蛋白酶的測定方法ppt課件

1、呼應面法優(yōu)化蛋白酶消費工藝呼應面法優(yōu)化蛋白酶消費工藝下下實驗內容實驗內容1、干物質失重的測定、干物質失重的測定2、蛋白酶活力的測定、蛋白酶活力的測定3、數(shù)據(jù)分析與建模、數(shù)據(jù)分析與建模4、呼應曲面作圖、呼應曲面作圖5、整改方案分析、整改方案分析一、干物質失重的測定干重失重發(fā)酵前干重發(fā)酵后干重干重失重發(fā)酵前干重發(fā)酵后干重二、蛋白酶活力分析二、蛋白酶活力分析1、 原理原理 1 1、福林試劑在堿性情況下極不穩(wěn)定，可被酚類化合物復、福林試劑在堿性情況下極不穩(wěn)定，可被酚類化合物復原而呈藍色反響。原而呈藍色反響。2 2、蛋白質分子中含有具有酚基的氨基酸、蛋白質分子中含有具有酚基的氨基酸( (酪氨酸、色氨酪氨

2、酸、色氨酸及苯丙氦酸等酸及苯丙氦酸等) )。3 3、以酪蛋白為底物，同酶液反響，經(jīng)一定時間后，加三、以酪蛋白為底物，同酶液反響，經(jīng)一定時間后，加三氯醋酸，終止酶反響，并使剩余的酪蛋白質沉淀，同水解產氯醋酸，終止酶反響，并使剩余的酪蛋白質沉淀，同水解產物分開，經(jīng)過濾后取濾液。用碳酸鈉堿化，再參與福林試劑物分開，經(jīng)過濾后取濾液。用碳酸鈉堿化，再參與福林試劑使之發(fā)色，用分光光度計測定。使之發(fā)色，用分光光度計測定。4 4、藍色反響的強弱，同蛋白水解產物的多少成正比而水、藍色反響的強弱，同蛋白水解產物的多少成正比而水解產物的量又是同酶活力成正比例關系。因此，根據(jù)藍色反解產物的量又是同酶活力成正比例關系。

3、因此，根據(jù)藍色反響的強弱就可推測蛋白酶的活力。響的強弱就可推測蛋白酶的活力。 2 2 試劑試劑1 1 福林試劑福林試劑 于于2000ml2000ml磨口回流安裝內參與鎢酸鈉磨口回流安裝內參與鎢酸鈉( N a 2 W O 4 2 H 2 O ) 1 0 0 g( N a 2 W O 4 2 H 2 O ) 1 0 0 g ， 鉬 酸 鈉， 鉬 酸 鈉(NaMoO42H2O)25g(NaMoO42H2O)25g，水，水700ml700ml，85%85%磷酸磷酸50m150m1，濃鹽酸濃鹽酸1000ml1000ml，文火回流，文火回流10h10h參與硫酸鋰參與硫酸鋰(Li2SO4)150g(Li2S

4、O4)150g，蒸溜水，蒸溜水50m150m1，混勻取去冷凝，混勻取去冷凝器，參與幾滴液體溴，再煮沸器，參與幾滴液體溴，再煮沸l(wèi)5minl5min，以驅逐，以驅逐殘溴及除去顏色，溶液應呈黃色而非綠色。殘溴及除去顏色，溶液應呈黃色而非綠色。假設溶液仍有綠色，需再滴加溴液。再煮沸假設溶液仍有綠色，需再滴加溴液。再煮沸除去之。冷卻后，定溶至除去之。冷卻后，定溶至1000ml1000ml。過濾，置。過濾，置于棕色瓶中保管。此溶液運用時加于棕色瓶中保管。此溶液運用時加2 2倍蒸餾水倍蒸餾水稀釋，即成稀釋的福林試劑。稀釋，即成稀釋的福林試劑。 2 2、0.4mol/L0.4mol/L三氯醋酸三氯醋酸(TC

5、A)(TCA)溶液溶液 稱取三氯醋酸稱取三氯醋酸65.4g65.4g，定容至，定容至1000ml1000ml。3 3、0.4mol/L0.4mol/L碳酸鈉溶液碳酸鈉溶液 稱取無水碳酸鈉稱取無水碳酸鈉(Na2CO3)42.4g(Na2CO3)42.4g，定容至，定容至1000m11000m1。4 4、0.05mol/L pH2.5 0.05mol/L pH2.5 乳酸乳酸- -乳酸鈉緩沖液乳酸鈉緩沖液 A A液：稱取液：稱取10.6g80-90%10.6g80-90%乳酸加蒸餾水定容至乳酸加蒸餾水定容至1000ml1000ml。 B B液：稱取液：稱取1616克克70%70%乳酸鈉加蒸餾水定容

6、至乳酸鈉加蒸餾水定容至1000ml1000ml。 取取A A液液16ml16ml與與B B液液1ml1ml稀釋稀釋1 1倍即成倍即成0.05mol/L 0.05mol/L pH2.5 pH2.5 乳酸乳酸- -乳酸鈉緩沖液。乳酸鈉緩沖液。5 5、2%2%酪蛋白溶液酪蛋白溶液 稱取干酪素稱取干酪素2g2g參與參與0.1mol/L0.1mol/L氫氧化氫氧化鈉鈉20ml20ml在水浴中加熱使溶解在水浴中加熱使溶解( (必要時用必要時用小火加熱煮沸小火加熱煮沸) )，然后用，然后用pH2.5pH2.5乳酸乳酸- -乳乳酸鈉緩沖液定容至酸鈉緩沖液定容至1000ml1000ml即成。即成。 配制后應及時

7、運用或放入冰箱內保配制后應及時運用或放入冰箱內保管。否那么極易繁衍細菌，引起蛻變。管。否那么極易繁衍細菌，引起蛻變。 配制酪蛋白溶液定容時，假設泡沫配制酪蛋白溶液定容時，假設泡沫過多，那么可加過多，那么可加1212滴酒精消泡。滴酒精消泡。33503350酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，應加弄酸性蛋白酶酪蛋白溶液的配制，應加弄乳酸乳酸2323滴潮濕。滴潮濕。6 6、100g/m1100g/m1酪氨酸溶液酪氨酸溶液 準確稱取在準確稱取在l05l05烘箱中烘至恒重的烘箱中烘至恒重的酪氨酸酪氨酸0.1g0.1g，逐漸參與，逐漸參與0.1mol/L0.1mol/L鹽酸鹽酸(HCl)(HCl)使溶解，加蒸溜水

8、定容至使溶解，加蒸溜水定容至100m1100m1，其濃度為，其濃度為1000g/m11000g/m1。 再汲取此液再汲取此液10ml10ml以蒸餾水定容至以蒸餾水定容至100ml100ml即配成即配成100g/m1100g/m1酪氨酸镕液酪氨酸镕液 此溶液配成后也應及時運用或放入冰此溶液配成后也應及時運用或放入冰箱內保管，以免繁衍細菌而蛻變。箱內保管，以免繁衍細菌而蛻變。 3 3 操作步驟操作步驟3.1 規(guī)范曲線的繪制規(guī)范曲線的繪制 1 1按表配制各種不同濃度的酪氨酸溶液按表配制各種不同濃度的酪氨酸溶液(2)(2)測定步驟測定步驟 另取另取6 6支試管按上表編號分別汲取不同濃度的酪氨支試管按上

9、表編號分別汲取不同濃度的酪氨酸酸1ml1ml，各參與，各參與0.4mo1/L0.4mo1/L碳酸鈉碳酸鈉5m15m1，再參與已稀釋的福，再參與已稀釋的福林試劑林試劑1m11m1。 搖勻置于水浴鍋中，搖勻置于水浴鍋中，4040保溫發(fā)色保溫發(fā)色20min20min，在波長，在波長660nm660nm處測定吸光度。普通測處測定吸光度。普通測3 3次，取平均值次，取平均值 以吸光度為縱座標，酪氨酸的濃度為橫座標，繪制以吸光度為縱座標，酪氨酸的濃度為橫座標，繪制成規(guī)范曲線。成規(guī)范曲線。 準確稱取蛋白酶固態(tài)發(fā)酵的濕曲準確稱取蛋白酶固態(tài)發(fā)酵的濕曲2g2g，用，用101020ml20ml蒸蒸餾水，餾水，303

10、0浸提半小時，用濾紙過濾。將濾液稀釋一定浸提半小時，用濾紙過濾。將濾液稀釋一定倍數(shù)倍數(shù)( (使其測定光密度在使其測定光密度在0.20.20.40.4范圍內為宜范圍內為宜) )。3.2 3.2 酶液的制備酶液的制備 取四支試管，分別參與取四支試管，分別參與1ml1ml稀釋酶液，其中一支為空白稀釋酶液，其中一支為空白管，三支為平行實驗管，置入管，三支為平行實驗管，置入4040水浴中預熱水浴中預熱3 35min5min。 在三支平行實驗管中分別參與在三支平行實驗管中分別參與1ml 2% 1ml 2% 酪蛋白溶液，準酪蛋白溶液，準確計時保溫確計時保溫10min10min。立刻參與。立刻參與2ml 0.

11、4M2ml 0.4M三氯乙酸溶液，三氯乙酸溶液，l5minl5min后用濾紙過濾。分別汲取后用濾紙過濾。分別汲取1ml1ml清液，加清液，加5ml 0.4M5ml 0.4M碳酸碳酸鈉溶液，最后參與鈉溶液，最后參與1ml1ml福林福林- -酚試劑，搖勻，于酚試劑，搖勻，于4040水浴中水浴中顯色顯色20min20min。 空白管中先參與空白管中先參與2ml 0.4M2ml 0.4M三氯乙酸溶液，再加三氯乙酸溶液，再加l ml 2%l ml 2%酪蛋白溶液，酪蛋白溶液，15min15min后用濾紙過濾。以下操作與平行實驗管后用濾紙過濾。以下操作與平行實驗管一樣。一樣。 以空白管為對照，在以空白管為

12、對照，在680680納米波長下測光密度，取其納米波長下測光密度，取其平均值。平均值。 3.3 3.3 測定測定 蛋白酶活力單位定義：在蛋白酶活力單位定義：在4040，pH2.5pH2.5下，每分鐘水解下，每分鐘水解酪蛋白釋放酪蛋白釋放1 1微克酪氨酸的酶量定義為微克酪氨酸的酶量定義為1 1個蛋白酶單位。個蛋白酶單位。 式中：式中： K K：規(guī)范曲線中：規(guī)范曲線中ODOD值為值為1 1所相當?shù)睦野彼岬奈⒖藬?shù)；所相當?shù)睦野彼岬奈⒖藬?shù)； OD OD：平行實驗管的平均光密度；：平行實驗管的平均光密度； 4 4：試管中反響液總體積：試管中反響液總體積( (毫升毫升) )； 10 10：反響：反響1010

13、分鐘；分鐘； N N：稀釋倍數(shù)；：稀釋倍數(shù)；W W：曲的稱取量：曲的稱取量( (克克) )4 4 計算計算 1 1對于同一臺分光光度計與同一批福林對于同一臺分光光度計與同一批福林- -酚試劑，酚試劑，其任務曲線其任務曲線K K值可以沿用，當另配福林值可以沿用，當另配福林- -酚試劑時，任務曲酚試劑時，任務曲線應重作。線應重作。 2 2當用不同產品的酪蛋白對同一蛋白酶測定時，當用不同產品的酪蛋白對同一蛋白酶測定時，其結果會有差別，故蛋白酶活力表示時應注明所用酪蛋白其結果會有差別，故蛋白酶活力表示時應注明所用酪蛋白的消費廠。的消費廠。5 5 闡明闡明三、數(shù)據(jù)分析與建模三、數(shù)據(jù)分析與建模運用運用DESIGN EXPERT 7.1 軟件軟件1、建立數(shù)學模型、建立數(shù)學模型2、模型顯著性檢驗、模型顯著性檢驗3、解方程，求出最正確發(fā)酵條件、解方程，求出最正確發(fā)酵條件4、求出模型所預測的最高產量。、求出模型所預測的最高產量。四、呼應曲面作圖四、呼應曲面作圖D esign-E xpert?S oftwareR155.328.8X 1 = A : AX 2 = B : BA c tual Fac to