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1、一步法和兩步法RT-PCR的根本區(qū)別？答：有中間產(chǎn)物cDNA，但稍微麻煩一點(diǎn)；一步法簡(jiǎn)單，但得不到cDNA。兩步法一步法同兩步法RT-PCR的比較:兩步法RT-PCR比較常見(jiàn)，在使用一個(gè)樣品檢測(cè)多個(gè)mRNA時(shí)比較有用。然而一步法RT-PCR具有其他優(yōu)點(diǎn)。一步法RT-PCR在處理大量樣品時(shí)易于操作，有助于減少殘余污染，因?yàn)樵赾DNA合成和擴(kuò)增之間不需要打開(kāi)管蓋。一步法可以得到更高的靈敏度，最低可以達(dá)到0.1pg總RNA，這是因?yàn)檎麄€(gè)cDNA樣品都被擴(kuò)增。對(duì)于成功的一步法RT-PCR，一般使用反義的基因特異性引物起始cDNA合成。210增加RT-PCR特異性第一鏈cDNA合成的起始可以使用三種不同

2、的方法，各種方法的相對(duì)特異性影響了所合成cDNA的量和種類。隨機(jī)引物法是三種方法中特異性最低的。引物在整個(gè)轉(zhuǎn)錄本的多個(gè)位點(diǎn)退火，產(chǎn)生短的，部分長(zhǎng)度的cDNA。這種方法經(jīng)常用于獲取5'末端序列及從帶有二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復(fù)制的終止位點(diǎn)的RNA模板獲得cDNA。為了獲得最長(zhǎng)的cDNA，需要按經(jīng)驗(yàn)確定每個(gè)RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機(jī)引物的起始濃度范圍為50到250ng每20l反應(yīng)體系。因?yàn)槭褂秒S機(jī)引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA，所以模板一般選用poly(A)+RNA。Oligo(dT)起始比隨機(jī)引物特異性高。它同大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA 3'端所發(fā)現(xiàn)的

3、poly(A)尾雜交。因?yàn)閜oly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2，所以與使用隨機(jī)引物相比，cDNA的數(shù)量和復(fù)雜度要少得多。因?yàn)槠漭^高的特異性，oligo(dT)一般不需要對(duì)RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進(jìn)行優(yōu)化。建議每20l反應(yīng)體系使用0.5g oligo(dT)。oligo(dT)12-18適用于多數(shù)RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因?yàn)槠錈岱€(wěn)定性較好，適用于較高的保溫溫度。基因特異性引物（GSP）對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄步驟是特異性最好的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機(jī)引物或oligo

4、(dT)那樣同所有RNA退火。用于設(shè)計(jì)PCR引物的規(guī)則同樣適用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)GSP的設(shè)計(jì)。GSP可以同與mRNA3'最末端退火的擴(kuò)增引物序列相同，或GSP可以設(shè)計(jì)為與反向擴(kuò)增引物的下游退火。對(duì)于部分?jǐn)U增對(duì)象，為了成功進(jìn)行RT-PCR，需要設(shè)計(jì)多于一個(gè)反義引物，因?yàn)槟康腞NA的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能會(huì)阻止引物結(jié)合。建議在20l的第一鏈合成反應(yīng)體系中使用1pmol反義GSP。RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟：一、組織抽提：1.取組織塊50-100用液氮在研缽中研磨成粉末2.移入玻璃勻漿器加入1ml Trizol抽打勻漿3.移入1.5ml新離心管用5 ml針頭抽打4.冰上孵育5分鐘5.離心12,000g 4 5分鐘

5、取上清液移入1.5ml新離心管6.加0.2 ml氯仿，震蕩，冰上孵育5分鐘7.離心<12,000g 4 10分鐘取上層液相移入1.5ml新離心管8.加0.5 ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5分鐘9.離心<12,000g 4 5分鐘棄去上清液10.加入1 ml 75%乙醇，震蕩11.離心<7,500g 4 5分鐘棄去上清液12.室溫下使之變透明13.加入DEPC處理水10l -35l溶解RNA（可保存在液氮或低溫冰箱）14.走RNA變性電泳觀察18s，28s條帶，分光光度計(jì)檢測(cè)260/280吸光度比值，計(jì)算RNA濃度二、RT反應(yīng)體系（第一步）：約20分鐘RNA 抽提物5lRadom

6、e引物2lRNA sin0.5l1.6515分鐘2.立即放入冰浴RT反應(yīng)體系（第二步）：約2小時(shí)RNA sin0.5l10mM dNTP1l5×RT 緩沖液4l25mM MgCl24lAMV 逆轉(zhuǎn)錄酶3l1.371.5小時(shí)2.945-10分鐘3.反應(yīng)物保存于-20或進(jìn)行PCR三1、PCR反應(yīng)體系：約4.5小時(shí)25mM MgCl22l10×PCR緩沖液5l10mM dNTP1l上下游引物10pmol/l2.5l×2CDNA模板2.5lddH2O34lTaq酶0.5l輕質(zhì)石蠟油50l100l1.942分鐘，551分鐘，722分鐘為第一個(gè)步1個(gè)循環(huán)2.9445秒，554

7、0秒，721分鐘為第二步30個(gè)循環(huán)3.7210分鐘4.取出后45分鐘后-20保存或走電泳三2、PCR反應(yīng)體系：約5小時(shí)25mM MgCl23l10×PCR緩沖液5l10mM dNTP1l上下游引物10pmol/l2.5l×2CDNA模板5lddH2O30lTaq酶1l輕質(zhì)石蠟油50l100l1.942分鐘，551分鐘，722分鐘為第一個(gè)步1個(gè)循環(huán)2.9445秒，5040秒，721分鐘為第二步40個(gè)循環(huán)3.7210分鐘4.取出后45分鐘后-20保存或走電泳四、電泳：約1.25小時(shí)1.配0.5×TBE電泳緩沖液300 ml2.膠濃度1.7%（40ml 0.5×

8、;TBE加0.68g膠）3.微波爐中火2分鐘溶解膠4.冷卻至60加入溴乙錠2l（10mg/ml的終濃度0.5g/ml）5.放入梳子，澆板，待凝固6.加8l PCR反應(yīng)產(chǎn)物+2l溴酚蘭7.電泳50-80V（每5V）RACE技術(shù)目錄· RACE技術(shù)-主要分類· RACE技術(shù)-發(fā)展歷史· RACE技術(shù)-引物設(shè)計(jì)· RACE技術(shù)-比較與優(yōu)化· RACE技術(shù)-實(shí)驗(yàn)步驟· RACE技術(shù)-PCR擴(kuò)增· RACE技術(shù)-產(chǎn)物驗(yàn)證· RACE技術(shù)-克隆和測(cè)序· RACE技術(shù)-cDNA的獲得RACE(rapid-amplifi

9、cationofcDNAends)是通過(guò)PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù)，通過(guò)PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，無(wú)須建立cDNA文庫(kù)，可以在很短的時(shí)間內(nèi)獲得有利用價(jià)值的信息。RACE是基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上由已知的一段cDNA片段，通過(guò)往兩端延伸擴(kuò)增從而獲得完整的3'端和5'端的方法。RACE技術(shù)-主要分類一般分5-和3-RACE兩種。3-RACE較簡(jiǎn)單，首先將mRNA或總RNA用PolyT引物反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)一般基因具有polyA尾巴的特點(diǎn)，選用特異引物(根據(jù)已知序列設(shè)計(jì))和PolyT引物PCR即可。大多實(shí)驗(yàn)者反映一次PCR可以搞定。5-RACE相對(duì)較難，目前流行幾種5-RACE。其一為加接頭

10、(傳統(tǒng))，根據(jù)接頭引物和自己設(shè)計(jì)特異引物PCR，可以設(shè)計(jì)巢式PCR二次擴(kuò)增。另外，有利用反向PCR技術(shù)，連接成環(huán)在PCR。還有，GENE公司一種smartRACEPCR，利用反轉(zhuǎn)酶末斷加C特點(diǎn),直接加上多G接頭，轉(zhuǎn)換模板而無(wú)需用連接酶加接頭。RACE技術(shù)-發(fā)展歷史經(jīng)典的RACE技術(shù)是由Frohman等(1988)發(fā)明的一項(xiàng)技術(shù)，主要通過(guò)RT-PCR技術(shù)由已知部分cDNA序列來(lái)得到完整的cDNA5和3端，包括單邊PCR和錨定PCR。該技術(shù)提出以來(lái)經(jīng)過(guò)不斷發(fā)展和完善，克服了早期技術(shù)步驟多、時(shí)間長(zhǎng)、特異性差的缺點(diǎn)(Frohman等，1995：Schaefer，l995：Chen，1998：Bespa

11、lova等，1998：Matz等1999)。對(duì)傳統(tǒng)RACE技術(shù)的改進(jìn)主要是引物設(shè)計(jì)及RT-PCR技術(shù)的改進(jìn)：改進(jìn)之一是利用鎖定引物(lockdockingprimer)合成第一鏈cDNA,即在oligo(dT)引物的3端引入兩個(gè)簡(jiǎn)并的核苷酸【5-Oligo(dT)16_30MN-3,M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始點(diǎn)，從而消除了在合成第一條cDNA鏈時(shí)oligo(dT)與poly(A)尾的任何部位的結(jié)合所帶來(lái)的影響；改進(jìn)之二是在5端加尾時(shí)，采用poly(C)，而不是poly(A)；改進(jìn)之三是采用RNaseH一莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶或選擇嗜

12、熱DNA聚合酶可能在高溫h(60度-70度)有效地逆轉(zhuǎn)錄mRNA，從而消除了5端由于高CC含量導(dǎo)致的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的影響；改進(jìn)之四是采用熱啟動(dòng)PCR(hotstartPCR)技術(shù)和降落PCR(touchdownPCR)提高PCR反應(yīng)的特異性。隨著RACE技術(shù)日益完善，目前己有商業(yè)化RACE技術(shù)產(chǎn)品推出，如CLONTECH的MarathoTM技術(shù)和SMARTTMRACE技術(shù)術(shù)。邢桂春等(2001)先后使用上述兩種試劑盒進(jìn)行RACE反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用MarathonTM所得到的片斷總是比采用SMARTsupTMRACE試劑盒到所得到的片斷短。其原因在于MarathonTM技術(shù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)往

13、往不能真正達(dá)到mRNA的5末端。所以認(rèn)為，進(jìn)行RACE反應(yīng)應(yīng)當(dāng)優(yōu)選SMARTTMRACE試劑盒。RACE技術(shù)-引物設(shè)計(jì)基因特異性引物（GSPs）應(yīng)該是：1、2328nt2、5070GC3、Tm值65度，Tm值70度可以獲得好的結(jié)果需要實(shí)驗(yàn)者根據(jù)已有的基因序列設(shè)計(jì)5和3RACE反應(yīng)的基因特異性引物（GSP1和GSP2).由于兩個(gè)引物的存在，PCR的產(chǎn)物是特異性的。4、cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因組DNA或總RNA，背景會(huì)很高。5、RACEPCR的效率還取決于總的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸溫度。6、在進(jìn)行5和3RACEPCR的時(shí)候應(yīng)該使用

14、熱啟動(dòng)。7、重疊引物的設(shè)計(jì)會(huì)對(duì)全長(zhǎng)的產(chǎn)生有幫助。另外，重疊的引物可以為PCR反應(yīng)提供一個(gè)對(duì)照。并不是絕對(duì)的要利用設(shè)計(jì)的引物產(chǎn)生重疊片段。8、引物GSP中的GC含量要在5070之間。這樣可以使用降落PCR。避免使用自身互補(bǔ)性的引物序列，否則會(huì)產(chǎn)生回折和形成分子內(nèi)氫鍵。另外，避免使用與AP1互補(bǔ)的引物，尤其是在3末端。9、如果要用重疊片段來(lái)檢測(cè)設(shè)計(jì)的引物，GSp1和GSp2之間至少是100200堿基。只有這樣才可以用擴(kuò)增的產(chǎn)物來(lái)鑒定設(shè)計(jì)的引物是否正確。10、降落PCR可以明顯的增加RACEPCR產(chǎn)物的特異性。在最開(kāi)始的循環(huán)中，退火溫度高于AP1引物的Tm值，可以增加對(duì)特異性條帶的擴(kuò)增。隨后的退火和

15、延伸的溫度降回到AP1的溫度，可以進(jìn)行隨后的PCR循環(huán)。11、驗(yàn)證基因特異性引物的對(duì)照：?jiǎn)蝹€(gè)引物的陰性對(duì)照：只用一個(gè)引物GSP來(lái)進(jìn)行陰性對(duì)照。這樣不應(yīng)該產(chǎn)生任何的條帶。如果可以看到明顯的產(chǎn)物，應(yīng)該改變循環(huán)的參數(shù)，或重新設(shè)計(jì)原始引物。利用兩個(gè)GSPS進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照：（只有兩個(gè)GSP可以產(chǎn)生重疊的時(shí)候才可以采用此步。）為了確定RNA樣品中目的基因確實(shí)表達(dá)，利用兩個(gè)GSP和接頭連接的cDNA來(lái)產(chǎn)生陽(yáng)性對(duì)照。可以產(chǎn)生兩個(gè)引物之間的重疊大小的片段。如果沒(méi)有這個(gè)片段，應(yīng)該重復(fù)cDNA的合成，或者從一個(gè)不同的組織或細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行cDNA的合成。12、制備和抽提polyA+RNA不要使用DEPC處理過(guò)的水。純化完

16、mRNA之后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)mRNA的質(zhì)量。哺乳動(dòng)物的mRNA樣品是0.512kb的拖帶，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的條帶。非哺乳動(dòng)物的mRNA應(yīng)略小。RACE技術(shù)-比較與優(yōu)化目的：研究環(huán)化法、末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶法和SMART反轉(zhuǎn)錄酶法3種常用5'RACE的技術(shù)的特點(diǎn)，并對(duì)它們進(jìn)行了優(yōu)化。方法：以播娘蒿RNA為模板，先按文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行5'RACE，然后通過(guò)增加反應(yīng)時(shí)間，提高部分反應(yīng)物濃度等方法進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：未優(yōu)化前環(huán)化法和TdT酶法條帶幾乎不可見(jiàn)，SMART反轉(zhuǎn)錄酶法隱約可見(jiàn)條帶，但不清晰。優(yōu)化條件后，環(huán)化法出現(xiàn)彌散條帶，TdT酶法勝之，但條帶依舊彌散

17、，而SMART反轉(zhuǎn)錄酶法最佳，獲得清晰特異性條帶。結(jié)論SMART5'RACE效果最好，其次為TdT酶法，環(huán)化法效果有待改進(jìn)，同時(shí)通過(guò)優(yōu)化條件可以明顯增加產(chǎn)物的特異性，為實(shí)驗(yàn)研究中5'RACE方法的選擇提供了依據(jù)。RACE技術(shù)-實(shí)驗(yàn)步驟cDNA第一條鏈的合成：我們建議進(jìn)行cDNA合成的對(duì)照反應(yīng)，這樣可以對(duì)樣品的cDNA的合成進(jìn)行鑒定。加入各種試劑之后，在氣浴中42度保溫一個(gè)小時(shí)。注意：在水浴或酒精浴中保溫回減少反應(yīng)體積，從而降低第一鏈的合成效率。將管放于冰上，以終止第一鏈的合成反應(yīng)。直接進(jìn)行第二鏈的合成。cDNA第二鏈的合成：第二鏈合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和連接

18、酶。T4DNA聚合酶的功能是補(bǔ)平dscDNA的末端。我們建議做陽(yáng)性對(duì)照，試劑盒中提供人類骨骼肌的mRNA。1、建議進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照,cDNA的質(zhì)量取決于制備的polyA+RNA的質(zhì)量。非哺乳動(dòng)物樣品的mRNA大約在0.53kb之間。2、通過(guò)電泳檢測(cè)cDNA的產(chǎn)量，與對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，這樣可以有利于在以后的步驟中對(duì)cDNA進(jìn)行稀釋。3、按照程序進(jìn)行連接反應(yīng)。4、如果沒(méi)有對(duì)比樣品和對(duì)照的產(chǎn)量，利用TricineEDTAbuffer制備接頭連接的dscDNA的1/50和1/250的稀釋物，用兩種稀釋物進(jìn)行RACEPCR反應(yīng)，直到鑒定出哪一種稀釋可以得到好的效果。RACE技術(shù)-PCR擴(kuò)增進(jìn)行5和3的RACEP

19、CR擴(kuò)增。利用以下的程序進(jìn)行降落PCR反應(yīng)：94度30秒5個(gè)循環(huán)：（1）94度5秒（2）72度4分5個(gè)循環(huán)：（1）94度5秒（2）70度4分鐘2025個(gè)循環(huán)：（1）94度5秒（2）68度4分鐘注意：我們建議使用降落PCR反應(yīng)，這就要求GSP的Tm值70度。1、當(dāng)循環(huán)結(jié)束時(shí)，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析每一個(gè)管中的產(chǎn)物5l，使用適當(dāng)?shù)姆肿恿縨arker。2、可以根據(jù)你的基因的特異性來(lái)設(shè)計(jì)最理想的循環(huán)參數(shù)。如果看不到帶或者只有微弱的帶，在68度多加5個(gè)循環(huán)。最佳的延伸時(shí)間取決于擴(kuò)增條帶的長(zhǎng)度。如果片斷的長(zhǎng)度在25kb的時(shí)候，經(jīng)常使用4min，0.2-2kb的時(shí)候?qū)⒀由鞎r(shí)間減到23min，對(duì)于51

20、0kb的條帶，延伸時(shí)間增加到10min。RACE技術(shù)-產(chǎn)物驗(yàn)證1、應(yīng)該對(duì)RACE的片段進(jìn)行驗(yàn)證,以此來(lái)確定是否已經(jīng)擴(kuò)增了理想的產(chǎn)物。如果得到的是多條帶或者研究的是多基因家族的成員，驗(yàn)證是非常有用的。2、有3種驗(yàn)證RACE產(chǎn)物的方法：（1）比較由GSP和NGSP獲得RACE產(chǎn)物。（2）Southernblot（3）克隆并測(cè)序3、建議最好測(cè)得RACE產(chǎn)物的部分序列。有的時(shí)候需要嵌套引物的存在。比較由GSP和NGSP獲得RACE產(chǎn)物。4、對(duì)于5末端的RACE產(chǎn)物，比較由AP1和GSP1擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物和由AP1和NGSP1擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物。5、對(duì)于3末端的RACE產(chǎn)物，比較由AP1和GSP2擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)

21、物和由AP1和NGSP2擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物。這對(duì)于鑒定多條帶是否是上一個(gè)PCR的特異性產(chǎn)物是非常有用的。6、如果條帶是正確的，在嵌套PCR反應(yīng)中的條帶應(yīng)該是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR產(chǎn)物的遷移率的不同取決于cDNA結(jié)構(gòu)中GSP1和嵌套引物的位置。RACE技術(shù)-克隆和測(cè)序1、可以利用膠回收試劑盒來(lái)回收RACE產(chǎn)物，此試劑盒適合回收2.5kb以下的RACE產(chǎn)物；對(duì)于長(zhǎng)的片段，可以通過(guò)電洗脫獲得好的結(jié)果。如果你選擇使用其他的純化方法，最后用TricineEDTAbuffer30l重新懸浮DNA樣品。2、電泳5l回收的樣品來(lái)鑒定回收的質(zhì)量。3、將回收的PCR產(chǎn)物直接克隆到/A型的PCR克隆載體中。

22、另外還可以利用接頭和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位點(diǎn)，將產(chǎn)物克隆到常規(guī)載體中。4、對(duì)于5端的RACE產(chǎn)物，我們建議挑取至少810個(gè)不同的克隆以獲得5端的最大可能性的序列。（反轉(zhuǎn)錄并不總是進(jìn)行到mRNA模板的5末端，尤其是長(zhǎng)模板。另外，T4DNA聚合酶會(huì)移走5末端的020個(gè)堿基。）5、一旦鑒定了含有插入片斷的克隆，應(yīng)該獲得多的序列信息。理想的是，可以對(duì)整個(gè)開(kāi)放讀碼框進(jìn)行測(cè)序。包括5和3的非翻譯區(qū)。RACE技術(shù)-cDNA的獲得通過(guò)部分或全部測(cè)序鑒定了RACE產(chǎn)物后，可以通過(guò)兩種選擇獲得全長(zhǎng)的cDNA。通過(guò)PCR和克隆的方法。通過(guò)PCR的方法獲得全長(zhǎng)cDNA

23、：1、擴(kuò)增長(zhǎng)的cDNA需要較長(zhǎng)的延伸時(shí)間，但是如果延伸的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可以產(chǎn)生拖帶，所以要慎重的設(shè)計(jì)引物。2、根據(jù)從5和3RACE產(chǎn)物獲得序列信息設(shè)計(jì)5和3GSP引物。這些引物應(yīng)該來(lái)自cDNA的3或者5的末端，應(yīng)該是2328nt長(zhǎng)。不應(yīng)該在引物的末端加上限制性位點(diǎn)，這樣會(huì)導(dǎo)致高背景。在某些時(shí)候可以設(shè)計(jì)3和5的嵌套引物。但是還是應(yīng)該先利用一對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。3、進(jìn)行如下的熱循環(huán)：94度30秒25個(gè)循環(huán)：（1）94度5秒（2）72度215分鐘4、延伸的時(shí)間應(yīng)該等于預(yù)期的cDNA長(zhǎng)度加上2分鐘。例如：預(yù)期得到6kb的條帶，用628分鐘的延伸時(shí)間。注意：如果沒(méi)有條帶或者條帶弱，增加5個(gè)循環(huán)；或者優(yōu)化P

24、CR的條件。5、在1.2%的瓊脂糖凝膠上分析5l的樣品。通常情況下，可以見(jiàn)到一條單一帶，如果這樣，利用膠來(lái)純化全長(zhǎng)的cDNA。6、制備1.2%的TAEbuffer制備瓊脂糖凝膠。不使用TBEbuffer，TBE的膠很難制備全長(zhǎng)的cDNA。7、將剩下的45l反應(yīng)物點(diǎn)樣，選用適當(dāng)?shù)膍arker。8、利用長(zhǎng)波紫外觀察cDNA（300nm）切下全長(zhǎng)的cDNA。注意：應(yīng)該盡量減少紫外對(duì)cDNA的照射。9、利用膠回收試劑盒回收cDNA。此試劑盒適合回收2.5kb以下的RACE產(chǎn)物；對(duì)于長(zhǎng)的片段，可以通過(guò)電洗脫獲得好的結(jié)果。如果你選擇使用其他的純化方法，最后用TricineEDTAbuffer30l重新懸浮

25、DNA樣品。10、將全長(zhǎng)的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆載體中。通過(guò)克隆產(chǎn)生全長(zhǎng)的cDNA：1、如果你已經(jīng)獲得了含有重疊部分的5和3RACE產(chǎn)物，同時(shí)在cDNA的重疊部分含有一個(gè)酶切位點(diǎn)的話，通過(guò)克隆技術(shù)可以獲得全長(zhǎng)的cDNA。2、利用酶切獲得的3和5擴(kuò)增產(chǎn)物，并且利用T4DNA連接酶將它們連接起來(lái)。利用接頭和cDNA合成引物中的內(nèi)切酶將最終的全長(zhǎng)cDNA克隆到載體中。3、在哺乳動(dòng)物基因組中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大約106bp才出現(xiàn)一次，因此在絕大多數(shù)的cDNA中是不出現(xiàn)的。RACE技術(shù)原理及應(yīng)用（2）2010-02-06 14:24目前,全長(zhǎng)基因的獲得是生物工程及分子生物學(xué)研

26、究的一個(gè)重點(diǎn)。盡管已經(jīng)有多種方法可以獲得基因的全長(zhǎng)序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因豐度較低，從而使得由低豐度mRNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄獲得全長(zhǎng)cDNA很困難。近年來(lái)發(fā)展成熟的cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)為從低豐度轉(zhuǎn)錄快速獲得全長(zhǎng) cDNA提供了一個(gè)便捷的途徑。cDNA 末端快速擴(kuò)增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù)是一種基于mRNA反轉(zhuǎn)錄和 PCR技術(shù)建立起來(lái)的、以部分的已知區(qū)域序列為起點(diǎn),擴(kuò)增基因轉(zhuǎn)錄本的未知區(qū)域,從而獲得mRNA(cDNA)完整序列的方法。簡(jiǎn)單的說(shuō)就是一種從低豐度轉(zhuǎn)錄本中快速增長(zhǎng)cDNA5和cDNA3末端，進(jìn)而獲

27、得獲得全長(zhǎng)cDNA簡(jiǎn)單而有效的方法，該方法具有快捷、方便、高效等優(yōu)點(diǎn),可同時(shí)獲得多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。因此近年來(lái)RACE技術(shù)已逐漸取代了經(jīng)典的cDNA文庫(kù)篩選技術(shù),成為克隆全長(zhǎng)cDNA序列的常用手段。第二 RACE的原理 RACE 是采用PCR 技術(shù)由已知的部分cDNA 順序來(lái)擴(kuò)增出完整cDNA5和3末端,是一種簡(jiǎn)便而有效的方法, 又被稱為錨定 PCR (anchoredPCR)和單邊PCR(one2side PCR)。3RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一個(gè)35bp的接頭(dT17-adaptor)為引物，其中在

28、引物的接頭中有一在基因組DNA中罕見(jiàn)的限制酶的酶切位點(diǎn)。這樣就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接頭序列。再用一個(gè)基因特異性引物(3 amp)與少量第一鏈(-)cDNA退火并延伸，產(chǎn)生互補(bǔ)的第二鏈(+)cDNA。三)利用3amp和接頭引物進(jìn)行PCR循環(huán)即可擴(kuò)增得到cDNA雙鏈。擴(kuò)增的特異性取決于3amp的堿基只與目的cDNA分子互補(bǔ)而用接頭引物來(lái)取代dT17一adaptor則可阻止長(zhǎng)(dT)堿基引起的錯(cuò)配。5RACE的原理5RACE與3 RACE略有不同。首先，引物多設(shè)計(jì)了一個(gè)用于逆轉(zhuǎn)錄的基因特異引物GSP-RT；其次，在酶促反應(yīng)中增加了逆轉(zhuǎn)錄和加尾步驟，即先用GSP-RT逆轉(zhuǎn)錄 mRNA獲得

29、第一鏈(-)cDNA后， 用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶和dATP在cDNA5 端加poly(A)尾，再用錨定引物合成第二鏈(+)cDNA,接下來(lái)與3 RACE過(guò)程相同。用接頭引物和位于延伸引物上游的基因特異性引物(5amp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。全長(zhǎng)cDNA的獲得通過(guò)RACE方法獲得的雙鏈cDNA可用限制性內(nèi)切酶酶切和southem 印跡分析并克隆。通常的克隆方法是同時(shí)使用一個(gè)切點(diǎn)位于接頭序列上的限制性內(nèi)切酶和一個(gè)切點(diǎn)位于擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的內(nèi)切酶。由于大多數(shù)非特異性擴(kuò)增的cDNA產(chǎn)物不能被后一個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切，因而也就不會(huì)被克隆從而增加了克隆的選擇效率。還可以用在基因特異性引物的 5端摻人一個(gè)限制性內(nèi)切酶的

30、酶切位點(diǎn)的方法來(lái)克隆。最后，從兩個(gè)有相互重疊序列的3和5RACE產(chǎn)物中獲得全長(zhǎng)cDNA。或者通過(guò)分析RACE產(chǎn)物的3和5端序列，合成相應(yīng)引物來(lái)擴(kuò)增mRNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而獲得全長(zhǎng)cDNA。第三 RACE的應(yīng)用RACE技術(shù)主要是應(yīng)用于對(duì)全長(zhǎng)cDNA序列的獲得，但對(duì)該技術(shù)進(jìn)行一定的修改后，也可在其它方面顯示出極高的應(yīng)用價(jià)值。首先，RACE技術(shù)可用于cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及篩選。Belyavaasky等(1989)用10個(gè)骨髓瘤細(xì)胞分離的總RNA，通過(guò)TdT加同聚尾、(dT)16引物反轉(zhuǎn)錄，接著用(dC)13和錨定引物擴(kuò)增的方法建立了一個(gè)106克隆的cDNA 文庫(kù)。同時(shí)，用該方法構(gòu)建文庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)是它們都

31、只需要很少量的實(shí)驗(yàn)材料。建喜等(2001)利用RACE技術(shù)從已經(jīng)構(gòu)建的cDNA 文庫(kù)中成功克隆了家兔精子膜蛋白基因。其次，應(yīng)用RACE克隆已知片段的旁側(cè)內(nèi)部序列(neighboring internal sequence)。Fritz等(1991)以及Struck等(1994)分別用該法獲得了3端和5端的旁側(cè)序列。Zhang (1996)應(yīng)用LA-PCR方法獲得了特異基因的5末端非編碼和編碼序列,省去了構(gòu)建及篩選基因組文庫(kù)的麻煩。王東等(2003)利用RT-PCR和 RACE技術(shù)從玉米中獲得一個(gè)長(zhǎng)度為2469bp F2KP蛋白基因的cDNA克隆。此外，RACE技術(shù)還可用于克隆同源基因的同源片斷

32、，為尋找同基因提供了一種方法。除此之外,Whitcomb等設(shè)計(jì)的隨機(jī)引物/錨定PCR能對(duì)克隆質(zhì)粒載體上的靶序列進(jìn)行定點(diǎn)刪除，采用(N)10錨隨機(jī)引物和變性的質(zhì)粒DNA進(jìn)行雜交,然后通過(guò)T7聚合酶來(lái)延伸,這樣單鏈DNA就可被一隨機(jī)引物和一基因特異性引物擴(kuò)增,一端可達(dá)到缺失刪除,缺失的片段可達(dá)2Kb。Balavoine應(yīng)用連接介導(dǎo)PCR從一種扁蟲(chóng)中克隆得到8個(gè)分別屬于Hox,msh,NK-1和NK-2的含同源盒的片段，說(shuō)明RACE可用于克隆同源基因的同源片段，為尋找同源基因提供了一種手段。RACE技術(shù)與生物信息學(xué),例如EST庫(kù)相結(jié)合,具有快速,高效克隆新基因的特點(diǎn),為快速釣取基因家族候選新成員提供新思路,如果一個(gè)基因是多基因家族的一個(gè)成員,用基因特異引物(GSP)可能同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)高度同源的Cdna.李紅等利用一條cDNA