長度超過基因組105后，也不能包入

32、噬菌體顆粒，自然也不能形成噬菌斑。44M13 系列載體具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)?答：M13 克隆系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn)：(1) 克隆的片段大：M13 噬菌體的DNA 在包裝時(shí)不受體積的限制，所以容載能力大。有報(bào)道，有些噬菌體顆?？梢园b比野生型絲狀噬菌體DNA 長67 倍的 DNA(插入片段可達(dá)40kb)。(2)可直接產(chǎn)生單鏈DNA，這對于DNA 測序、DNA 誘變、制備特異的單鏈DNA 探針都是十分有用的。(3) 單鏈DNA 和雙鏈DNA 都可以轉(zhuǎn)染宿主，并可根據(jù)人工加上的選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選。M13 克隆系列的不足：(1) 較大的外源片段插入后，在擴(kuò)增過程中往往不夠穩(wěn)定。一般說，克隆的片段越大，發(fā)生丟失的概率

33、越大。(2) 單鏈載體分子感染的細(xì)胞中，往往是單鏈和雙鏈混雜，分離雙鏈比較麻煩。45黏粒載體具有哪些特點(diǎn)與不足?答：主要特點(diǎn)有： 柯斯質(zhì)粒是含有噬菌體 COS 位點(diǎn)的質(zhì)粒載體?？滤官|(zhì)粒具有質(zhì)粒的復(fù)制子，進(jìn)入寄主細(xì)胞后能夠像質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制，并且能夠被氯霉素?cái)U(kuò)增。 具有質(zhì)粒載體的抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記和克隆位點(diǎn)。 插入片段的消化、連接及后來重組克隆的純化與質(zhì)粒載體相同。 具有噬菌體的包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。與質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞不同，重組體像 載體一樣，需體外包裝后轉(zhuǎn)染細(xì)菌。 包裝后形成的 顆粒用來感染大腸桿菌，重組DNA 像DNA 一樣注入細(xì)菌細(xì)胞，并以COS位點(diǎn)環(huán)化。由于缺乏 的其他DNA 序列，

34、環(huán)化DNA 在細(xì)菌體內(nèi)以質(zhì)粒一樣維持。 簡化了篩選。載體體積小，承載外源 DNA 片段大。如果載體的分子質(zhì)量在5kb 的話，得到的轉(zhuǎn)導(dǎo)子幾乎排除由載體自連的可能性，因?yàn)橐怀晒Πb，至少要7 個分子的載體自連。盡管如此，也是不能被包裝的，因?yàn)镃OS 位點(diǎn)太多了。重組體只有達(dá)到32-45kb 才能有效包裝體外包裝，這就提供了對重組體的正向選擇。 對轉(zhuǎn)化體的選擇是基于載體上的抗生素標(biāo)記。 感染后形成菌落，而不是噬菌斑。黏粒載體也有如下不足： 如果兩個黏粒之間有同源序列，可能會發(fā)生重組，結(jié)果會使被克隆的片段重排或丟失。 含不同重組 DNA 片段的菌落生長速度不同，會造成同一個平板上菌落大小不一。另外

35、由于不同大小的插入片段對宿主細(xì)胞的作用不同，會造成文庫擴(kuò)增量的比例失調(diào)。 包裝過程復(fù)雜，包裝效率不穩(wěn)定，代價(jià)高。47分離DNA 用酚抽提蛋白質(zhì)時(shí)，離心后，為什么蛋白質(zhì)總是停留在水相和酚相之間？答：酚使蛋白質(zhì)分子間脫水而變性，變性蛋白的密度比水大，但比酚小，因此停留在中間層。39噬菌體DNA 被包裝到噬菌體的頭部需要哪些基本條件？為什么？答：兩個cos 位點(diǎn)；線性DNA；分子大小在噬菌體基因組的75%105%。48為什么從細(xì)胞中分離DNA 時(shí)往往會斷裂？答：(1) 胞內(nèi)存在很高的核酸酶活性，DNA 裸露后，很容易遭到核酸酶的降解。(2) 在分離DNA 的過程中，要用到一些酸堿等化學(xué)試劑，也會使D

36、NA 斷裂。(3) 在DNA 的分離過程中要經(jīng)過多次離心、吸取、轉(zhuǎn)移等，產(chǎn)生的機(jī)械張力剪切會使DNA 斷裂。49在DNA 分離過程中，酚通常與氯仿聯(lián)合使用，即使不聯(lián)合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次，為什么?答：原因是酚和水有一定程度的互溶，所以單獨(dú)使用酚抽提DNA，最終不能除去酚，殘留的酚會使起切割和連接作用的限制性內(nèi)切核酸酶和連接酶變性。氯仿也是蛋白質(zhì)變性劑，它不與水互溶，但是能夠同苯酚互溶。這樣，酚和氯仿聯(lián)合使用，就可以帶走殘留的酚。50何謂簡并引物 (degenerate primer)?答：所謂簡并引物是指根據(jù)肽鏈的氨基酸序列(或部分序列)，并充分考慮密碼子的簡并性而設(shè)計(jì)的、用于

37、PCR 擴(kuò)增的混合引物群體，這種混合引物之間具有不同的堿基組成，但堿基的數(shù)量是相同的。由于充分考慮了密碼的簡并性，在這種混合引物中必定有一種引物是可以和該基因的DNA 序列精確互補(bǔ)。51簡并引物設(shè)計(jì)的一般原則是什么?答：(1) 選擇保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物。(2) 選擇簡并性低的氨基酸密碼區(qū)設(shè)計(jì)引物。(3) 注意密碼的偏愛性。(4) 使用盡可能短的引物，以降低簡并性，最短可用1520 個堿基。(5) 由于Taq DNA 聚合酶在PCR 擴(kuò)增時(shí)容易摻入錯誤堿基，所以設(shè)計(jì)的引物，其3端盡量使用具有簡并密碼的氨基酸。52如何用PCR 制備突變DNA 分子?答：可用PCR 進(jìn)行定點(diǎn)突變 (Site Dire

38、cted Mutagenesis)，即在特定位點(diǎn)引入點(diǎn)突變。該突變可以是堿基替代、插入或者缺失。為了在靶基因特定位點(diǎn)導(dǎo)入突變，在PCR 引物設(shè)計(jì)時(shí)，將一條引物設(shè)計(jì)成與靶序列互補(bǔ)但在預(yù)期位點(diǎn)作堿基替換或缺失。在引物中的誘發(fā)突變序列應(yīng)該位于引物的5端或在引物中間部位，但絕不能位于3端。誘變引物的3區(qū)域(至少610 個堿基)必須與靶DNA 完全互補(bǔ)以使引物與模板的退火完全而且Taq 酶能延伸引物。PCR 反應(yīng)先在低特異性環(huán)境下反應(yīng)510 個循環(huán)以使錯配得以發(fā)生(即在松弛的溫度下)，一旦少量的突變模板產(chǎn)生，就可以作為靶序列與引物完全互補(bǔ)。擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物即是所需的含有突變的擴(kuò)增DNA 分子，然后通過克

39、隆和序列分析進(jìn)行確證。53 用PCR 技術(shù)擴(kuò)增目的DNA 片段時(shí)，需要一對特意合成的引物來限定目的片段的擴(kuò)增區(qū)域，試說明引物序列合成應(yīng)遵循什么樣原則。答：1）引物長度一般為1530 個核苷酸。2）引物的堿基盡可能隨機(jī)， G+C 含量一般占4555。Tm4(G+C)+ 2(A+T)3）引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。4）兩個引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊。5）引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不超過70，引物3末端連續(xù)8 個堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。6）引物3端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板DNA 配對。7）引物與模板結(jié)

40、合時(shí)，引物的5端最多可以游離十幾個堿基而不影響PCR 反應(yīng)的進(jìn)行。8）引物的5端可以修飾，如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)等。56怎樣將一個平末端的DNA 片段插入到EcoR I 的限制位點(diǎn)中去？答：可以化學(xué)合成一個連接子（linker），即一段長為lObp 含有EcoR I 識別位點(diǎn)的短的DNA 片段，然后與待克隆片段兩端連接起來，如果用EcoR I 切割這種連接片段，就會產(chǎn)生EcoR I 的單鏈末端。這種片段就可以插入到任何EcoR I 的限制性核酸內(nèi)切酶位55TaqMan 定量 PCR 擴(kuò)增的原理是什么？答：TaqMan 定量 PCR 使用3 個引物，或兩個引物和一個特異性探針。兩個引物接

41、合到目的DNA上下游，以進(jìn)行目的DNA 的合成。第三個引物，或稱探針，是特異合成的一段短的DNA 片段，可特異性第接合到一條DNA 鏈中間。探針帶有兩個修飾基團(tuán)，5端熒光報(bào)告基團(tuán)（R）和3端的熒光淬滅基團(tuán)（Q），這兩個基團(tuán)由于距離靠近會發(fā)生熒光淬滅而檢測不到熒光。隨著PCR 的進(jìn)行， TaqMan探針接合到目的DNA 序列上，并且被具有外切酶活性的Taq DNA 酶逐個切除而降解。被切下來的熒光基團(tuán)（R）解除了熒光淬滅的束縛，會在激發(fā)光下發(fā)出熒光，因此所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度直接反應(yīng)了擴(kuò)增靶DNA 的總量。54PCR 技術(shù)體外擴(kuò)增DNA 分子的基本原理是什么？答：PCR 是在試管中進(jìn)行的DNA 復(fù)制反

42、應(yīng)，基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA 半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外DNA 分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA 變成單鏈，單鏈DNA 與人工合成的引物退火，然后耐熱DNA 聚合酶以dNTP 為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR 全過程每一步的轉(zhuǎn)換是通過溫度的改變來控制的。需要重復(fù)進(jìn)行DNA 模板解鏈、引物與模板DNA 結(jié)合、DNA 聚合酶催化新生DNA 的合成，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸個步驟構(gòu)成PCR 反應(yīng)的一個循環(huán)，此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行，就可使目的DNA 得以迅速擴(kuò)增。DNA 模板變性：模板雙鏈DNA®單鏈DNA，94。

43、退火：引物單鏈DNA®雜交鏈，引物的Tm 值。引物的延伸：溫度至70 左右， Taq DNA 聚合酶以種dNTP 為原料，以目的DNA 為模板，催化以引物末端為起點(diǎn)的53DNA 鏈延伸反應(yīng)，形成新生DNA 鏈。新合成的引物延伸鏈經(jīng)過變性后又可作為下一輪循環(huán)反應(yīng)的模板PCR，就是如此反復(fù)循環(huán)，使目的DNA 得到高效快速擴(kuò)增。57構(gòu)建基因組文庫時(shí)為什么要對基因組DNA 進(jìn)行部分酶切？（列舉至少兩條理由）答：部分酶切可獲得長度適宜的片段（如獲得中等長度的酶切片段）；部分酶切可保證切出的DNA 片段內(nèi)部依然保留了部分限制酶位點(diǎn)，便于后續(xù)的克隆分析。58什么是基因組文庫(genomic lib

44、rary)？它同遺傳學(xué)上的基因庫有什么不同?答：基因組文庫是用基因工程的方法，人工構(gòu)建的含有某一生物基因組DNA 的各種片段的克隆群。包括下列過程：高分子質(zhì)量染色體DNA 的制備；體外重組連接；將重組DNA 導(dǎo)入寄主細(xì)胞并擴(kuò)增；篩選。基因組文庫同遺傳學(xué)上所講的基因庫是完全不同的概念。基因庫(gene poo1)是指在進(jìn)行有性生殖的某一群體中，能進(jìn)行生殖的個體所含總的遺傳信息。在基因組文庫的構(gòu)建中，由于使用的載體不同，分為噬菌體載體和黏粒載體構(gòu)建的基因組文庫、YAC 文庫、BAC 文庫等。61如何使用甲基化酶對克隆DNA 進(jìn)行保護(hù)？有什么意義？答：在構(gòu)建基因文庫時(shí)，可用與接頭中限制性內(nèi)切核酸酶相

45、應(yīng)的甲基化酶對克隆DNA 先進(jìn)行甲基化修飾，將插入片段上該酶可能的識別序列先行保護(hù)起來。意義：用這種方法，不僅保護(hù)了插入片段的大小不會改變，又有利于插入片段的回收，因?yàn)椴迦肫沃刑囟ㄏ拗菩詢?nèi)切核酸酶的識別位點(diǎn)被保護(hù)起來，重組后可以用特定的限制性內(nèi)切核酸酶將插入片段回收。59什么是cDNA 文庫？同基因組文庫有何差別?答：同mRNA 互補(bǔ)的DNA 稱為cDNA。cDNA 文庫是以某一生物的總mRNA 為模板，在無細(xì)胞系統(tǒng)中，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，首先合成一互補(bǔ)的DNA，即第一鏈，破壞RNA 模板后，再以第一鏈為模板合成第二鏈，得到的雙鏈DNA 稱為cDNA。選用適合的載體，將合成的cDNA 重組導(dǎo)

46、入寄主細(xì)胞，經(jīng)篩選得到的cDNA 克隆群稱為cDNA 文庫。由于cDNA 技術(shù)合成的是不含內(nèi)含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一種通用方法。由于細(xì)胞內(nèi)的基因在表達(dá)的時(shí)間上并非是統(tǒng)一的，具有發(fā)育的階段性和時(shí)間性，有些則需要特殊的環(huán)境條件。所以，cDNA 文庫是不可能構(gòu)建得十分完全的，也就是說，任何一個cDNA 文庫都不可能包含某一生物的全部編碼基因。cDNA 文庫與基因組文庫的主要差別是：(1) 基因組文庫克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA 序列；cDNA 文庫克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因，包括調(diào)節(jié)基因。(2) 基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時(shí)空影響；cDNA 文庫克隆的是不

47、完全 的編碼DNA 序列，因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響。(3) 基因組文庫中的編碼基因是真實(shí)基因，含有內(nèi)含子和外顯子；而cDNA 克隆的是不含內(nèi)含子的基因。62何為稀有酶？（舉例說明）答：所謂稀有酶是指那些識別序列在基因組DNA 中不常見的酶，因此它們的切割頻率較低。如Not I 就是最常用的稀有酶，它的識別序列為GCGGCCGC。另外有些酶的識別序列雖然不長，但它的識別序列很特別，在基因組出現(xiàn)的頻率較低。如Nru I (TCGCGA)和BssH II (GCGCGC)，它們的靶序列在哺乳動物基因組中出現(xiàn)的頻率極低。60什么是同聚物加尾連接法 (Homopolymer Tails Joining

48、)？ 用何種方法加尾？具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？答：所謂同聚物加尾法就是利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA 的3端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA 和載體DNA 分子要分別加上不同的寡聚核苷酸，如dA（dG）和dT（dC），然后在DNA 連接酶的作用下，連接成為重組的DNA。這種方法的核心是利用末端轉(zhuǎn)移酶的功能，將核苷酸轉(zhuǎn)移到雙鏈DNA 分子的突出或隱蔽的3'-OH上。以Mg2+作為輔助因子，該酶可以在突出的3'-OH 端逐個添加單核苷酸，如果用Co2+作輔助因子，則可在隱蔽的或平末端的3'-OH 端逐個添加單個核苷酸。同聚物加尾法實(shí)際上是一種人工黏性末端連接

49、法，具有很多優(yōu)點(diǎn)：首先不易自身環(huán)化，這是因?yàn)橥环NDNA 兩端添加的序列是相同的，所以不存在自身環(huán)化；因?yàn)檩d體和外源片段的末端是互補(bǔ)的黏性末端，所以連接效率較高；用任何一種方法制備的DNA 都可以用這種方法進(jìn)行連接。同聚物加尾法也有一些不便之處：方法繁瑣；外源片段難以回收。由于添加了許多同聚物的序列，可能會影響外源基因的表達(dá)。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端連接法一樣，重組連接后往往會產(chǎn)生某種限制性內(nèi)切核酸酶的切點(diǎn)。 ，68插入失活法和插入表達(dá)法篩選重組體的主要差別是什么？答：主要差別是：(1) 插入失活法是直接根據(jù)失活基因的表型變化來篩選重組體。(2) 插入表達(dá)法是根據(jù)一個基因的失活引起

50、另一個基因的表達(dá)表型來選擇。66構(gòu)建表達(dá)載體應(yīng)注意些什么？答：(1) 構(gòu)建表達(dá)載體的關(guān)鍵是用于表達(dá)克隆序列的啟動子類型，如果目的是基因的高效表達(dá)，就要選用強(qiáng)的啟動子；如果表達(dá)產(chǎn)物對寄主細(xì)胞有毒性，可選擇弱的啟動子，最好使用可誘導(dǎo)型啟動子，使在一定的條件下表達(dá)。(2)表達(dá)載體還應(yīng)具有以下組成元件： 攜帶能在寄主細(xì)胞中維持的復(fù)制的起始點(diǎn)。 具有抗生素選擇標(biāo)記或其他選擇機(jī)制。 在緊接啟動子的下游安排限制性位點(diǎn)，用于插入需表達(dá)的基因。 具有單一的酶切位點(diǎn)來克隆基因，克隆位點(diǎn)應(yīng)位于準(zhǔn)確的位置，以使克隆基因有效表達(dá)。67你在做Southern 印跡分析，并且剛完成了凝膠電泳這一步。根據(jù)方案，下面一個步驟是

51、用NaOH 溶液浸泡凝膠，使DNA 變性為單鏈。為了節(jié)省時(shí)間，你略過了這一步，直接將DNA 從凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。然后用標(biāo)記探針雜交，最后發(fā)現(xiàn)放射自顯影片是空白。錯在哪里？提示：轉(zhuǎn)移到膜上的DNA 未變性成單鏈DNA，不能與單鏈的探針雜交。如果你的雜交探針是雙鏈的，可能因?yàn)樵诩尤腚s交混合物之前忘記將探針變性而得到空白的放射自顯影結(jié)果。69一個攜帶有氨芐和卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒被僅在卡那霉素基因中有識別位點(diǎn)的EcoR I 消化。消化物與酵母DNA連接后轉(zhuǎn)化對兩種抗生素都敏感的E. coli 菌株。(1) 利用哪一種抗生素抗性選擇接受了質(zhì)粒的細(xì)胞？(2) 怎樣區(qū)分接受了插入酵母DNA 的質(zhì)粒的

52、克??？提示：(1) 選擇Ampr 的轉(zhuǎn)化子；(2) 所需的克隆是Ampr 和Kans。任何能夠抗這兩種藥物的克隆都是自連的非重組質(zhì)粒。70用EcoR I 和Hind III 分別切割同一來源的染色體DNA，并進(jìn)行克隆。在前者的克隆中篩選到A 基因，但在后者的克隆中未篩選到A 基因，請說明原因。提示：因?yàn)镠indH I 的切點(diǎn)位于A 基因內(nèi)。71什么是Western 印跡? 它與Southern 印跡有什么不同？提示：Western 印跡是將蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后用特異性的抗體進(jìn)行檢測。它與Southern 印跡的不同在于探針的性質(zhì)不同，在Western 印跡中使用的

53、探針是抗體(蛋白質(zhì))，而Southern 印跡中使用的探針是DNA。72用一限制性內(nèi)切核酸酶切割Lac+ Tetr 的質(zhì)粒載體，已知該酶識別的是4 個堿基序列，并產(chǎn)生有兩個堿基突出的單鏈末端，該酶在lac 基因內(nèi)有切割位點(diǎn)，并在第二個氨基酸密碼子內(nèi)，該位點(diǎn)可以被任何氨基酸所取代而不影響酶活性。用該酶切割后，用DNA 聚合酶將單鏈末端補(bǔ)齊為雙鏈的平末端，然后重新連接成環(huán)，轉(zhuǎn)化Lac- Tet- 受體菌，篩選Tetr 轉(zhuǎn)化子，問：Lac 的基因型是什么？并說明原因。提示：基因型是lac，原因是在該密碼子中插入了兩個堿基，造成了移碼突變，所以Lac 的基因是缺陷的。嚴(yán)謹(jǐn)雜交實(shí)驗(yàn)是如何控制的？答：雜交

54、反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)程度由下面兩個因素所決定：溫度和鹽濃度。強(qiáng)的堿基對能耐受高的溫度，而高的鹽濃度使弱的堿基對間的配對變得穩(wěn)定。因此，高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交在高溫和低鹽濃度下進(jìn)行，而低嚴(yán)謹(jǐn)型雜交在低溫和高鹽濃度下進(jìn)行。73RNA 與基因組DNA 復(fù)性已被廣泛用于檢測不同類DNA 的轉(zhuǎn)錄。DNA 驅(qū)動的復(fù)性實(shí)驗(yàn)與RNA 驅(qū)動的復(fù)性實(shí)驗(yàn)有何不同？答：在過量DNA 雜交(DNA 驅(qū)動雜交)實(shí)驗(yàn)中，基因組DNA 的復(fù)性過程中加入少量的放射性標(biāo)記RNA。因?yàn)镈NA 的量大大超過RNA，所以全部RNA 能夠與DNA 雜交。同樣道理，RNA 驅(qū)動的雜交反應(yīng)中RNA 過量而DNA 的量受到限制，所以所有的互補(bǔ)DNA 鏈都能與R

55、NA 雜交。74在基因工程中，為了在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)真核生物的基因產(chǎn)物，為什么通常要用cDNA 而不用基因組DNA? 為什么要在cDNA 前加上細(xì)菌的啟動子？答：這是因?yàn)榧?xì)菌沒有內(nèi)含子剪接系統(tǒng)，并且不能識別真核生物的啟動子的原因。75如何根據(jù)下面的應(yīng)用設(shè)計(jì)探針？(1) 假定你分離純化了一未知功能的蛋白質(zhì)，需要確定是何種組織和細(xì)胞表達(dá)這種蛋白質(zhì)。(2) 假定你獲得了綿羊的胰島素mRNA，如何進(jìn)一步從人的cDNA 文庫中獲得含人胰島素的克隆并使之在E. coli 中表達(dá)?提示：(1) 首先對該蛋白質(zhì)進(jìn)行部分測序，然后根據(jù)測得的氨基酸序列設(shè)計(jì)簡并引物。(2) 以該mRNA 為模板反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，

56、即可進(jìn)行標(biāo)記用作探針。76什么是遺傳學(xué)選擇法?答：所謂遺傳學(xué)選擇法（genetic selection）主要是根據(jù)受體細(xì)胞接受了重組DNA 分子后所發(fā)生的遺傳表型的變化直接選擇重組體的方法。遺傳表型的變化包括抗藥性、缺陷基因的功能互補(bǔ)表型及噬菌斑的變化等。選擇的方法主要是根據(jù)平板上可見的表型變化，用于選擇的平板包括普通抗生素平板、插入失活抗生素平板、插入表達(dá)抗生素平板、顯色平板等，由于這些方法都是直接從平板上篩選，所以又稱為平板篩選法。77單鏈RNA 作為探針，具有哪些單鏈DNA 探針?biāo)鶝]有的優(yōu)點(diǎn)？答：單鏈RNA 探針的下列優(yōu)點(diǎn)是單鏈DNA 探針?biāo)鶝]有的：(1) RNARNA 和RNADNA

57、比DNADNA 雜交體具有更高的穩(wěn)定性。因此，雜交可以在更嚴(yán)格的各件下講行雜交后的信號也比較強(qiáng)。(2) 單鏈RNA 由于不存在互補(bǔ)雙鏈的競爭性結(jié)合，所以雜交效率比較高。3) RNA 中不存在重復(fù)序列，所以特異性比較高。(4) 雜交后可用RNase 消化掉未雜交的RNA，因此降低了本底。78良好的固相支持物 (如硝酸纖維素濾膜、尼龍膜) 必須具備哪些優(yōu)良特性？答：(1) 同核酸分子具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，一般要求每平方厘米結(jié)合核酸分子的量在10g 以上。(2) 與核酸分子結(jié)合后，不影響其同探針分子雜交的反應(yīng)。(3) 與核酸分子的結(jié)合牢固，能經(jīng)受得住雜交、洗滌等過程而極少脫落。(4) 非特異性吸附少，

58、在洗膜條件下，能將非特異性吸附在其表面的探針分子洗脫。(5) 具有良好的機(jī)械性能，不宜破碎。16 簡述以黏粒為載體構(gòu)建基因文庫的原理。(1)COS位點(diǎn)可以自身環(huán)化(2)可以利用COS位點(diǎn)包裝l噬菌體顆粒；(3)可以感染寄主細(xì)胞；(4)利用質(zhì)粒復(fù)制子復(fù)制，不整合、不裂解。79以硝酸纖維素濾膜 (Nitrocellulose Filter Membrane) 作為雜交的固相支持物具有哪些優(yōu)、缺點(diǎn)?答：優(yōu)點(diǎn)：(1) 硝酸纖維素濾膜具有較強(qiáng)的吸附單鏈DNA 和RNA 的能力，特別在高鹽溶液中，結(jié)合能力達(dá)到80100gcm2。(2) 雜交信號本底較低。由于硝酸纖維素濾膜非特異性吸附蛋白質(zhì)的能力較弱，因此特別適合于那些涉及蛋白質(zhì)作用(如抗體和酶等)的非放射性標(biāo)