酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、酶動(dòng)力學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)堿性磷酸酶 Km值的測(cè)定【目的要求】1. 了解底物濃度對(duì)酶促反響速度的影響2了解米氏方程、Km值的物理意義及雙倒數(shù)作圖求 Km值的方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】1、堿性磷酸酶：堿性磷酸酶是廣泛分布于人體各臟器器官中，其中以肝臟為最多。其次為腎臟、 骨骼、腸和胎盤(pán)等組織。但它不是單一的酶，而是一組同功酶。本實(shí)驗(yàn)用的堿性 磷酸酶是從大腸桿菌中提取的。2、米氏方程：Michaelis-Menten在研究底物濃度與酶促反響速度的定量關(guān)系時(shí)，導(dǎo)出了酶促反 應(yīng)動(dòng)力學(xué)的根本公式，即：式中：v表示酶促反響速度,咯磁表示酶促反響最大速度,S表示底物濃度, 兀?表示米氏常數(shù)。3、值的測(cè)定主要采用圖解法，有

2、以下四種: 雙曲線(xiàn)作圖法圖1-1, a根據(jù)公式1，以v對(duì)s作圖，此時(shí)1/2匚心時(shí)的底物濃度s值即為Km值，以 克分子濃度M丨表示。這種方法實(shí)際上很少采用，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)條件下的底物濃 度很難使酶到達(dá)飽和。實(shí)測(cè) 論嚴(yán)衛(wèi)一個(gè)近似值，因而1/2不精確。此外由于v 對(duì)S的關(guān)系呈雙曲線(xiàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)要求較多，且不易繪制。 Lin eweaver- Burk作圖法雙倒數(shù)作圖法圖 1-1，b實(shí)際工作中，常將米氏方程式1作數(shù)學(xué)變換，使之成為直線(xiàn)形式，測(cè)定要 方便、精確得多。其中之一即取1式的倒數(shù)，變換為L(zhǎng)ineweaver- Burk方程式:以對(duì)一作圖，即為y=ax+b形式。此時(shí)斜率為二，縱截距為。把直線(xiàn)外推與& 侍

3、 ciuJ mu橫軸相交，其截距相交，其截距即為一 Hofstee作圖法略 把2式等號(hào)兩邊乘以迖心，得:v =+ Vmaxvv以V對(duì)一作圖，這時(shí)斜率為，縱截距為.，橫截距為：。 Han as作圖法略把2式等號(hào)兩邊乘以S,得:以一對(duì)s作圖，這時(shí)斜率為，縱截距為* IT13JC咗E匸本實(shí)驗(yàn)主要以雙倒數(shù)法，即 Lin eweaver- Burk作圖法來(lái)測(cè)定堿性磷酸酶 Km值。 具體原理如下：本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶為例，用磷酸苯二鈉為其作用物，堿性磷酸酶能分解磷酸苯 二鈉產(chǎn)生酚和磷酸，在適宜條件下，和 60C，準(zhǔn)確反響13分鐘。在堿性條 件下酚可與酚試劑生成藍(lán)色化合物，以波長(zhǎng) 620nm比色。在一定條件下

4、色澤深 淺與光密度成正比。反響式如下：然后以光密度直接表示不同底物濃度時(shí)的酶反響速度， 即以光密度的倒數(shù)作縱坐 標(biāo)，以底物濃度的倒數(shù)作橫坐標(biāo)，按 Lin eweaver- Burk作圖法來(lái)測(cè)定堿性磷酸酶 Km值?！緝x器與試劑】?jī)x器：1. 恒溫水浴2. 721型分光光度計(jì)試劑：1. 酚試劑：稱(chēng)鎢酸鈉一Wl. 20100g,鉬酸鈉一Mo 2 O 25g置1500mL磨口回流裝置內(nèi)，加蒸餾水700mL,85%磷酸50mL和濃硫酸100mL。 充分混勻，使其溶解。小火加熱，回流10h燒瓶?jī)?nèi)加小玻璃珠數(shù)顆，以防溶液溢出，再參加硫酸鋰LiSO4 150g,蒸餾水50mL及液溴數(shù)滴。在通風(fēng) 櫥中開(kāi)口煮沸15

5、min，以除去多余的溴。冷卻后定容至 1000mL，過(guò)濾即成， 此液應(yīng)為鮮黃色，不帶任何綠色。置棕瓶中，可在冰箱長(zhǎng)期保存。假設(shè)此貯 存液使用過(guò)久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸幾分鐘，恢復(fù)原色仍可 繼續(xù)使用。使用時(shí)用蒸餾水稀釋一倍，最后酸度為1N。2. 磷酸苯二鈉基質(zhì)液：稱(chēng)取 625mg磷酸苯二鈉C6H5PO4Na22H2O，溶于 1,000ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，加數(shù)滴夜溴以防腐，置冰箱內(nèi)可保 存一年之久。3. 堿性緩沖液：稱(chēng)取無(wú)水碳酸鈉及碳酸氫鈉，溶解于蒸餾水中，并稀釋至 1,000ml.4. 堿性磷酸酶液：稱(chēng)取堿性磷酸酶 1mg,加水34ml，冰箱內(nèi)可保存五周左右。 【實(shí)驗(yàn)步

6、驟】取6支試管按下表參加試劑:123456磷酸苯二鈉ml蒸餾水ml-堿性緩沖液 ml混勻后，60r欲溫5分鐘堿性磷酸酶液-ml、八亠、八 注意:混勻后，60E水浴13分鐘準(zhǔn)確計(jì)時(shí)1參加堿性磷酸酶液要快速、準(zhǔn)確。用移液槍加2此比時(shí)為酶促反響，總體積 3第六管不加酶。酚試劑ml10%Na2CO3(ml )混勻后，室溫放置15分鐘注意：1酚試劑為顯色劑，同時(shí)為酶的變性劑，故參加酚試 劑后酶促反響即停止。2Na2CO3提供堿性環(huán)境，參加 Na2CO3后試劑才顯色以6管為調(diào)零點(diǎn)，在620nm波長(zhǎng)處比色【結(jié)果處理】1將各管光密度和底物濃度記入下表管號(hào)S1/S123452以為縱坐標(biāo)，1/s為橫坐標(biāo)，按Lin

7、eweave卜Burk作圖，求出堿性磷酸酶的 Km 值?！究记绊氈?參加堿性磷酸酶的量要準(zhǔn)確2保溫時(shí)間要準(zhǔn)確準(zhǔn)確保溫的方法：從第一管參加酶液開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔1分鐘向下一只試管加酶液，直至加完，至V準(zhǔn)確13分鐘立即向第一管加酚試劑，以終止其反響，并每隔 1 分鐘向下一只試管加酚試劑，直至加完止，這樣保證每管準(zhǔn)確保溫 13分鐘?！舅伎碱}】1Km的意義及其影響因子2為什么酶促反響速度以初速度表示3為什么可直接代替V作圖4分析自己的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)二一一溫度對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私鉁囟葘?duì)酶活性及酶促反響速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)。 【實(shí)驗(yàn)原理】每種酶都有其最適溫度，高于或低于此溫度酶的活性都降低

8、。 一般而言，假設(shè) 酶處于過(guò)高的溫度環(huán)境中，會(huì)使酶活性永久喪失；而假設(shè)處于極低溫度的環(huán)境中 只會(huì)使酶活性受到抑制，一旦溫度適宜，酶又會(huì)全部或局部的恢復(fù)其活性?！緝x器與試劑】?jī)x器：1 冰箱2.恒溫水浴鍋3.試管和試管架4 吸量管及吸量管架5.移液槍及槍頭6.膠頭滴管7 燒杯試劑：1. 的緩沖液：量取的磷酸氫二鈉和的檸檬酸混合搖勻即可。2 . 0.5%淀粉的0.5%氯化鈉溶液：可溶性淀粉和氯化鈉，溶于100ml蒸餾水 需加熱。3. 0. 03175g/L 碘液4. 1M HCl溶液5.1M NaOH溶液6.稀釋100倍的唾液7.冰水浴【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 制管和預(yù)溫由于本實(shí)驗(yàn)對(duì)恒溫反響要求較高，故每個(gè)

9、溫度梯度使用兩支試管，分別標(biāo)記 為A管和B管，同時(shí)欲溫底物與酶。A管參加的緩沖液和0.5%淀粉液；B管使用 移液槍參加稀釋100倍的唾液，相對(duì)應(yīng)的兩支試管置于設(shè)定的溫度下預(yù)溫 5min。 取12支潔凈試管，參照下表參加試劑：管號(hào)1 0C2室溫3 37C4 50C5 70C6室溫A的緩沖 液ml222222含 NaCl 的 0.5% 淀粉液ml22222用2ml的蒸餾 水代替B稀釋100倍的唾 液ml111111*6號(hào)管為對(duì)照組比色時(shí)作為0號(hào)管，置于室溫，且淀粉液用蒸餾水代 替2 .混合A B管將1號(hào)A管試劑迅速參加溫度對(duì)應(yīng)的B管中為了最大限度保證酶的量，此 時(shí)為計(jì)時(shí)的起點(diǎn)使用秒表，搖勻后放回對(duì)

10、應(yīng)溫度繼續(xù)水浴。注意：轉(zhuǎn)移 A管 試劑前需將其搖勻。3. 時(shí)間控制然后每隔1min或2min時(shí)間自定按上步操作依次把 2、3、4、5、6號(hào)的 A、B管混合，嚴(yán)格控制好時(shí)間。4. 中止反響準(zhǔn)確反響13min,向1號(hào)管參加2滴1M HCl溶液，立即混勻，中止反響， 按上一步的順序和時(shí)間間隔依次對(duì)各管進(jìn)行操作，并移至試管架。后再各用滴1M NaOHS液中和每管。5顯色 在每管中各參加碘液并混勻，觀(guān)察現(xiàn)象。6比色 假設(shè)不同溫度梯度間現(xiàn)象差異不明顯，那么進(jìn)行比色，通過(guò)光密度值來(lái)比擬。【結(jié)果處理】 記錄現(xiàn)象或比擬吸光度值 ，做出合理分析?！究记绊氈繃?yán)格注意時(shí)間的控制及各物質(zhì)的添加量?！舅伎碱}】如果某同學(xué)

11、 沒(méi)有嚴(yán)格按照教案步驟 做出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為唾液淀粉酶的最適溫度 為 70 度，請(qǐng)分析他得出這樣的結(jié)果的可能原因。實(shí)驗(yàn)三 PH 對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私釶H對(duì)酶活性及酶促反響速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)?！緦?shí)驗(yàn)原理】對(duì)酶活性影響的機(jī)理：PH影響酶活性中心的某些必須基團(tuán)的解離，而這些基團(tuán) 往往僅在某一解離狀態(tài)時(shí)才最容易同底物結(jié)合或具有最大催化活性； PH 影響可 解離基團(tuán)的底物和輔酶的荷電狀態(tài)，從而影響酶對(duì)他們的親和力；PH還可以影響 酶活性中心的空間構(gòu)象 , 從而影響酶的活性。2. 本實(shí)驗(yàn)用唾液淀粉酶為材料來(lái)觀(guān)察酶活性受 PH的影響的情況。淀粉在該酶 的催化作用下會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而出現(xiàn)不同

12、程度的水解 , 從而得到各種糊精乃至 麥芽糖 , 少量葡萄糖等水解產(chǎn)物。碘液與淀粉及其不同程度的水解產(chǎn)物反響呈現(xiàn) 不同顏色,即淀粉藍(lán)色 、紫色糊精 紫色 、紅色糊精 紅色 、麥芽糖及少量葡 萄糖 黃色 ?！緝x器與試劑】?jī)x器：1 、冰箱2、電爐3、恒溫水浴鍋4、試管架及試管5、移液管架及移液管試劑：1、磷酸氫二鈉溶液：稱(chēng)取含 2 個(gè)結(jié)晶水的磷酸氫二鈉，用水定容至 1L。2、 檸檬酸溶液：稱(chēng)取含一個(gè)結(jié)晶水的檸檬酸，用水定容至1L。3、唾液淀粉酶：將唾液分別稀釋 10倍、50倍和 100 倍，得三種不同濃度 的酶液、4、0.5%淀粉的 0.5%氯化鈉溶液：可溶性淀粉和氯化鈉，溶于 100ml 蒸餾

13、水需加熱。5、0.1%淀粉液：可溶性淀粉，加到 100ml 蒸餾水中，加熱溶解。6、碘液： 15g 碘化鉀和碘， 加少許水使碘完全溶解后， 再用水稀釋至 200ml 。7、1%氯化鈉溶液。& 0.1%硫酸銅溶液?！緦?shí)驗(yàn)步驟】一PH對(duì)酶活性的影響1編號(hào)和加試劑:1、緩沖溶液的配制 取六只潔凈的三角燒瓶，按表表1磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的配制取六支潔凈試管，編號(hào)后按表 2操作：表2 pH對(duì)酶活性的影響三角燒瓶號(hào)123456PH值磷酸二氫鈉ml檸檬酸ml【結(jié)果處理】記錄現(xiàn)象或比擬吸光度值，做出合理分析管號(hào)123456PH值緩沖液量ml333333含Nacl的0.5%淀粉ml222222稀釋100倍唾

14、液ml222222充分搖勻，37C水浴保溫，嚴(yán)格控制時(shí)間5min后，立即向各管參加碘液碘液滴333333充分搖勻，觀(guān)察各管顏色差異【考前須知】充分搖勻，嚴(yán)格控制時(shí)間?！舅伎碱}】酶的最適PH值受哪些因素影響?實(shí)驗(yàn)四酶濃度對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私饷笣舛葘?duì)酶活性及酶促反響速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)?！緦?shí)驗(yàn)原理】在適宜的條件下，假設(shè)反響物濃度大大高于酶濃度時(shí)， 反響速度隨酶濃度增 加而增加，兩者間成正比。但假設(shè)反響底物濃度較低，而且酶的濃度足夠高時(shí)， 增加酶濃度，反響速度根本不變。本實(shí)驗(yàn)采用唾液淀粉酶為例。參加不同濃度的酶，并比擬在同一適當(dāng)時(shí)間后， 以碘檢驗(yàn)淀粉的含量從而確認(rèn)其反響程度。【儀

15、器與試劑】?jī)x器：1. 恒溫水浴鍋2. 吸量管3. 試管與試管架試劑：1. 含NaCI的0.5%淀粉液2. 的緩沖液3. 分別稀釋過(guò)10倍、50倍和100倍后的唾液【實(shí)驗(yàn)步驟】1.取3支潔凈試管，按下表參加淀粉液，緩沖液，加畢放入 37度恒溫水浴 鍋中保溫5分鐘；2.保溫后，快速參加不同濃度的稀釋唾液，搖勻，立即放入37度恒溫水浴中，并計(jì)時(shí)。約3至4分鐘后參加等量碘液一至兩滴，立即搖勻后，記錄各管 的顏色。管號(hào)含NaCI的0.5%淀粉液/mL的緩沖液/mL稀釋唾液/mL顏色10倍50倍100倍132123213321【結(jié)果處理】記錄現(xiàn)象，做出合理分析【思考題】實(shí)驗(yàn)五一一離子對(duì)酶活性的影響【實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

16、的】了解離子對(duì)酶活性及酶促反響速度的影響，加深對(duì)酶特性的認(rèn)識(shí)?！緦?shí)驗(yàn)原理】酶的活性常常受某些物質(zhì)的影響，有些物質(zhì)能使酶的活性增加，稱(chēng)為酶的激活劑；有些物質(zhì)能使酶的活性降低，稱(chēng)為酶的抑制劑。Cl-是唾液淀粉酶的激活劑。其它的陰離子，女口 Br-、N03-和I-對(duì)該酶也有激活作用，但較微弱。而 Cu2+ 對(duì)唾液淀粉酶具有抑制作用。激活劑和抑制劑影響酶活性的劑量是很少的，并且常具有特異性。就本實(shí)驗(yàn)，低濃度CI-可以增加酶活性，高濃度的 CI-或者低濃度的Cu2+那么 會(huì)抑制酶活性，同時(shí)低濃度的 Na+、SO42-等對(duì)酶活性沒(méi)有影響。激活劑的作用 機(jī)制是多種多樣的，可能是作為輔酶或輔基的一個(gè)組成局部， 也可以直接作為酶 活性中心的構(gòu)成局部?！緝x器與試劑】?jī)x