CIK細(xì)胞制備標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上CIK細(xì)胞制備標(biāo)準(zhǔn)操作程序1 目的和范圍：1.1 目的：規(guī)范CIK細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，保證操作準(zhǔn)確，避免人為操作誤差導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)效果不良或失敗。1.2 范圍：該規(guī)程適用于實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)人員CIK細(xì)胞培養(yǎng)操作的全過(guò)程。2 原理：2.1 外周血單核細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞刺激因子誘導(dǎo)后分分化為CIK細(xì)胞。3 相關(guān)文件：3.1 4 物料：4.1 試劑：75%酒精，碘伏，生理鹽水，淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll），GT-T551培養(yǎng)基,CIK條件培養(yǎng)基1、CIK條件培養(yǎng)基2 。4.2 儀器設(shè)備：生物安全柜，離心機(jī)，水浴鍋，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，電動(dòng)移液槍，10ul移液槍，200ul移液槍，醫(yī)用剪刀，

2、醫(yī)用止血鉗，試管架。4.3 耗材： T175透氣培養(yǎng)瓶（175cm2Flask），T75透氣培養(yǎng)瓶（75cm2Flask），CO2透氣培養(yǎng)袋，15ml離心管，50ml離心管，5ml移液管，10ml移液管，50ml一次性注射器,5ml一次性注射器，200ul槍頭。5 記錄5.1 DC-CIK細(xì)胞制備記錄。6 職責(zé)：6.1 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)人員應(yīng)嚴(yán)格按照本規(guī)程的規(guī)定進(jìn)行CIK細(xì)胞培養(yǎng)操作。6.2 QA負(fù)責(zé)監(jiān)督細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)人員的操作全過(guò)程，確保CIK細(xì)胞培養(yǎng)操作的規(guī)范性。6.3 審核人負(fù)責(zé)保證本規(guī)程的審核和全過(guò)程準(zhǔn)確有效。7 工作程序：7.1 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：7.1.1 潔凈區(qū)及工作臺(tái)紫外照射30min，風(fēng)

3、機(jī)開(kāi)啟30分鐘。7.1.2 物料準(zhǔn)備：將已滅菌且在有效期內(nèi)器械放于物料傳遞窗進(jìn)行紫外照射，30min后，去包布，經(jīng)酒精擦拭后放入生物安全柜中備用。7.1.3 單核細(xì)胞分離液（Ficoll）提前30min從4冰箱取出待用。7.1.4 單核細(xì)胞分離液（Ficoll），GT-T551培養(yǎng)基，血清，在實(shí)驗(yàn)前需提前準(zhǔn)備好放入生物安全柜中，以便其恢復(fù)常溫，否則將會(huì)影響實(shí)驗(yàn)效果。12345677.17.1.1677.17.1.17.1.27.2 分離7.2.1 制備血漿：7.2.1.1 將樣本從醫(yī)療器械盒中小心地取出，用酒精擦拭消毒后放入生物安全柜。7.2.1.2 打開(kāi)器械盒（注意手不得從打開(kāi)的器械盒上方通

4、過(guò)），用生物安全柜中的止血鉗從器械盒中取出滅菌指示卡，確認(rèn)已滅菌。取出器械盒中止血鉗，用其夾緊血袋軟管下方。7.2.1.3 用浸泡過(guò)碘伏和酒精的棉簽對(duì)軟管中上部交替消毒兩次，（先碘伏，后酒精，如此交替兩次）用生物安全柜中的止血鉗取出器械盒中的醫(yī)用剪刀，用碘伏和酒精對(duì)其交替消毒兩次，用醫(yī)用剪刀將軟管剪斷。將全血轉(zhuǎn)移至50ml離心管，每管25ml。7.2.1.4 室溫1800rpm，離心10分鐘（離心機(jī)升降速以ST16為例:升9降4）。7.2.1.5 取上層血漿至50ml離心管，滅活（56水浴30min）。7.2.1.6 4放置30分鐘。7.2.1.7 2800rpm離心8min,，上清分于3支1

5、5ml離心管中，-20保存。7.2.2 提取PBMC：7.2.2.1 將生理鹽水經(jīng)酒精擦拭消毒后放入生物安全柜中，用碘伏和酒精對(duì)生理鹽水瓶瓶口進(jìn)行2次交替消毒后，用止血鉗將瓶塞扒開(kāi)并放置于工作臺(tái)右上方位置。7.2.2.2 按生理鹽水：血細(xì)胞=1.5:1對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行稀釋，混勻。7.2.2.3 按照1.5：1的比例，加生理鹽水至吸棄血漿后的樣本，混勻，緩慢加在Ficoll 液面上（方法：將離心管傾斜45°，在Ficoll液面上1cm處，緩慢注入稀釋的血細(xì)胞，不要打亂液面界面），加入后終體積不超過(guò)45ml， 2000 rpm，20min，室溫(注意：調(diào)整離心機(jī)加速和減速過(guò)程為最低，調(diào)電動(dòng)移

6、液槍輸出速度至最低）。7.2.2.4 離心后，小心取出離心管，可清晰看到細(xì)胞分層。注意輕拿輕放，保持離心管豎直放置，以免破壞細(xì)胞分層。7.2.2.5 用巴氏滴管緩慢提取Ficoll層與血漿層交界處的白膜層細(xì)胞，按照二個(gè)離心管對(duì)應(yīng)一個(gè)離心管進(jìn)行漂洗的原則，將提取的白膜層細(xì)胞裝入50ml離心管中。補(bǔ)充生理鹽水至45ml，混勻，1600rpm， 5分鐘。7.2.2.6 棄上清，用生理鹽水重懸，收集于一個(gè)50ml離心管中，補(bǔ)充生理鹽水至45ml。1200 rpm，10min。7.2.2.7 棄上清，再次添加生理鹽水重懸至45mL，混勻，取0.5ml中層懸液至1.5mlEP管中計(jì)數(shù)，1000rpm，10

7、min。7.2.2.8 取上清至15ml離心管中，標(biāo)記，送檢微生物并留樣，上清量應(yīng)滿足檢測(cè)及留樣要求，其余上清廢棄。7.2.3 接種：7.2.3.1 用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為12´106/ml。7.2.3.2 D0天完全培養(yǎng)基配制：每20ml培養(yǎng)基（10%自體血清）添加1支CIK條件培養(yǎng)基（規(guī)格：500ul/支）。7.2.3.3 混勻，根據(jù)培養(yǎng)液體積添加到25cm2Flask或者75cm2Flask中。7.2.3.4 水平放入37，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.2.3.5 填寫相關(guān)記錄,清場(chǎng)。7.3 加液7.3.1 時(shí)間及方式：當(dāng)培養(yǎng)基顏色變黃或細(xì)胞濃度接近飽和時(shí)，以倍增方式補(bǔ)液。7

8、.3.1.1 一般加液時(shí)間為：D2，D4，D6，D8，D10，D12（加液時(shí)間視細(xì)胞具體生長(zhǎng)情況可提前或延后）。7.3.1.2 D2-D14天，完全培養(yǎng)基的配制：每瓶培養(yǎng)基（1000ml）添加1支CIK條件培養(yǎng)基2（規(guī)格：1ml/支）7.3.2 添加方法：輕輕搖勻，避免起氣泡；擰好瓶蓋，水平放入37、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。7.4 轉(zhuǎn)瓶：當(dāng)75cm²Flask細(xì)胞懸液總體積達(dá)到60ml，且需要繼續(xù)補(bǔ)液時(shí)。7.4.1 將75cm²Flask中細(xì)胞懸液全部倒入新的1752Flask培養(yǎng)瓶中。7.4.2 向75cm²Flask中添加適量培養(yǎng)基對(duì)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞進(jìn)行涮洗并倒入1

9、752Flask培養(yǎng)瓶中，再添加適量新鮮培養(yǎng)基（加5%自體血清）。7.4.3 擰緊175cm²Flask瓶蓋，水平放入37，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.5 轉(zhuǎn)袋或分瓶：當(dāng)175cm²Flask中細(xì)胞懸液總體積達(dá)到250ml，且需要繼續(xù)補(bǔ)液時(shí)。轉(zhuǎn)袋：7.5.1 取50ml注射器，棄去針頭及助推器。放入注射器支架的圓孔內(nèi)。7.5.2 用碘伏和酒精對(duì)培養(yǎng)袋導(dǎo)管蓋子下1-2處交替消毒兩次。7.5.3 用止血鉗取下前端蓋子，連接管口與注射器。7.5.4 將175 cm²Flask中的細(xì)胞懸液緩慢倒入注射器內(nèi)。7.5.5 用適量培養(yǎng)基涮洗175 cm²Flask

10、，按7.3.1.3和7.3.2.2的方法繼續(xù)向細(xì)胞培養(yǎng)袋中添加培養(yǎng)基，至加液總體積達(dá)到應(yīng)添加量。7.5.6 培養(yǎng)基添加完畢，用止血鉗夾緊導(dǎo)管前端，將細(xì)管與注射器分離并將細(xì)管抬高，確保培養(yǎng)基全部進(jìn)入細(xì)胞袋中。用止血鉗將細(xì)管蓋子蓋上并擰緊，用塑料夾將導(dǎo)管末端夾緊。7.5.7 將培養(yǎng)袋平放，用雙手輕輕按摩袋子十余下，使細(xì)胞與培養(yǎng)基混勻。用碘伏和酒精對(duì)培養(yǎng)袋取樣口進(jìn)行交替消毒，用一次性注射器取樣0.5ml，標(biāo)記，送檢微生物檢測(cè)。7.5.8 培養(yǎng)袋標(biāo)記后雙手托住培養(yǎng)袋下方自生物安全柜中取出，用托盤將其送至培養(yǎng)室，水平放入37，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7.5.9 分瓶：按培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基體積等分，按倍增

11、的方式分瓶培養(yǎng)，加液按步驟7.3.1.3和7.3.2.2要求添加新鮮培養(yǎng)基。分瓶完畢，擰好蓋子，每個(gè)培養(yǎng)瓶均做好標(biāo)記后放入37，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱。（此步驟僅適用于分瓶培養(yǎng)）7.5.10 填寫相關(guān)記錄。7.5.11 培養(yǎng)袋轉(zhuǎn)移方法：放置在托盤上。7.6 分袋：計(jì)劃需求且培養(yǎng)袋中細(xì)胞懸液總體積達(dá)到1000ml時(shí)。7.6.1 混勻后對(duì)應(yīng)將樣本掛于生物安全柜中的掛鉤上。7.6.2 取50ml注射器，棄去針頭及助推器。放入注射器支架的圓孔內(nèi)。7.6.3 取新的細(xì)胞培養(yǎng)袋，用碘伏和酒精對(duì)其蓋子下1-2處交替消毒兩次。用止血鉗取下蓋子，連接管口與注射器。7.6.4 用止血鉗夾緊原培養(yǎng)袋導(dǎo)管，碘伏和酒精對(duì)

12、其蓋子以下1-2處交替消毒兩次，取下蓋子。（注意開(kāi)蓋時(shí)，細(xì)管的前端應(yīng)高于培養(yǎng)袋中細(xì)胞培養(yǎng)液的液面，并且培養(yǎng)袋塑料夾處取夾緊狀態(tài)，防止在擰開(kāi)蓋子時(shí)，液體突然涌出）7.6.5 再次混勻后，松開(kāi)止血鉗，通過(guò)注射器將原培養(yǎng)袋中的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)袋。加液時(shí)（按7.3.1.3和7.3.2.2步驟），當(dāng)液面增至注射器套筒50ml刻度線后，停止加液并松開(kāi)新增培養(yǎng)袋導(dǎo)管止血鉗，使液面降至0刻度線，再次用止血鉗夾緊新增培養(yǎng)袋細(xì)管并加液，按上述方法每50ml一次，重復(fù)數(shù)次進(jìn)行加液，至原培養(yǎng)袋中一半培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入新增培養(yǎng)袋。用止血鉗夾緊細(xì)管前端，將其置于生物安全柜左上角。7.6.6 填寫相關(guān)記錄，清場(chǎng)。7.7 細(xì)胞

13、收獲：7.7.1 檢查培養(yǎng)袋標(biāo)記是否與回輸計(jì)劃相符。7.7.2 取出，酒精擦拭消毒后，放入生物安全柜，掛于生物安全柜內(nèi)的掛鉤上。7.7.3 取若干50ml離心管，標(biāo)記，擰開(kāi)離心管蓋，整齊的置于工作臺(tái)上方，調(diào)整離心管刻度朝向操作者。7.7.4 混勻培養(yǎng)袋中細(xì)胞懸液。用止血鉗夾緊培養(yǎng)袋導(dǎo)管，碘伏與酒精對(duì)導(dǎo)管蓋子下方1-2cm處進(jìn)行交替消毒，擰開(kāi)培養(yǎng)袋的蓋子并放于工作臺(tái)左前方。7.7.5 一手握止血鉗，一手拿導(dǎo)管，慢慢松開(kāi)止血鉗，由慢到快將細(xì)胞懸液引入離心管中。7.7.6 操作中導(dǎo)管口應(yīng)處于離心管口正上方，待離心管裝滿細(xì)胞懸液后，夾緊導(dǎo)管，轉(zhuǎn)移至另一離心管中繼續(xù)添加細(xì)胞懸液，直至達(dá)到收集體積。7.7

14、.7 將導(dǎo)管口抬起，使部分培養(yǎng)基回流，若還需添加新鮮培養(yǎng)基，則用止血鉗將導(dǎo)管前端夾緊，放置于工作臺(tái)左上方，待離心管移出生物安全柜后，可立即進(jìn)行加液處理。若不進(jìn)行加液則擰上導(dǎo)管蓋子，并用塑料夾將導(dǎo)管末端夾緊，移出安全柜，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。7.7.8 細(xì)胞清洗：7.7.8.1 配平，1300rpm，8分鐘。7.7.8.2 用碘伏和酒精對(duì)生理鹽水瓶口進(jìn)行交替消毒2次，用止血鉗拔開(kāi)橡膠塞，將生理鹽水置于工作臺(tái)右上方備用。7.7.8.3 待離心完畢，棄上清，收集細(xì)胞于兩個(gè)離心管中，1300rpm離心8分鐘。7.7.8.4 廢上清，收集細(xì)胞于一個(gè)離心管管中，添加生理鹽水至45ml，混勻，取0.5ml中間

15、層懸液計(jì)數(shù)及活率檢測(cè)。7.7.8.5 1300rpm，8分鐘，取上清至15ml離心管中作革蘭氏、內(nèi)毒素檢測(cè)并留樣，多余的廢棄。7.7.8.6 用生理鹽水重懸細(xì)胞，如無(wú)自體血清用5ml 人血白蛋白和15ml生理鹽水重懸細(xì)胞，混勻。7.7.9 裝袋或裝瓶，100ml/瓶或袋：7.7.9.1 取出轉(zhuǎn)移袋，消毒后移入安全柜，用止血鉗夾住轉(zhuǎn)移袋導(dǎo)管，用碘伏和酒精對(duì)止血鉗上方導(dǎo)管進(jìn)行交替消毒兩次。7.7.9.2 用止血鉗將已高壓滅菌的剪刀從器械盒中取出，經(jīng)碘伏和酒精交替消毒后，將轉(zhuǎn)移袋細(xì)管從已消毒部分傾斜剪斷。7.7.9.3 取50ml注射器，拔掉推塞后與轉(zhuǎn)移袋細(xì)管通過(guò)針頭連接口連接。7.7.9.4 將細(xì)胞懸液通過(guò)注射器套筒導(dǎo)入轉(zhuǎn)移袋，再用適量生理鹽水對(duì)離心管進(jìn)行涮洗并導(dǎo)入轉(zhuǎn)移袋保證終體積為100ml/袋，反復(fù)混勻（留樣1ml細(xì)胞稀釋液，標(biāo)注個(gè)人信息，無(wú)菌密封好-20冰箱永久保存。7.7.9.5 將轉(zhuǎn)移袋中空氣全部排出后，用止血鉗夾緊導(dǎo)管并移出生物安全柜。7.7.9.6 熱合，剪掉多余部分，在回輸袋上粘貼相應(yīng)的回輸信息標(biāo)簽（核對(duì)姓名，ID號(hào)，性別等），用外包裝袋密封后，傳出潔凈區(qū)。7.7.9.7 填寫相關(guān)記錄。7.8 微生物檢測(cè)控制點(diǎn)與回輸質(zhì)量控制：7.8.1 細(xì)