ELISA_雙抗夾心法檢測抗原

1、 酶聯(lián)免疫吸附實驗酶聯(lián)免疫吸附實驗 (E Enzyme-nzyme-L Linked inked I ImmunommunoS Sorbent orbent A Assay ssay ，ELISAELISA) 一種固相酶免疫測定技術(shù)，利用酶標(biāo)記的抗原或者抗體，在固相載體上定量或定性測定特異性抗體、可溶性抗原及細(xì)胞表面抗原。1971年由瑞典學(xué)者Engrall和Perlmann,荷蘭學(xué)者weeman和Schuurs報道；開創(chuàng)了運(yùn)用酶標(biāo)記免疫技術(shù)進(jìn)行液體標(biāo)本中微量物質(zhì)測定的實驗方法； ELISA-測抗原（Ag）或抗體（Ab）三要素o抗原或抗體的固相化：已知的Ag/Ab結(jié)合到固相載體表面，并保持其免疫

2、活性；o抗原或抗體的酶標(biāo)記：酶標(biāo)Ag/Ab,并保持其免疫活性和酶活性；o底物顯色：底物被酶催化成為有色產(chǎn)物定性和定量 放大免疫反應(yīng)的信號高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性， pg水平微量檢測定性定量檢測：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值基本特點基本特點 抗體測定法抗體測定法 間接法檢測特異性抗體 抗原測定法抗原測定法 直接競爭法檢測可溶性抗原 雙抗體夾心法檢測可溶性抗原 （改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原） 應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法 抗體測定法抗體測定法 間接法檢測特異性抗體間接法檢測特異性抗體 抗原測定法抗原測定法 直接競爭法檢測可溶性抗原 雙抗體夾心

3、法檢測可溶性抗原 （改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原） 應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法間接法檢測特異性抗體間接法檢測特異性抗體包被已知抗原與待測抗體孵育與酶標(biāo)抗體孵育加入底物包被已知抗原優(yōu)點: 只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法 操作簡單迅捷缺點： 可重復(fù)性差 通常用于抗體效價的檢測和某些疾病的早期診斷 抗體測定法抗體測定法 間接法檢測特異性抗體 抗原測定法抗原測定法 直接競爭法檢測可溶性抗原直接競爭法檢測可溶性抗原 雙抗體夾心法檢測可溶性抗原 （改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原） 應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法直接競爭直接競爭法檢測可溶性抗原法檢測可

4、溶性抗原原理：原理：待檢抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合；待檢抗原含待檢抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合；待檢抗原含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。優(yōu)點：優(yōu)點：待檢抗原只需要一個抗原決定簇，適合小分子待檢抗原只需要一個抗原決定簇，適合小分子抗原，如，激素，藥物等；抗原，如，激素，藥物等；操作步驟簡單快捷，只需要一個保溫洗滌過程操作步驟簡單快捷，只需要一個保溫洗滌過程缺點：缺點：酶標(biāo)記抗體用量大；酶標(biāo)記抗體用量大；定量檢測的靈敏度和重復(fù)性存在不足。定量檢測的靈敏度和重復(fù)性存在不足。 抗體測定法抗體測定法

5、間接法檢測特異性抗體 抗原測定法抗原測定法 直接競爭法檢測可溶性抗原 雙抗體夾心法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原 （改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原） 應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法改良雙抗夾心法改良雙抗夾心法雙抗夾心法雙抗夾心法優(yōu)點：優(yōu)點：待測抗原需要待測抗原需要2 2個抗原決定簇，所以適合大分子抗個抗原決定簇，所以適合大分子抗原的檢測，一般在分子量原的檢測，一般在分子量5000D5000D以上；以上；由于增加了一層抗體，提高了特異性檢測的靈敏度，由于增加了一層抗體，提高了特異性檢測的靈敏度，尤其是改良雙抗夾心法；只要獲得針對受檢抗原的尤其

6、是改良雙抗夾心法；只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物就可以建立此法；物就可以建立此法；重復(fù)性較好；重復(fù)性較好；缺點：缺點： 操作復(fù)雜，費(fèi)時費(fèi)力操作復(fù)雜，費(fèi)時費(fèi)力 抗體測定法抗體測定法 間接法檢測特異性抗體 抗原測定法抗原測定法 直接競爭法檢測可溶性抗原 雙抗體夾心法檢測可溶性抗原 （改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原） 應(yīng)用生物素應(yīng)用生物素-親和素親和素雙抗體夾心雙抗體夾心ELISAELISA法法應(yīng)用生物素應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心親和素雙抗體夾心ELISA法法（BA-ELISA法）法）o 間接包被o 放大終末反應(yīng)BA

7、-ELISA原理原理 BA-ELISA是在常規(guī)是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物素原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物素(B，biotin)與與親和素親和素(A，avidin)間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統(tǒng)。間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統(tǒng)。生物素生物素是動植物體內(nèi)廣泛分布的一種小分子生長因子，又名輔酶是動植物體內(nèi)廣泛分布的一種小分子生長因子，又名輔酶R或維或維生素生素H；親和素親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，對生物素有非常高的親是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，對生物素有非常高的親和力；（鏈酶親和素是從鏈霉菌中提取，對載體吸附性比前者低）和力；（鏈酶親和素是從鏈霉菌中提取，對載

8、體吸附性比前者低）親和素與生物素親和素與生物素都可與蛋白質(zhì)都可與蛋白質(zhì)(包括抗原、抗體、酶等包括抗原、抗體、酶等)、熒光素等分子、熒光素等分子結(jié)合而不影響后者的生物活性，是理想的標(biāo)記劑；結(jié)合而不影響后者的生物活性，是理想的標(biāo)記劑；結(jié)合了酶的結(jié)合了酶的親和素分子親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子生物素分子產(chǎn)生反應(yīng)，產(chǎn)生反應(yīng)，既起到了多級放大作用，又由于既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應(yīng)底物時的催化作用而呈酶在遇到相應(yīng)底物時的催化作用而呈色色，達(dá)到檢測未知抗原，達(dá)到檢測未知抗原(或抗體或抗體)分子的目的。分子的目的。實驗材料小鼠小鼠INF-檢測試劑盒的組成：檢測試劑

9、盒的組成：Capture Ab：purified anti-mouse IFN-Detection Ab ：biotin-conjugate-anti-mouse IFN-Avidin-conjugate-HRP Standard：recombinant mouse IFN- （定量測定）Coating buffer5Assay diluent TMB solution待測樣品待測樣品- 經(jīng)經(jīng)ConA活化的小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清活化的小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISA ELISA 操作要點操作要點p樣品的保存樣品的保存p試劑的準(zhǔn)備試劑的準(zhǔn)備p固相載體固相載體p包被包被p加樣加樣p孵育孵育( (溫育）

10、溫育）p洗滌洗滌p顯色和比色顯色和比色樣本的制備與保存：樣本的制備與保存：血清樣品和細(xì)胞培養(yǎng)上清：血清樣品和細(xì)胞培養(yǎng)上清：5 5天內(nèi)測定，可以放置于天內(nèi)測定，可以放置于44，超過一周，超過一周，-80-80保存；保存；ConAConA活化的小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清：活化的小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清： 分別于活化后不同時間點收集培養(yǎng)的細(xì)胞，分別于活化后不同時間點收集培養(yǎng)的細(xì)胞，2000rpm2000rpm，44離心分離上清，冰上放置，分裝離心分離上清，冰上放置，分裝試劑的準(zhǔn)備試劑的準(zhǔn)備ELISA ELISA 中用的蒸餾水或者去離子水，包括用于配置中用的蒸餾水或者去離子水，包括用于配置coating buf

11、fercoating buffer，稀釋，稀釋Assay bufferAssay buffer，洗滌的，應(yīng)為新，洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的；鮮的和高質(zhì)量的；從冰箱中取出的試劑應(yīng)該平衡至室溫后使用；從冰箱中取出的試劑應(yīng)該平衡至室溫后使用；試劑最好現(xiàn)配先用試劑最好現(xiàn)配先用固相載體固相載體最常用的是聚苯乙烯：有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性最常用的是聚苯乙烯：有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能；能；國際上標(biāo)準(zhǔn)的是微量滴定板國際上標(biāo)準(zhǔn)的是微量滴定板8 81212的的9696孔板式；孔板式；已經(jīng)包被抗原或者抗體的固相載體在低溫（已經(jīng)包被抗原或者抗體的固相載體在低溫（2- 2-88）干燥的條件下一般可以保存）干燥的條件下一

12、般可以保存6 6個月。個月。包被包被定義：將抗原或者抗體固定在固相載體的過程稱為包定義：將抗原或者抗體固定在固相載體的過程稱為包被；被；物理吸附：兩者的疏水基團(tuán)通過疏水鍵的作用物理吸附：兩者的疏水基團(tuán)通過疏水鍵的作用抗體或者蛋白質(zhì)抗原一般采用抗體或者蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6pH9.6的碳酸鹽緩沖液作的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液（即本次實驗用的為稀釋液（即本次實驗用的coating buffercoating buffer）4-84-8包被過夜包被過夜( (有利于蛋白活性的保持），與有利于蛋白活性的保持），與3737孵育孵育2 2小時被認(rèn)為具有相等的包被效果小時被認(rèn)為具有相等的包被效果包被的最適

13、當(dāng)濃度隨著載體和包被物的性質(zhì)和酶結(jié)合包被的最適當(dāng)濃度隨著載體和包被物的性質(zhì)和酶結(jié)合物的濃度調(diào)定物的濃度調(diào)定封閉封閉定義：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再定義：繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程；包被的過程；目的：抗原或抗體包被時所用的濃度比較低，吸目的：抗原或抗體包被時所用的濃度比較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量的不相關(guān)蛋白質(zhì)填充這些空隙，從而排是讓大量的不相關(guān)蛋白質(zhì)填充這些空隙，從而排斥在斥在ELISAELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附；其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附；常用封閉液：常用封閉液：2%2%牛血清

14、白蛋白，牛血清白蛋白，10%NBS+5%10%NBS+5%羊羊血清，血清，5%5%脫脂奶粉；脫脂奶粉； 本實驗用封閉液：本實驗用封閉液：1 1Assay bufferAssay buffer。加樣加樣ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加樣步驟，即，加樣本（和次加樣步驟，即，加樣本（和/ /或標(biāo)準(zhǔn)品），加酶結(jié)合物，加底物；或標(biāo)準(zhǔn)品），加酶結(jié)合物，加底物；加樣時應(yīng)將所加物加在加樣時應(yīng)將所加物加在ELISAELISA板孔的底部，避板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可以濺出免加在孔壁上部，并注意不可以濺出, ,不可以產(chǎn)不可以產(chǎn)生氣泡；生氣泡；多道加液器的使用多道加液器的使用孵育孵育( (

15、溫育）溫育）在在ELISAELISA中抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫中抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫的過程稱為孵育；度和時間，這一保溫的過程稱為孵育；常用溫度：常用溫度：4343，3737，室溫，室溫，44等等孵育時為了避免蒸發(fā)，可以用塑料封口膠或者保孵育時為了避免蒸發(fā)，可以用塑料封口膠或者保鮮膜封板鮮膜封板洗滌洗滌 洗滌在ELISA中雖然不是一個反應(yīng)步驟，但決定了實驗的成敗聚苯乙烯等塑料對蛋白的吸附是普遍的，洗滌可以清聚苯乙烯等塑料對蛋白的吸附是普遍的，洗滌可以清除在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)除在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)洗滌可以清除殘留

16、在板孔中沒有能夠與固相抗原或者洗滌可以清除殘留在板孔中沒有能夠與固相抗原或者抗體結(jié)合的物質(zhì)抗體結(jié)合的物質(zhì)常加入非離子表面活性劑（含有疏水基團(tuán)常加入非離子表面活性劑（含有疏水基團(tuán)+ +親水基親水基團(tuán)），以抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面，如吐溫團(tuán)），以抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面，如吐溫2020，0.05%0.05%的濃度比較合適，濃度的濃度比較合適，濃度2%2%會洗脫包被在板上會洗脫包被在板上的抗原或者抗體的抗原或者抗體洗滌方式：洗滌方式：甩干孔內(nèi)的反應(yīng)液甩干孔內(nèi)的反應(yīng)液浸泡，即將洗滌液注滿板孔浸泡，即將洗滌液注滿板孔( (約約300300l），靜置），靜置3min3min，浸，浸泡時間不可以隨意縮短；泡

17、時間不可以隨意縮短；甩去液體后在吸水紙上拍干甩去液體后在吸水紙上拍干重復(fù)操作重復(fù)操作2 2，3 3，洗滌次數(shù)按要求操作，洗滌次數(shù)按要求操作顯色和比色顯色和比色 顯色是ELISA中的最后一步孵育反應(yīng)，此時，酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物；定量實驗中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)該按規(guī)定量實驗中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)該按規(guī)定力求準(zhǔn)確；定性測定的顯色時間一般不需要嚴(yán)格控定力求準(zhǔn)確；定性測定的顯色時間一般不需要嚴(yán)格控制和及時判斷；制和及時判斷；終止反應(yīng)，防止反應(yīng)過度：終止反應(yīng)，防止反應(yīng)過度： TMB受光照影響不大，經(jīng)HRP作用后，40min達(dá)到高峰；終止液有多種，疊氮鈉或SDS等酶抑制劑可以維

18、持藍(lán)色12-24h不褪色； OPD受光照會自行變色，要避光，經(jīng)HRP作用后，37孵育20-30min后顏色即不再加深；常用終止液為2M H2S04； HRP的色原底物系統(tǒng) 與HRP反應(yīng)后的顏色加終止液后的顏色讀數(shù)波長特 點OPD臨苯二胺492nm致畸，但本底好TMB四甲基聯(lián)苯胺450nm操作方便，本底較高ELISA ELISA 數(shù)據(jù)的處理數(shù)據(jù)的處理根據(jù)根據(jù)standardstandard的濃度和對應(yīng)的的濃度和對應(yīng)的ODOD值計算出線性方程值計算出線性方程將所測定樣品的將所測定樣品的ODOD值代入方程計算出相應(yīng)的樣品的值代入方程計算出相應(yīng)的樣品的濃度濃度 包被：用Coating buffer 1

19、:1000稀釋Capture Ab ，100ul/孔，濕盒4過夜； 洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，33min，控干； 封閉：加1Assay diluent 200ul/孔，37避光孵育2h； 洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，43min，控干；5. 加樣：100ul/孔，37避光孵育1h ；6. 洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，43min，控干；7. Biotin-Detection Ab: 用1Assay diluent 1:1000 稀釋detection Ab ，100ul/孔， 37避光孵育1h；8. 洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，43min，控干；9. Avidin-HRP

20、: 用1Assay diluent 1:250稀釋AV-HRP ，100ul/孔， 37避光孵育45min；10. 洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，53min，控干；11. 顯色：1TMB solution，100ul/孔，37孵育1-30min；12. 終止反應(yīng)：顯色完全后加 2M H2SO4 50ul/孔，終止顯色反應(yīng)； 于450nm處讀取光密度OD值或吸光度A值；13. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析數(shù)據(jù)2.2.洗滌洗滌 次日，棄去孔內(nèi)液體，用0.05%PBST洗板3次（將PBST加入每孔，靜置3min 后傾去），控干，洗去游離抗體。濕盒中，4過夜酶標(biāo)板酶標(biāo)板1.1.包被包被(NoteNote P

21、BST洗滌液:0.05% Tween-20 -PH 7.4 1PBS) 1Coating buffer 1:1000稀釋Capture Ab ， 100l/孔加入到酶標(biāo)板中，封口膜(或保鮮膜等）封閉酶標(biāo)板后，放入濕盒中，4過夜。 1Assay diluent， 200l/孔加入到酶標(biāo)板中，封口膜封閉酶標(biāo)板后，放入濕盒中，37避光孵育2h。4.4.洗滌洗滌 棄去孔內(nèi)液體，用0.05%PBST洗板4次，（將PBST加入每孔，靜置3min 后傾去）；控干；37避光孵育2h3.3.封閉封閉（Note 1Assay diluent：用純水將5Assay diluent 稀釋至1） 以上助教老師負(fù)責(zé)完成以

22、上助教老師負(fù)責(zé)完成5. 加樣加樣-抗原與抗體孵育抗原與抗體孵育 1 1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線： 1Assay diluent 倍比稀釋standard，每個梯度各取100l加入酶標(biāo)板，做復(fù)孔； 2 2）待測樣品：）待測樣品：取100l待測樣品加入酶標(biāo)板，做復(fù)孔； 3 3）空白對照）空白對照：取100l 1Assay diluent加入酶標(biāo)板，做復(fù)孔；37避光孵育1h50ulStandardStandard原液原液 1/81/8 1/16 1/321/16 1/32待測抗原待測抗原100100l空白對照空白對照陽性對照陽性對照每組每組4 4位同學(xué)的加樣順序：位同學(xué)的加樣順序：待測抗原待測

23、抗原100100l待測抗原待測抗原100100l樣本有樣本有4 4種，每人選一種做復(fù)孔種，每人選一種做復(fù)孔每組做陽參每組做陽參2 2個孔個孔每組做空白對照每組做空白對照2 2個孔（加樣個孔（加樣1 1Assay bufferAssay buffer）每孔加樣每孔加樣100100l待測抗原待測抗原100100l6. 6. 洗板：洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，43min，控干；7.Biotin-Detection Ab:7.Biotin-Detection Ab: 用1Assay diluent 1:1000稀釋detection Ab ，100l/孔，37避光孵育1h；8. 8. 洗板：洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，43min，控干；9. Avidin-HRP(HRP9. Avidin-HRP(HRP見光分解，之后所有步驟避光操作）見光分解，之后所有步驟避光操作） 用1Assay diluent 1:250稀釋AV-HRP ，100l/孔， 37避光孵育45min；10. 10. 洗板：洗板：棄去孔內(nèi)液體，PBST洗滌，53min，控干；11. 11. 顯色：顯色： 1TMB solution，100l/孔，37孵育1-30min； 12. 12.