第八章植物基因的克隆原理與技術(shù)

1、第八章第八章 植物基因的克隆原理與技術(shù)植物基因的克隆原理與技術(shù) 內(nèi)內(nèi) 容容 一基因克隆所需要的酶和載體一基因克隆所需要的酶和載體 二植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建二植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建 三基因克隆的方法三基因克隆的方法基因克隆所需要的酶和載體基因克隆所需要的酶和載體一般認(rèn)為基因工程誕生于1973年上世紀(jì)40年代70年代初分子生物學(xué)領(lǐng)域理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術(shù)上的三大發(fā)明 對(duì)于基因工程的誕生起到了決定性的作用。1- DNA是遺傳物質(zhì)被證實(shí)1944年，Avery O.T.肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)2- DNA雙螺旋模型的提出Watson 和和Crick 1953年，James Watson 和Francis Crick提

2、出了DNA的雙螺旋模型。3 “中心法則”的提出以Nireberg等為代表的一批科學(xué)家確定了遺傳信息以密碼方式傳遞，每三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子，代表一個(gè)氨基酸，到1966年，全部破譯了64個(gè)密碼子，并提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”。1 工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用 Smith等分離并純化了等分離并純化了限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶Hind II， 19721972年，年，BoyerBoyer等相繼發(fā)現(xiàn)了等相繼發(fā)現(xiàn)了coR I 一類重要的限制性內(nèi)一類重要的限制性內(nèi)切酶。切酶。 Werner Arber 1968年發(fā)現(xiàn)限制酶年發(fā)現(xiàn)限制酶1 工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用 19671967年，世界上五個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)

3、發(fā)現(xiàn)年，世界上五個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)DNADNA連接酶連接酶，特別是特別是19701970年年KhoranaKhorana等發(fā)現(xiàn)的等發(fā)現(xiàn)的T4 DNAT4 DNA連接酶連接酶具有更高的連具有更高的連接活性。接活性。2 反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用19701970年，年，BaltimoreBaltimore等和等和TeminTemin等各自發(fā)現(xiàn)了等各自發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶，完，完善了中心法則，使單個(gè)真核基因的制備成為了可能。善了中心法則，使單個(gè)真核基因的制備成為了可能。3 載體的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用 19721972年，美國(guó)年，美國(guó)StanfordStanford大學(xué)的大學(xué)的P.BergP.Berg等首次成功地

4、實(shí)等首次成功地實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)了DNADNA的體外重組。的體外重組。3 載體的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用 19731973年，年，StanfordStanford大學(xué)的大學(xué)的CohenCohen等成功地利用體外重組等成功地利用體外重組實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌間性狀的轉(zhuǎn)移。實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌間性狀的轉(zhuǎn)移。這一年被定為基因工程誕生的元年。提取目的DNA酶切DNA片段導(dǎo)入到細(xì)菌中重組菌的篩選序列分析和基因表達(dá)等研究植物基因工程的基本流程載體基因克隆所需要的酶類 限制性內(nèi)切核酸酶 DNA連接酶 DNA聚合酶 DNA修飾酶 核酸外切酶 單鏈DNA內(nèi)切酶1 1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)2 2、限制性核酸內(nèi)切酶的命名和分類、限制性

5、核酸內(nèi)切酶的命名和分類3 3、IIII型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性4 4、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)n 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制限制（Restriction）限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源的外源DNADNA切成小片斷。切成小片斷。修飾修飾（Modification）細(xì)菌自身的細(xì)菌自身的DNADNA堿基被堿基被甲基化甲基化酶酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割。自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割。限制性核酸內(nèi)切酶的概念限制性核酸內(nèi)切酶的概念限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切

6、酶（ Restriction endonucleases）：是一：是一類能夠識(shí)別雙鏈類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定的核苷酸序列，并能分子中某種特定的核苷酸序列，并能精確特異地切割雙鏈精確特異地切割雙鏈DNA分子的核酸分子的核酸內(nèi)切酶內(nèi)切酶。已經(jīng)從近。已經(jīng)從近300種種微生物微生物中分離出了中分離出了2300種，其中商品化的限制性核酸內(nèi)切種，其中商品化的限制性核酸內(nèi)切酶酶500余種。余種。限制性核酸內(nèi)切酶的命名1、寄主菌屬名的第一個(gè)字母寄主菌屬名的第一個(gè)字母和和種名的頭兩個(gè)字母種名的頭兩個(gè)字母組成組成3個(gè)斜個(gè)斜體字母的略語(yǔ)表示酶來(lái)源的菌種名稱。體字母的略語(yǔ)表示酶來(lái)源的菌種名稱。如：大腸桿菌如

7、：大腸桿菌Escherichia coli 表示為表示為Eco ；屬名流感嗜血菌流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示為表示為Hin；種名2、修飾性酶用、修飾性酶用M表示，限制性酶用表示，限制性酶用R表示表示 如如 R. Hin M. Eco3、用一個(gè)正體字母表示菌株的類型、用一個(gè)正體字母表示菌株的類型 如如Escherichia coli RY13 Eco R4、以羅馬數(shù)字表示分離出來(lái)的先后順序、以羅馬數(shù)字表示分離出來(lái)的先后順序 如如Eco R I、 Hin d III目前鑒定出目前鑒定出三種不同類型三種不同類型的限制性內(nèi)切酶。的限制性內(nèi)切酶。lI 型限制性內(nèi)切酶型限制

8、性內(nèi)切酶lII 類限制性內(nèi)切酶類限制性內(nèi)切酶lIII類限制性內(nèi)切酶類限制性內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的分類限制性核酸內(nèi)切酶的分類不同類型核酸內(nèi)切酶主要特性的比較分析I 型II 型III 型限制-修飾活性單一多功能的酶限制酶和修飾酶分開(kāi)雙功能酶內(nèi)切酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3種不同亞基單一成分2種不同亞基活性輔助因子ATP、Mg2+、SAMATP、Mg2+、SAMMg2+甲基化位點(diǎn)寄主特異性的位點(diǎn)特異性切割否是否基因克隆中的用途用途有限十分廣泛用途有限II型限制性核酸內(nèi)切酶的3大特點(diǎn)l識(shí)別位點(diǎn)的特異性 l識(shí)別序列的對(duì)稱性 l切割位點(diǎn)的規(guī)范性與II型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個(gè)概念粘性末端 ( cohesive ends

9、 )：因酶切位點(diǎn)在兩條DNA單鏈上不同（對(duì)稱）酶切后形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈末端結(jié)構(gòu)，酶切產(chǎn)生的兩個(gè)粘性末端很容易通過(guò)互補(bǔ)堿基的配對(duì)而重新連接起來(lái)。5端凸出（如EcoR I）3端凸出（如Pst I）平 末 端 (Blunt end)：因酶切位點(diǎn)在兩條DNA單鏈上相同，酶切后形成的平齊的末端結(jié)構(gòu)，這種末端不易重新連接起來(lái)。同裂酶同裂酶 (isoschizomers )(isoschizomers )：能識(shí)別和切割能識(shí)別和切割同樣的核苷酸靶序同樣的核苷酸靶序列列的不同內(nèi)切酶。的不同內(nèi)切酶。完全同裂酶完全同裂酶識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同 如如Hind 和和Hsu I不完全同裂酶不完

10、全同裂酶識(shí)別位點(diǎn)相同但切點(diǎn)不同識(shí)別位點(diǎn)相同但切點(diǎn)不同如如Xma I 和和 Sma I同尾酶同尾酶(isocaudamers):(isocaudamers):識(shí)別的靶序列不同，但能識(shí)別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同產(chǎn)生相同粘性末端粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。的一類限制性核酸內(nèi)切酶。注注 意：意：由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識(shí)別。將不能被該兩種酶的任一種所識(shí)別。BamH IG GATCCCCTAG GII 經(jīng)同尾酶

11、消化的DNA末端連接示意圖5 XXXXGGATCCXXXXXX 33 XXXXCCTAGGXXXXXX 5BamH I5 XXXXG GATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCTXXXXXX 33 XXXXTCTAGAXXXXXX 5Bgl II5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG AXXXXXX 55 XXXXA GATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAGGXXXXXX 5BamH IBgl II影響酶活性的因素很多：影響

12、酶活性的因素很多：lDNADNA的濃度和質(zhì)量是影響酶切的最為關(guān)鍵的因素的濃度和質(zhì)量是影響酶切的最為關(guān)鍵的因素 純度的鑒定：紫外吸光值純度的鑒定：紫外吸光值A(chǔ)260/A280A260/A280 濃度低于濃度低于500ng/500ng/ Ll酶切消化的緩沖液酶切消化的緩沖液 Mg2+ Tris-HCL BSA BSA（牛血清蛋白）（牛血清蛋白）l酶切反應(yīng)的溫度（通常為酶切反應(yīng)的溫度（通常為3737）l影響酶切消化的其他因素影響酶切消化的其他因素 時(shí)間時(shí)間 體積體積 RNARNA限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)酶切反應(yīng)的基本步驟Buffer (10) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LE

13、nzyme 0.5 LVolume 20.0 L 1.0kb0.4kb0.5kb0.6kb1.0kb電泳紫外分析37 1h加反應(yīng)液CKMCKMTT1 1、DNADNA連接酶作用的機(jī)理連接酶作用的機(jī)理2 2、DNADNA連接酶的反應(yīng)條件連接酶的反應(yīng)條件3 3、DNADNA連接的策略連接的策略DNADNA連接酶及其應(yīng)用連接酶及其應(yīng)用DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)連接酶的發(fā)現(xiàn)T4DNAT4DNA連接酶連接酶:由大腸桿菌由大腸桿菌T4T4噬菌體噬菌體DNADNA編碼，以編碼，以ATPATP作為能源輔作為能源輔助因子。助因子。 容易制備，而且可以連接完全配對(duì)的平末端容易制備，而且可以連接完全配對(duì)的平末端DNADNA

14、分子，所以分子，所以在基因克隆中應(yīng)用廣泛。在基因克隆中應(yīng)用廣泛。DNA連接酶連接酶:由大腸桿菌基因組由大腸桿菌基因組DNA編碼，以編碼，以NAD+作為能作為能源源輔助因子。輔助因子。 從細(xì)菌從細(xì)菌DNADNA環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能把兩條環(huán)化現(xiàn)象推測(cè)，必定存在一種能把兩條DNADNA雙雙鏈連接到一起的酶。鏈連接到一起的酶。DNADNA連接酶作用的特點(diǎn)連接酶作用的特點(diǎn)A.A. 連接的兩條鏈必須分別具有連接的兩條鏈必須分別具有 33端自由羥基（端自由羥基（-OH-OH） 和和55端磷酸基團(tuán)（端磷酸基團(tuán)（-P-P），而且只有這兩個(gè)基團(tuán)彼此相鄰時(shí)），而且只有這兩個(gè)基團(tuán)彼此相鄰時(shí)才能進(jìn)行連接反應(yīng)；才

15、能進(jìn)行連接反應(yīng)；B B. . 連接反應(yīng)必須有能量分子的參與，通常有兩種能量分子，連接反應(yīng)必須有能量分子的參與，通常有兩種能量分子，即即ATPATP和和NADNAD+ +。DNA連接反應(yīng)的條件4 過(guò)夜加反應(yīng)液轉(zhuǎn)化CK-CK+重組菌影響連接效率的因素有：影響連接效率的因素有：l溫度（最主要的因素）溫度（最主要的因素）ldNTPdNTP的濃度的濃度(10(10 M-1M-1 M M) )l連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高）連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高）l反應(yīng)時(shí)間（通常連接過(guò)夜）反應(yīng)時(shí)間（通常連接過(guò)夜）l插入片段和載體片段的摩爾比插入片段和載體片段的摩爾比平末端DNA片段的末端加尾連接法335

16、53355末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶+dATP+dTTP33553355AAAAATTTTTDNADNA聚合酶和聚合酶和T4DNAT4DNA連接酶連接酶平末端DNA片段加接頭連接法 銜接物銜接物(linker)(linker)，也叫接頭，是有人工化學(xué)合成的一段，也叫接頭，是有人工化學(xué)合成的一段10-1210-12個(gè)核苷個(gè)核苷酸的酸的DNADNA雙鏈，其中包含有雙鏈，其中包含有1 1個(gè)或幾個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。使用時(shí)只須將銜個(gè)或幾個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。使用時(shí)只須將銜接物和目的片段的接物和目的片段的55端用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后用端用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后用T4DNAT4DNA連

17、接酶進(jìn)行連接，就可獲得能產(chǎn)生粘性末端的連接酶進(jìn)行連接，就可獲得能產(chǎn)生粘性末端的DNADNA片段。片段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4連接酶連接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoR ICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶 Klenow fragment T7 DNA聚合酶聚合酶 T4 DNA聚合酶聚合酶Taq聚合酶聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNADNA聚合酶及其應(yīng)用聚合酶及其應(yīng)用DNADNA聚合酶聚合酶35

18、外切酶活性外切酶活性53外切酶活性外切酶活性聚合聚合速率速率持續(xù)能持續(xù)能力力大腸桿菌大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶低低有有中中低低Klenow fragmentKlenow fragment低低無(wú)無(wú)中中低低T4DNAT4DNA聚合酶聚合酶高高無(wú)無(wú)中中低低T7DNAT7DNA聚合酶聚合酶高高無(wú)無(wú)快快高高逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)低低中中Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶無(wú)無(wú)有有快快高高常用常用DNADNA聚合酶的特性比較聚合酶的特性比較逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 一種可以有效地將一種可以有效地將mRNAmRNA轉(zhuǎn)錄成為轉(zhuǎn)錄成為DNADNA的酶，其產(chǎn)物稱為的酶，其產(chǎn)物稱為cDNA (complemen

19、tary DNA)。實(shí)際上，是一種實(shí)際上，是一種RNARNA依賴的依賴的DNADNA聚合酶。聚合酶。來(lái)源來(lái)源 RNARNA腫瘤病毒。腫瘤病毒。 最普遍使用的是來(lái)源于最普遍使用的是來(lái)源于鳥(niǎo)類骨髓母細(xì)胞瘤病毒鳥(niǎo)類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）和）和鼠白血病毒反轉(zhuǎn)錄酶鼠白血病毒反轉(zhuǎn)錄酶（avian myeloblastosis virus, M-MLV）AMVAMV的性質(zhì)的性質(zhì) 由由 和和 兩條多肽鏈組成。兩條多肽鏈組成。聚合酶聚合酶活性和活性和 RNaseHRNaseH活性?；钚?。RNaseHRNaseH： 經(jīng)過(guò)蛋白酶水解后產(chǎn)生的一條多肽。以經(jīng)過(guò)

20、蛋白酶水解后產(chǎn)生的一條多肽。以53或或35方向特異地水解方向特異地水解RNA-DNARNA-DNA雜交雙鏈中的雜交雙鏈中的RNARNA鏈。鏈。RNADNARNaseHRNADNA逆轉(zhuǎn)錄酶的用途逆轉(zhuǎn)錄酶的用途l合成合成cDNAcDNA以以oligo dToligo dT為引物（與為引物（與mRNAmRNA的的polyApolyA尾巴互補(bǔ)結(jié)合）。尾巴互補(bǔ)結(jié)合）。lRT-PCRRT-PCR用的模板用的模板克隆某個(gè)基因時(shí)，用其克隆某個(gè)基因時(shí)，用其mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄出反轉(zhuǎn)錄出cDNAcDNA第一鏈。第一鏈。mRNA 5A A A A A AT T T T T T 35mRNA 5A A A A A

21、AT T T T T T 35DNADNA修飾酶修飾酶l末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶lT4T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶細(xì)菌性堿性磷酸酶細(xì)菌性堿性磷酸酶Bacterial alkaline phosphatase，BAP從大腸桿菌中分離出來(lái)。具有抗熱性。從大腸桿菌中分離出來(lái)。具有抗熱性。小牛腸堿性磷酸酶小牛腸堿性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP從小牛腸中純化出來(lái)。從小牛腸中純化出來(lái)。SDSSDS中加熱中加熱6868可完全可完全失活。失活。堿性磷酸酶的特性：堿性磷酸酶的特性：催化脫掉催化脫掉DNADNA（或（或RNARNA）55端的

22、磷酸根。端的磷酸根。5 P-OH 35 HO-P35 HO-OH 35 HO-OH 3堿性磷酸酶Hind酶切 5AAGCTT TTCGAA 5 堿性磷酸酶A-OH5P-AGCTTTTCGA-P5HO-AA-OH5HO-AGCTTTTCGA-OH5HO-A易載體自連堿性磷酸酶的功能堿性磷酸酶的功能l防止線性化的載體份子自我連接防止線性化的載體份子自我連接A-OH5HO-AGCTTTTCGA-OH5HO-A外源DNA5P-AGCTTA-OH33HO-ATTCGA-P5連接酶A-AGCTTAAGCTTTTCGA-ATTCGAA轉(zhuǎn)入細(xì)菌后會(huì)被修復(fù)基因工程載體基因克隆的本質(zhì)是使目的基因在特定的條件下得到

23、擴(kuò)增和表達(dá)，而目的基因本身無(wú)法進(jìn)行復(fù)制，所以就必須借助于“載體”及其“寄主細(xì)胞”來(lái)實(shí)現(xiàn)。n分子較小，可攜帶比較大的分子較小，可攜帶比較大的DNA片段。片段。 n能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。 n要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)少的切割位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn) multiple cloning sites，MCS）。）。 n有適合的標(biāo)記，易于選擇。有適合的標(biāo)記，易于選擇。 n有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)

24、外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)?？赡苁歉咝У谋磉_(dá)。 n從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等。驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等。 載體需要滿足的條件載體需要滿足的條件載體分類載體分類根據(jù)功能分：根據(jù)功能分：n克隆載體克隆載體: :克隆一個(gè)基因或克隆一個(gè)基因或DNADNA片斷片斷n表達(dá)載體表達(dá)載體: :用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)n整合載體整合載體: :把一個(gè)基因插入到染色體組中把一個(gè)基因插入到染色體組中根據(jù)來(lái)源：根據(jù)來(lái)源： n質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體n噬菌體載體噬菌體載體n柯斯質(zhì)粒載體

25、柯斯質(zhì)粒載體n人工染色體載體人工染色體載體質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體（plasimid vectors）1 1、質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性、質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性2 2、質(zhì)粒載體相關(guān)知識(shí)介紹、質(zhì)粒載體相關(guān)知識(shí)介紹1.質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性（1 1）質(zhì)粒是一種廣泛從在于細(xì)菌細(xì)胞中染色體）質(zhì)粒是一種廣泛從在于細(xì)菌細(xì)胞中染色體以以 外的能自主的復(fù)制外的能自主的復(fù)制的裸露的的裸露的環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNADNA分子分子，比病毒更簡(jiǎn)單。，比病毒更簡(jiǎn)單。在霉菌、藍(lán)藻、酵母在霉菌、藍(lán)藻、酵母和一些動(dòng)植物細(xì)胞中和一些動(dòng)植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒。目前也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒。目前對(duì)細(xì)菌的質(zhì)粒研究得對(duì)細(xì)菌的質(zhì)粒研究得比較深入，特別是

26、大比較深入，特別是大腸桿菌的質(zhì)粒。腸桿菌的質(zhì)粒。質(zhì)粒的不親和性：質(zhì)粒的不親和性：兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存。不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存。質(zhì)粒的存在形式：質(zhì)粒的存在形式：有超螺旋、開(kāi)環(huán)雙螺旋和線狀有超螺旋、開(kāi)環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋雙螺旋3 3種。種。雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋）（超螺旋）開(kāi)環(huán)雙螺旋（一開(kāi)環(huán)雙螺旋（一個(gè)裂口）個(gè)裂口）線狀雙螺旋線狀雙螺旋（兩個(gè)裂口）（兩個(gè)裂口）質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的分子構(gòu)型的分子構(gòu)型質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA瓊脂糖凝膠電泳模式圖瓊脂糖凝膠電泳模式圖L:松弛線松弛線性的性的DNA 松弛開(kāi)環(huán)的松弛開(kāi)環(huán)的OCO

27、C構(gòu)型構(gòu)型 超螺旋的超螺旋的SCSC構(gòu)型構(gòu)型 作為基因工程載體，質(zhì)粒至少應(yīng)該具備作為基因工程載體，質(zhì)粒至少應(yīng)該具備復(fù)制復(fù)制的起始區(qū)的起始區(qū)、選擇標(biāo)記基因區(qū)選擇標(biāo)記基因區(qū)、多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)等等部分。部分。多克隆位點(diǎn)功能多克隆位點(diǎn)功能：用于插入外源用于插入外源DNADNA片段的特定區(qū)域，由一片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)組成。系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)組成。特點(diǎn)：特點(diǎn)：每個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)應(yīng)該在整個(gè)載體中是唯一的。每個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)應(yīng)該在整個(gè)載體中是唯一的。選擇標(biāo)記基因：選擇標(biāo)記基因：在基因工程中的在基因工程中的一類用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞（菌）的一類用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞（菌

28、）的抗性基因抗性基因。功能：功能：通過(guò)在培養(yǎng)基中加入特定通過(guò)在培養(yǎng)基中加入特定的的抗生素抗生素就可以選擇得到轉(zhuǎn)化的就可以選擇得到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞（菌）。細(xì)胞（菌）。 -互補(bǔ)互補(bǔ) (alpha-complementation) 大腸桿菌大腸桿菌 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶可以和其底物可以和其底物X-Gal 相互作用并且相互作用并且釋放出一種藍(lán)色物質(zhì)，當(dāng)該酶的釋放出一種藍(lán)色物質(zhì)，當(dāng)該酶的 -片段和片段和 -片段分開(kāi)時(shí)就失片段分開(kāi)時(shí)就失去了這種顯色的功能。去了這種顯色的功能。 通常將編碼該酶通常將編碼該酶 -片段的片段的LacZ 基因插入到載體的多克隆基因插入到載體的多克隆位點(diǎn)的側(cè)翼序列中。位點(diǎn)的側(cè)翼序列中。

29、 在一些在一些人工構(gòu)建的大腸桿菌株系中人工構(gòu)建的大腸桿菌株系中只能編碼產(chǎn)生該酶的只能編碼產(chǎn)生該酶的 片段片段。這樣一來(lái)，含有功能性完整的。這樣一來(lái)，含有功能性完整的LacZ 基因的載體導(dǎo)入基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細(xì)胞中時(shí)，載體編碼的到這類寄主細(xì)胞中時(shí)，載體編碼的 -片段片段就能和寄主編碼的就能和寄主編碼的 片段片段發(fā)生互補(bǔ)并具有了對(duì)底物發(fā)生互補(bǔ)并具有了對(duì)底物X-gal的作用功能（發(fā)生顯色的作用功能（發(fā)生顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)象被稱為是反應(yīng)），這種現(xiàn)象被稱為是 alpha-complementation。 所以含有這類載體的菌落就很容易在含有底物所以含有這類載體的菌落就很容易在含有底物X-Gal和和

30、誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物IPTG的平板上分辨出來(lái)。因?yàn)檫@類菌落中釋放出的的平板上分辨出來(lái)。因?yàn)檫@類菌落中釋放出的藍(lán)色物質(zhì)可以將整個(gè)菌落染成藍(lán)色，非常容易辨別。藍(lán)色物質(zhì)可以將整個(gè)菌落染成藍(lán)色，非常容易辨別。互補(bǔ)顯色反應(yīng)互補(bǔ)顯色反應(yīng) pBR322質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 “P”表示是一種質(zhì)粒；表示是一種質(zhì)粒； “BR”表示兩位主要構(gòu)建表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一個(gè)字母者姓氏的頭一個(gè)字母“F.Bilivar和和R.L.Rodriguez”;“322”表示實(shí)驗(yàn)編號(hào)。表示實(shí)驗(yàn)編號(hào)。pBR3224363重組DNAAmprTcs提取DNA 電泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs轉(zhuǎn)化 無(wú)菌落陽(yáng)性

31、菌落篩選重組子2)DNA重組無(wú)DNA插入有DNA插入外源DNA1)限制酶切加反應(yīng)液 AmpTet + Amp連接pBR3224363pUC質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體在在pBR322的基礎(chǔ)上，組的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其入了一個(gè)在其5-端帶有端帶有一段多克隆位點(diǎn)的一段多克隆位點(diǎn)的lacZ基因，而發(fā)展的具有基因，而發(fā)展的具有雙雙功能檢測(cè)特性功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)的新型質(zhì)粒載體系列。粒載體系列。pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn):第一，具有來(lái)自大腸桿菌第一，具有來(lái)自大腸桿菌lac操縱子的操縱子的lacZ基因?；?。 所編碼的所編碼的-肽鏈可參與肽鏈可參與- 互補(bǔ)作用，用互補(bǔ)作用，用X-gal顯色對(duì)重顯色對(duì)重組子進(jìn)

32、行鑒定，而組子進(jìn)行鑒定，而pBR322質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選擇。擇。 第二，具有多克隆位點(diǎn)第二，具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段。區(qū)段。 方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。方便具有不同粘性末端的外源片斷的插入。穿梭質(zhì)粒載體（穿梭質(zhì)粒載體（ shuttle plasmid vector ） 是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，因而可在兩種不同的寄主細(xì)胞存活和復(fù)制的擇標(biāo)記，因而可在兩種不同的寄主細(xì)胞存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體。酵母酵母ARSn ARS (autonomously replicating seq

33、uence自主復(fù)制自主復(fù)制序列序列)-)-染色體自主復(fù)制序列染色體自主復(fù)制序列, ,是從酵母中克隆的真核細(xì)是從酵母中克隆的真核細(xì)胞胞DNADNA復(fù)制起點(diǎn)序列。復(fù)制起點(diǎn)序列。n 酵母每條染色體由多個(gè)復(fù)制子組成酵母每條染色體由多個(gè)復(fù)制子組成, ,復(fù)制子平均長(zhǎng)度為復(fù)制子平均長(zhǎng)度為36kb36kb。n 整個(gè)基因組約由整個(gè)基因組約由400400多個(gè)復(fù)制子組成。多個(gè)復(fù)制子組成。5-XTTXATXTXTX-3B1 B2B3ACS:ACS:能被復(fù)制起始位點(diǎn)蛋能被復(fù)制起始位點(diǎn)蛋白白ORCORC專一性識(shí)別專一性識(shí)別也是ORC識(shí)別序列是轉(zhuǎn)錄因子是轉(zhuǎn)錄因子ABFABF1 1的識(shí)別位點(diǎn)且的識(shí)別位點(diǎn)且B B3 3可以遠(yuǎn)在

34、可以遠(yuǎn)在1kb1kb以外同樣促以外同樣促進(jìn)復(fù)制進(jìn)復(fù)制CA A元件決定哪一段元件決定哪一段DNADNA序列作為復(fù)制起始位點(diǎn)，序列作為復(fù)制起始位點(diǎn)，B B元件可以增元件可以增加復(fù)制起始位點(diǎn)的效率。加復(fù)制起始位點(diǎn)的效率。 可能參與可能參與DNADNA雙鏈雙鏈的解旋的解旋酵母整合質(zhì)粒酵母整合質(zhì)粒(YIps)酵母整合質(zhì)粒酵母整合質(zhì)粒( (YIps) )：細(xì)菌質(zhì)粒細(xì)菌質(zhì)粒含有一個(gè)酵母基因。是在含有一個(gè)酵母基因。是在pBR322pBR322的基礎(chǔ)上插入了一個(gè)的基礎(chǔ)上插入了一個(gè)URA3URA3基因，基因，這個(gè)基因編碼乳清酸核苷這個(gè)基因編碼乳清酸核苷-5-5-磷酸脫羧酶，可以作為選擇標(biāo)記。磷酸脫羧酶，可以作為選

35、擇標(biāo)記。YIpYIp不能像質(zhì)粒一樣復(fù)制，其復(fù)不能像質(zhì)粒一樣復(fù)制，其復(fù)制依賴于整合到酵母的染色體上。制依賴于整合到酵母的染色體上。YIP51000bpURA3AMPr酵母附加質(zhì)粒酵母附加質(zhì)粒( (YEps) ) YEpsYEps可以含有完整的可以含有完整的2 2m m質(zhì)粒，質(zhì)粒，也可以只含有也可以只含有2 2m m質(zhì)粒的復(fù)制質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)；因?yàn)樵谳d體中作為選起點(diǎn)；因?yàn)樵谳d體中作為選擇標(biāo)記的基因與突變體主染擇標(biāo)記的基因與突變體主染色體色體DNADNA同源性很高，可以獨(dú)同源性很高，可以獨(dú)立的復(fù)制也可以整合到酵母立的復(fù)制也可以整合到酵母的染色體內(nèi)。的染色體內(nèi)。來(lái)自于來(lái)自于2 2m m質(zhì)粒的載體稱為酵母

36、附加載體或者質(zhì)粒的載體稱為酵母附加載體或者YEpsYEps。 YEpYEp克隆載體（酵母游離型質(zhì)粒）克隆載體（酵母游離型質(zhì)粒） 2m2m質(zhì)粒的質(zhì)粒的orioriEcoREcoR酶切酶切 pBR322pBR322質(zhì)粒質(zhì)粒 酵母染色體酵母染色體URA3URA3基因基因HindHind酶切酶切 YEp24 YEp24 （圖（圖3-113-11） 特征特征（1 1）保留了）保留了pBR322pBR322的的和和篩選大腸桿篩選大腸桿菌克隆子菌克隆子（2 2）含）含URA3URA3標(biāo)記標(biāo)記篩選酵母菌克隆子篩選酵母菌克隆子 （3 3）URA3URA3基因基因補(bǔ)償酵母菌補(bǔ)償酵母菌ura3ura3突變突變 優(yōu)點(diǎn)

37、優(yōu)點(diǎn)（1 1）是一種穿梭質(zhì)粒，可在酵母菌和大腸桿菌中復(fù)）是一種穿梭質(zhì)粒，可在酵母菌和大腸桿菌中復(fù)制制（2 2）轉(zhuǎn)化率高，）轉(zhuǎn)化率高，1gDNA1gDNA可獲得約可獲得約10104 410105 5個(gè)克隆子個(gè)克隆子（3 3）穩(wěn)定高拷貝復(fù)制）穩(wěn)定高拷貝復(fù)制 故可用酵母菌高水平表達(dá)外源目的基因故可用酵母菌高水平表達(dá)外源目的基因含有酵母的篩選標(biāo)記含有酵母的篩選標(biāo)記ura3ura3和和DNADNA的自主復(fù)制序列的自主復(fù)制序列ARSARS在真核在真核細(xì)胞中獨(dú)立自主的復(fù)制，拷貝細(xì)胞中獨(dú)立自主的復(fù)制，拷貝數(shù)高但不穩(wěn)定。數(shù)高但不穩(wěn)定。酵母復(fù)制質(zhì)粒（酵母復(fù)制質(zhì)粒（YRpYRp）YRP1000bpURA3AMPrA

38、RS在復(fù)制質(zhì)粒中再插入酵母著絲在復(fù)制質(zhì)粒中再插入酵母著絲粒粒(centromer)(centromer)的一個(gè)的一個(gè)DNADNA片段片段(CEN)(CEN)，幫助染色體能等量地，幫助染色體能等量地分配到子代細(xì)胞中。所以，含分配到子代細(xì)胞中。所以，含有有CENCEN序列的質(zhì)粒也將以同樣序列的質(zhì)粒也將以同樣的機(jī)制穩(wěn)定地維持在細(xì)胞中，的機(jī)制穩(wěn)定地維持在細(xì)胞中，并保證了穩(wěn)定質(zhì)粒在子代細(xì)胞并保證了穩(wěn)定質(zhì)粒在子代細(xì)胞中的等量分布。中的等量分布。酵母穩(wěn)定質(zhì)粒酵母穩(wěn)定質(zhì)粒 (YCp)(YCp)URA3AMPrARSCENYCP1000bpAMPrARSURA3CEN質(zhì)質(zhì) 粒粒大大 小小大腸桿菌大腸桿菌復(fù)制子復(fù)

39、制子酵母酵母復(fù)制子復(fù)制子大腸桿菌大腸桿菌選擇表型選擇表型酵母選擇酵母選擇表型表型轉(zhuǎn)化頻率轉(zhuǎn)化頻率gDNAgDNA-1-1YIP5整合型5541bpPMB1無(wú)AprTetrUra+1100YRP17復(fù)制型7002bpPMB1ARS1AprTetrTrp+Leu+103105YEp13附加體型10.7kbPMB12mAprTetrLeu+103105YCp 9著絲粒型10.1kbPMB1ARS1AprTetrTrp+Ura+103104酵母菌穿梭質(zhì)粒特性酵母菌穿梭質(zhì)粒特性一、一、噬菌體克隆載體噬菌體克隆載體（一）（一） 噬菌體性質(zhì)噬菌體性質(zhì)DNA + DNA + 外殼蛋白外殼蛋白1 1、DNA (

40、48.5kb) DNA (48.5kb) 噬菌體中：線性噬菌體中：線性宿主細(xì)胞：環(huán)狀宿主細(xì)胞：環(huán)狀(cos(cos位點(diǎn)位點(diǎn)) )A W B C D E F Z U V G T H M L K I J ins xis exo red gam att位點(diǎn)CIII N CI Cro CII O P QS頭 部尾 部b 2區(qū)重 組 基 因正 負(fù) 調(diào) 控 基 因裂 解右側(cè)區(qū)內(nèi)包含所有的右側(cè)區(qū)內(nèi)包含所有的調(diào)控因子、與調(diào)控因子、與DNA復(fù)復(fù)制及裂解宿主菌有關(guān)制及裂解宿主菌有關(guān)的基因，這個(gè)區(qū)域約的基因，這個(gè)區(qū)域約長(zhǎng)長(zhǎng)12kb。左側(cè)區(qū)包括使噬左側(cè)區(qū)包括使噬菌體菌體DNADNA成為一個(gè)成為一個(gè)成熟的、有外殼成熟的

41、、有外殼的病毒顆粒所需的病毒顆粒所需的全部基因，全的全部基因，全長(zhǎng)約長(zhǎng)約20kb20kb。中間區(qū)域約長(zhǎng)中間區(qū)域約長(zhǎng)18kb18kb，這一段這一段DNADNA可以被外可以被外源置換而不會(huì)影響噬源置換而不會(huì)影響噬菌體菌體裂解生長(zhǎng)的能裂解生長(zhǎng)的能力。力。A W B C D E F Z U V G T H M L K I J ins xis exo red gam att位點(diǎn)CIII N CI Cro CII O P QS頭部尾部b2區(qū)重組基因正負(fù)調(diào)控基因裂解DNA 基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu) B2B2區(qū)區(qū)和和重組基因區(qū)重組基因區(qū)是是噬菌體進(jìn)入裂解周期的非必需區(qū)噬菌體進(jìn)入裂解周期的非必需區(qū)（15kb 15kb

42、，約占，約占噬菌體噬菌體DNADNA的的1/31/3 ），可將該區(qū)缺失或），可將該區(qū)缺失或用外源用外源DNADNA片段取代，對(duì)噬菌體的感染和生長(zhǎng)都不會(huì)造片段取代，對(duì)噬菌體的感染和生長(zhǎng)都不會(huì)造成影響。成影響。60%60%區(qū)域?yàn)榱呀馍L(zhǎng)所必需。區(qū)域?yàn)榱呀馍L(zhǎng)所必需。cI基因：溶源過(guò)程控制基因基因：溶源過(guò)程控制基因 噬菌體的缺陷：噬菌體的缺陷： 基因組太大（基因組太大（49kb）；）；酶切點(diǎn)太多酶切點(diǎn)太多:有有5個(gè)個(gè)BamH位點(diǎn)，位點(diǎn)，6個(gè)個(gè)Bg位點(diǎn)位點(diǎn)5個(gè)個(gè) EcoR位點(diǎn)。位點(diǎn)。 野生型只能接納一定長(zhǎng)度的野生型只能接納一定長(zhǎng)度的DNA。構(gòu)建構(gòu)建噬菌體載體的基本原理噬菌體載體的基本原理 切去非必須區(qū)

43、段，在切去的同時(shí)，加載目的切去非必須區(qū)段，在切去的同時(shí)，加載目的基因（基因（2.5kb或更大）；或更大）； 去掉太多的酶位點(diǎn)，每種酶只留去掉太多的酶位點(diǎn)，每種酶只留1-2個(gè)切口；個(gè)切口； 增加標(biāo)記基因增加標(biāo)記基因:噬菌體重組體分子不具抗生素噬菌體重組體分子不具抗生素抗性選擇標(biāo)記，主要是依據(jù)抗性選擇標(biāo)記，主要是依據(jù)X-gal-IPTG顯色反應(yīng)顯色反應(yīng)來(lái)篩選重組子和噬菌斑的形態(tài)學(xué)特征。來(lái)篩選重組子和噬菌斑的形態(tài)學(xué)特征。 按照這一基本原理構(gòu)建的按照這一基本原理構(gòu)建的噬菌體的派生載體，可以歸噬菌體的派生載體，可以歸納成兩種不同的類型：納成兩種不同的類型：插入型載體（插入型載體（insertion ve

44、ctors），），只具有一個(gè)可供只具有一個(gè)可供外源外源DNA插入的克隆位點(diǎn)。插入的克隆位點(diǎn)。替換型載體（替換型載體（rePlacement vectors），），具有成對(duì)的具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的 DNA區(qū)段可以被外源區(qū)段可以被外源插入的插入的 DNA片段所取代。片段所取代。 噬菌體載體相對(duì)于質(zhì)粒載體來(lái)說(shuō)，克隆片段較大，所噬菌體載體相對(duì)于質(zhì)粒載體來(lái)說(shuō)，克隆片段較大，所以一般用于以一般用于cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)的構(gòu)建。文庫(kù)或基因組文庫(kù)的構(gòu)建。 2.組裝組裝1.連接連接3.侵染侵染W(wǎng)hy? 由于由于噬菌體包裝時(shí)，當(dāng)噬菌體包裝時(shí)，當(dāng)DNADNA的長(zhǎng)度短于野

45、生的長(zhǎng)度短于野生型的型的78%78%或超過(guò)或超過(guò)105%105%時(shí)，噬菌體的活性就急劇時(shí)，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型下降。因此只包裝它的野生型DNADNA（48.5KB48.5KB）的的75%75%105%105%左右的左右的DNADNA，要求，要求載體載體DNADNA和外和外源源DNADNA長(zhǎng)度之和在長(zhǎng)度之和在393953kb53kb之間。之間。 插入式載體可攜帶的外源插入式載體可攜帶的外源DNADNA片段較替換式片段較替換式為小。為小。 gt10 gt10 載體載體 替換了一段來(lái)自替換了一段來(lái)自 434 噬菌體的片段噬菌體的片段 imm434 ，其中基因，其中基因 c 內(nèi)

46、內(nèi)有一個(gè)有一個(gè) EcoR 位點(diǎn)。位點(diǎn)。 EMBL3EMBL3 在填充片段兩端帶有在填充片段兩端帶有對(duì)稱的多克隆位點(diǎn)對(duì)稱的多克隆位點(diǎn) 柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體 cosmid vectorscosmid vectors一類由人工構(gòu)建的含有一類由人工構(gòu)建的含有DNA的的 cos序列序列和和質(zhì)粒復(fù)制子質(zhì)粒復(fù)制子的特的特殊類型的質(zhì)粒載體。該載體在體外重組后，可利用噬菌體殊類型的質(zhì)粒載體。該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，而是導(dǎo)入受體細(xì)胞。但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬

47、菌體，而是以質(zhì)粒以質(zhì)粒DNA的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體 cosmid vectors “cosmid”一詞是由英文一詞是由英文“cos site-carrying plasmid”縮寫而縮寫而成的，其原意是指成的，其原意是指帶有帶有粘粘性末端位點(diǎn)（性末端位點(diǎn)（cos）的質(zhì)）的質(zhì)粒粒，又稱又稱其為其為粘粒載體粘粒載體。粘粒載體粘粒載體 cosmid具有具有 噬菌體的特性：噬菌體的特性：cosmid vector的特點(diǎn)的特點(diǎn) 克隆外源克隆外源DNADNA后可以后可以體外包裝體外包裝成噬菌體顆粒。成噬菌體顆粒。在寄主細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)化在寄主細(xì)胞內(nèi)形成環(huán)化DNADNA

48、（但不能形成新的噬菌（但不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌）。體顆粒而溶菌）。具有質(zhì)粒載體的特性具有質(zhì)粒載體的特性方便選擇方便選擇高容量的克隆能力：高容量的克隆能力：45kb （最少不能低于（最少不能低于30kb）。）。 凡具有凡具有cos位點(diǎn)的任何位點(diǎn)的任何DNA分子只要其長(zhǎng)度相當(dāng)分子只要其長(zhǎng)度相當(dāng)于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結(jié)合而被包于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結(jié)合而被包裝成類似噬菌體裝成類似噬菌體的顆粒。因此，插入柯斯質(zhì)粒的的顆粒。因此，插入柯斯質(zhì)粒的外源外源DNA可大于可大于40kb。重組的柯斯質(zhì)?？上袷删?。重組的柯斯質(zhì)?？上袷删w體一樣感染大腸桿菌，并在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。一樣感染大腸

49、桿菌，并在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。柯斯克隆理論依據(jù)是柯斯克隆理論依據(jù)是: :1 1）在線性噬菌體）在線性噬菌體DNADNA分子的每一端，都具有一段彼此互補(bǔ)的單分子的每一端，都具有一段彼此互補(bǔ)的單鏈突出序列（鏈突出序列（coscos位點(diǎn)位點(diǎn)) )。2 2）在）在噬菌體的正常生命周期中，會(huì)產(chǎn)生出由數(shù)百個(gè)噬菌體的正常生命周期中，會(huì)產(chǎn)生出由數(shù)百個(gè)DNADNA拷拷貝組成的多連體分子。在此種分子中，貝組成的多連體分子。在此種分子中，前后兩個(gè)前后兩個(gè)DNADNA基因組之基因組之間都是通過(guò)間都是通過(guò)coscos位點(diǎn)連接起來(lái)的。位點(diǎn)連接起來(lái)的。3 3）噬菌體具有的一種位點(diǎn)特異的切割體系噬菌體具有的一種位點(diǎn)特異的切割體系

50、(site-specific (site-specific cutting system),cutting system),又叫又叫TerTer體系，體系，能識(shí)別兩個(gè)相距適宜的能識(shí)別兩個(gè)相距適宜的coscos位位點(diǎn)點(diǎn)(38-45kb)(38-45kb)，將多連體分子切割成將多連體分子切割成單位長(zhǎng)度的片段，并將它單位長(zhǎng)度的片段，并將它們包裝到們包裝到噬菌體頭部中去。噬菌體頭部中去。 2022-4-5104南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院人工染色體載體人工染色體載體人工染色體載體人工染色體載體人工染色體載體（人工染色體載體（artificial chromosome artificial chromos

51、ome vecter)vecter) : :又叫大分子又叫大分子DNADNA克隆載體，利用染克隆載體，利用染色體的色體的復(fù)制元件復(fù)制元件來(lái)驅(qū)動(dòng)外源來(lái)驅(qū)動(dòng)外源DNADNA片段片段復(fù)制復(fù)制的載的載體。體。（1）自主復(fù)制序列（自主復(fù)制序列（ARS） （autonomous replicating sequence） DNA復(fù)制起始點(diǎn)（復(fù)制起始點(diǎn)（ori）染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件：染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件：TELTELCENORI（2）著絲粒（）著絲粒（centromere，cen）（3）端粒（）端粒（telomeres，tel）人工染色體載體人工染色體載體酵母人工染色體載體（酵母人工染色

52、體載體（YACYAC）細(xì)菌人工染色體載體（細(xì)菌人工染色體載體（BACBAC）黏粒載體（黏粒載體（cosmid)cosmid)P1P1人工染色體載體（人工染色體載體（PACPAC）YAC的組成結(jié)構(gòu)的組成結(jié)構(gòu) 3.5.YAC載體的載體的選擇選擇標(biāo)記及標(biāo)記及篩選篩選標(biāo)記標(biāo)記選擇選擇標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因標(biāo)記：營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因篩選篩選標(biāo)記：標(biāo)記： SUP4宿主酵母菌：宿主酵母菌：trp- 和和 ura- 插入失活選擇：插入失活選擇：SUP4酶失活的酵母菌落呈酶失活的酵母菌落呈紅色；紅色； 不失活的菌落是白色。不失活的菌落是白色。（赭石突變抑制基因：（赭石突變抑制基因：UAA）ade2-1轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化Ura-/

53、Tra-YAC工作原理工作原理4.基因克隆的方法基因克隆的方法 基因的分離基因的分離 基因克?。壕褪抢没蚩寺。壕褪抢肈NA重組技術(shù)及其它重組技術(shù)及其它相關(guān)技術(shù)，相關(guān)技術(shù)，獲得目的（外源）基因獲得目的（外源）基因（DNA片段）并插入適當(dāng)?shù)钠危┎⒉迦脒m當(dāng)?shù)妮d體載體DNA分子分子中，并中，并能自我能自我“復(fù)制復(fù)制”，獲得大量目的基因，獲得大量目的基因（DNA片段）的過(guò)程。片段）的過(guò)程。 目的基因的制備目的基因的制備:n構(gòu)建基因組文庫(kù)構(gòu)建基因組文庫(kù)n構(gòu)建構(gòu)建cDNA基因文庫(kù)基因文庫(kù)n利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)n基因的化學(xué)合成基因的化學(xué)合成基因文庫(kù)基因文庫(kù)基因文庫(kù)基因文庫(kù)基因組

54、文庫(kù)基因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)文庫(kù) 基因組文庫(kù)：基因組文庫(kù)：來(lái)源于基因組來(lái)源于基因組DNA，反映，反映基因組的全部基因組的全部信息信息，用于基因組物理圖譜的構(gòu)建，基因組序列分析，用于基因組物理圖譜的構(gòu)建，基因組序列分析，基因在染色體上的定位，基因組中基因的結(jié)構(gòu)和組織基因在染色體上的定位，基因組中基因的結(jié)構(gòu)和組織形式等。形式等。 cDNA文庫(kù)：文庫(kù)：來(lái)源于細(xì)胞表達(dá)出的來(lái)源于細(xì)胞表達(dá)出的RNA，反映基因組，反映基因組表達(dá)的基因序列信息，用于研究特定細(xì)胞中基因的表表達(dá)的基因序列信息，用于研究特定細(xì)胞中基因的表達(dá)狀態(tài)和表達(dá)基因的功能等。達(dá)狀態(tài)和表達(dá)基因的功能等。 基因組文庫(kù)構(gòu)建 用克隆載體將某種生物的基因

55、組全部遺傳信息儲(chǔ)存于一個(gè)受體菌的群體，即構(gòu)成了這種生物的基因組文庫(kù)。n文庫(kù)能夠覆蓋整個(gè)基因組；n插入的片段比較大；n文庫(kù)比較穩(wěn)定，且容易保存和操作?；蚪M文庫(kù)必須符合的基本條件基因組文庫(kù)的大?。夯蚪M文庫(kù)的大小：nN=ln(1-P)/ln(1-f)N=ln(1-P)/ln(1-f)nN N：文庫(kù)必需的克隆數(shù)：文庫(kù)必需的克隆數(shù)nP P：文庫(kù)中目的：文庫(kù)中目的DNADNA片段的出現(xiàn)概率片段的出現(xiàn)概率 nf f：插入片段大?。翰迦肫未笮? /全基因組大小的比值全基因組大小的比值 期望值為期望值為0.990.99，插入片斷為，插入片斷為20kb20kb的的 E.coli E.coli (4.6(4.

56、610106 6 bp) bp) 和和 human (3human (310109 9 bp) bp) 基因組的克隆數(shù)的計(jì)算基因組的克隆數(shù)的計(jì)算N E.coli= =1.1 103 ln( 1-0.99) ln1-(2104/4.6106)Nhuman= = 6.9 105 ln(1-0.99) ln1-(2 104/3 109) 這個(gè)例子說(shuō)明用質(zhì)粒載體（插入片斷5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文庫(kù)，只需要幾千個(gè)克??；而真核生物則需要更大承載能力的載體。有一些序列不能被克隆有一些序列不能被克隆Example:Example: 1. 1.序列缺乏酶切位點(diǎn)序列缺乏酶切位點(diǎn); ; 2. 2

57、.目的基因包容在一個(gè)其大小范圍超出載體承目的基因包容在一個(gè)其大小范圍超出載體承載能力的載能力的DNADNA片段上。片段上。Too long for the vector used植物基因組文庫(kù)構(gòu)建的基本步驟：植物基因組文庫(kù)構(gòu)建的基本步驟：n大片段大片段DNADNA克隆載體的準(zhǔn)備；克隆載體的準(zhǔn)備；n大分子質(zhì)量的植物基因組大分子質(zhì)量的植物基因組DNADNA制備；制備；n大片段大片段DNADNA分子的部分酶切；分子的部分酶切；n載體與外源片段的連接；載體與外源片段的連接；n載體的遺傳轉(zhuǎn)化。載體的遺傳轉(zhuǎn)化。載體的選擇載體的選擇 根據(jù)基因組的大小選擇合適的載體構(gòu)建根據(jù)基因組的大小選擇合適的載體構(gòu)建DNA

58、DNA文庫(kù)。文庫(kù)。 載載 體體 Plasmid phage cosmid BAC YAC 插入片斷插入片斷 (kb) 5 23 45 350 1000 利用利用質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 構(gòu)建基因組文庫(kù)構(gòu)建基因組文庫(kù)BamHIMboIOHPOHHO脫磷酸化重組DNAT4 連接酶轉(zhuǎn)化E.coli基因組文庫(kù)總DNAHindIIIBamHISalIEcoRIPstIScaITcAmpRRpBR322(4.36 kb)OriHindIIIEcoRIPstIScaIAmpROriSalI該法簡(jiǎn)單、快速、易于該法簡(jiǎn)單、快速、易于操作，但僅適合一些低操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物。等真核生物和原核生物。利用

59、利用噬菌體噬菌體構(gòu)建基因組文庫(kù)構(gòu)建基因組文庫(kù)利利用用考考斯斯質(zhì)質(zhì)粒粒構(gòu)構(gòu)建建基基因因組組文文庫(kù)庫(kù)利用利用YACYAC構(gòu)建基構(gòu)建基因組文庫(kù)因組文庫(kù)cDNA文庫(kù)文庫(kù) cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)(completement (completement DNA Library)DNA Library)：某生物基因組：某生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部或部分轉(zhuǎn)錄的全部或部分mRNAmRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種錄產(chǎn)生的各種cDNAcDNA片段，分別片段，分別與載體重組而存在于一種受體與載體重組而存在于一種受體的群體，即的群體，即cDNAcDNA基因基因( (部分部分) )文文庫(kù)。庫(kù)?；蚪M文庫(kù)基因組文庫(kù) 包含該生物基

60、因組包含該生物基因組DNADNA全部的序列；全部的序列； 是具有生物種屬特異性的。是具有生物種屬特異性的。cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù) 已經(jīng)過(guò)剪接、去除了內(nèi)含子的已經(jīng)過(guò)剪接、去除了內(nèi)含子的cDNAcDNA； 具有組織細(xì)胞特異性。具有組織細(xì)胞特異性。cDNAcDNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建載體載體cDNAcDNA片段的制備片段的制備 分離細(xì)胞總分離細(xì)胞總RNARNA； 以以mRNAmRNA為模板，合成為模板，合成cDNAcDNA第一鏈；第一鏈； 雙鏈雙鏈cDNAcDNA的合成。的合成。 mRNAmRNA純化的方法：純化的方法： 以寡聚（以寡聚（dTdT）- -纖維素柱層析法最為有效。纖維素柱層析法最為有