雙核銅配合物選擇性抑制TCPTP及其細(xì)胞效應(yīng)研究

1、雙核銅配合物選擇性抑制 TCPTP 及其細(xì)胞效應(yīng)研究【摘要】：蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)能廣泛影響細(xì)胞增殖、分化、遷 移、凋亡及免疫應(yīng)答等過(guò)程。許多疾病諸如糖尿病、癌癥、肥胖、類 風(fēng)濕和免疫功能紊亂等都與 PTPs 的異常表達(dá)有關(guān)。有效抑制 PTPs 的活性能夠提高細(xì)胞磷酸化水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 T 細(xì)胞蛋白酪氨 酸磷酸酶(TCPTP)是一種胞內(nèi)非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶。由于它在 控制炎癥和調(diào)控腫瘤方面的重要作用，近年來(lái),TCPTP 抑制劑的研究受 到人們的廣泛關(guān)注。研究表明銅配合物具有很強(qiáng)的PTP 抑制活性，因此以 TCPTP 為靶點(diǎn)研究銅配合物的抗癌活性及機(jī)理為開(kāi)發(fā)新型銅配 合物抗癌

2、藥物提供理論依據(jù)?；陔p核銅配合物Cu2( -IDA)(phen)3(NO3)NO3 4H2O(phen=1,10-phenanthro-line,H2lDA=iminodiaceticacid)(1)能夠有效而且選擇性抑制體外重組TCPTP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文進(jìn)一步研究了該配合物對(duì)四種腫瘤細(xì)胞內(nèi)TCPTP 的抑制活性和選擇性及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，初步建立裸鼠異種移植瘤模型，并且研究了活體水平上該配合物的抗腫瘤活性及對(duì) 組織內(nèi) TCPTP 的抑制活性。主要工作和研究結(jié)果如下1、運(yùn)用 MTT染色法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞活力，研究了配合物 1 對(duì)人乳腺癌細(xì)胞(MCF7)、 宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、肝癌

3、細(xì)胞(HepG2)、腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞(U251)的抑制 增殖情況。結(jié)果表明：配合物 1 對(duì)四種腫瘤細(xì)胞均有抑制增殖作用并 且呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴關(guān)系，但是對(duì)不同細(xì)胞抑制作用的強(qiáng)弱程度不 同。配合物 1對(duì) HeLa 細(xì)胞的抑制增殖效果最強(qiáng)，對(duì) U251 細(xì)胞的抑制yiT論女第表匸家增殖效果最弱。銅離子對(duì)四種腫瘤細(xì)胞的抑制增殖效果不明顯，配體對(duì)四種腫瘤細(xì)胞有抑制增殖作用但是相同條件下抑制增殖效果明顯 弱于配合物。2、運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)和 AnnexinV-PI 雙染法研究了配合 物 1 對(duì)四種腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡能力。結(jié)果表明：配合物 1 在作用 12h 后對(duì)四種腫瘤細(xì)胞均有誘導(dǎo)凋亡效果且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。配

4、合 物 1 對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡能力具有選擇性。濃度為 10 的配合物 1 作用 12h 后,MCF7 細(xì)胞的晚期凋亡比例高達(dá) 89.5%,而 U251 的 晚期凋亡比例為 49.5%。相同濃度和作用時(shí)間下銅離子和配體對(duì)四種 腫瘤細(xì)胞基本沒(méi)有誘導(dǎo)凋亡效果。3、運(yùn)用蛋白免疫印跡法檢測(cè)配合 物 1 對(duì)四種腫瘤細(xì)胞內(nèi) PTPs 的抑制活性及選擇性。結(jié)果表明：配合 物 1 能選擇性抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi) TCPTP 的活性且對(duì)不同種細(xì)胞有選擇 性。在配合物 1 濃度達(dá)到 10 訕 作用 7h 后,MCF7 細(xì)胞內(nèi) TCPTP 底物 的磷酸化水平明顯升高,PTPIB 底物的磷酸化水平基本沒(méi)有變化。而 U25

5、1 細(xì)胞則在配合物 1 的濃度達(dá)到 5 訕 時(shí) TCPTP 底物的磷酸化水 平明顯升高。此外配合物 1 作用 7h 后腫瘤細(xì)胞內(nèi) EGFR 的表達(dá)量也 升高,泛素的表達(dá)量基本沒(méi)有變化。說(shuō)明配合物1 可能通過(guò)選擇性抑制細(xì)胞內(nèi)的 TCPTP 進(jìn)而影響細(xì)胞新陳代謝除作用于 TCPTP 外配合 物還可能作用于 EGFR 上游靶標(biāo)影響 EGFR 在細(xì)胞中的表達(dá)。配合物 1 不通過(guò)抑制蛋白酶體抑制細(xì)胞增殖。4、初步構(gòu)建裸鼠 MCF7 細(xì)胞 異種移植瘤模型，研究了配合物 1 的抗腫瘤活性和其對(duì)模型鼠各組織 內(nèi) TCPTP 的抑制活性。初步判斷在活體水平上，配合物 1 有一定的抗 腫瘤效果,能抑制瘤體內(nèi) TC

6、PTP 的活性影響 EGFR 的表達(dá)量?！娟P(guān)鍵詞】：雙核銅配合物 TCPTP 選擇性腫瘤細(xì)胞【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)【學(xué)位級(jí)別】：碩士【學(xué)位授予年份】：2013【分類號(hào)】：O641.4【目錄】 ： 中文摘要 12-14ABSTRACT14-17 英文縮略一覽表 17-18 第 一章綜述 18-281.1 蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs 簡(jiǎn)介 18-221.1.1PTPS 的結(jié) 構(gòu)特征 18-191.1.2PTPS 的催化機(jī)理 19-201.1.3PTPS 分類 201.1.4TCPTP簡(jiǎn)介 20-221.1.4.仃 CPTP 結(jié)構(gòu)特征 20-211.1.4.2TCPTP 功能及研究現(xiàn)狀21- 2

7、21.2 金屬銅配合物 22-241.2.1 銅配合物抗癌藥物的研究歷程22- 241.2.2 銅配合物抑制 PTP 酶活性 241.3 本論文的設(shè)計(jì)思路和研究?jī)?nèi)容 24-281.3.1 設(shè)計(jì)思路 24-251.3.2 研究?jī)?nèi)容 25-28 第二章雙核銅配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響 28-382.1 細(xì)胞增殖及檢測(cè)方法 28-302.1.1 細(xì)胞增殖 282.1.2 細(xì)胞增殖的檢測(cè)方法28-302.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器30-312.2.1實(shí)驗(yàn)試劑302.2.2實(shí)驗(yàn)儀器30-312.3實(shí)驗(yàn)內(nèi)容31-322.3.1溶 液配制 312.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 31-322.3.3MTT 法檢測(cè)雙核銅配合物對(duì)腫

8、瘤細(xì)胞增殖的影響 322.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 32-362.4.1 雙核銅配合物對(duì)MCF7 細(xì)胞增殖的影響 32-332.4.2 雙核銅配合物對(duì) HeLa、HepG2、U251 細(xì)胞增殖的影響 33-362.5 小結(jié) 36-38 第三章雙核銅配合物對(duì)腫C 易發(fā)表用yiT論女第表匸冢瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用研究 38-483.1 細(xì)胞凋亡及檢測(cè)方法 38-413.1.1 細(xì)胞凋亡 383.1.2 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法 38-413.2 細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 通路41-43321線粒體通路41-42322內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路42323死亡受體 通路42-433.3實(shí)驗(yàn)試劑及儀器43331實(shí)驗(yàn)試劑43332實(shí)驗(yàn)儀器

9、433.4實(shí)驗(yàn)內(nèi)容43-44341溶液配制 43-44342 細(xì)胞培養(yǎng) 44343 流式 細(xì)胞術(shù)檢測(cè)雙核銅配合物對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用的影響443.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 44-473.5.1 雙核銅配合物對(duì) MCF7 細(xì)胞凋亡的影響 44-453.5.2 雙核銅配合物對(duì) HeLa、HepG2、U251 細(xì)胞凋亡的影響 45-473.6 小結(jié)47- 48 第四章雙核銅配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi) PTPs 的抑制作用研究48- 604.1 蛋白免疫印跡 48-494.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 494.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑及 材料 494.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器 494.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 49-544.3.1 常用試劑溶液的配制49

10、- 514.3.2 收集細(xì)胞提取蛋白 51-524.3.2.1 培養(yǎng)細(xì)胞，加藥 514.3.2.2 收集細(xì)胞，裂解 514.3.2.3BCA 法測(cè)定蛋白濃度 51-524.3.3 蛋白免疫印跡52-544.3.3.1 電泳 52-534.3.3.2 電轉(zhuǎn) 534.3.3.3 麗春紅染色 534.3.3.4 封閉 53-544.3.3.5 孵育抗體 544.3.3.6ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影曝光 544.4 實(shí) 驗(yàn)結(jié)果與討論 54-584.4.1 雙核銅配合物對(duì) MCF7 細(xì)胞內(nèi) PTPs 的抑制 作用研究 54-564.4.2 雙核銅配合物對(duì) HeLa、HepG2、U251 細(xì)胞內(nèi) PTPs 的抑制作用研究 56-584.5 小結(jié) 58-60 第五章雙核銅配合物對(duì)異種移植 瘤模型鼠的影響60-665.1實(shí)驗(yàn)材料 60-615.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物 605.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 60-615.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 61-625.2.1 溶液配制 615.2.2 銅配 合物急性毒性實(shí)驗(yàn)61-625.2.3 構(gòu)建異種移植瘤模型 625.2.4 給藥625.2.5 提取組織蛋白 625.2.6 蛋白免疫印跡 625.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 62-645.3.1瘤體體積變