biacore 3000 原理和buffer要求

1、BIAcore 3000生物分子相互作用分析儀原理和操作注意事項 BIA（Biomolecular Interaction Analysis）提供了實時觀察生物分子間相互作用的技術(shù)。通過它能觀察兩種分子結(jié)合的特異性，能知道兩種分子的結(jié)合有多強(qiáng)，還能了解生物分子的結(jié)合過程共有多少個協(xié)同者和參與者。BIA可以讓得到用其他技術(shù)方法難以得到的結(jié)果，因為它可以實時反映分子結(jié)合過程中每一秒變化的情況。無需借助標(biāo)記物進(jìn)行分析使BIA廣泛應(yīng)用于各類生物體系的測定，從各類小分子化合物、多肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和寡聚糖直至類脂、噬菌體、病毒和細(xì)胞。BIA就是利用金屬薄膜表面的折射率的改變，引起共振角的變化，來推斷金

2、屬薄膜表面的變化。實驗時先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面，將與之相互作用的分子溶于溶液流過芯片表面。檢測器能跟蹤檢測溶液中的分子與芯片表面分子的結(jié)合、解離整個過程的變化。BIA技術(shù)是基于一種表面等離子共振（SPR）的物理光學(xué)現(xiàn)象的生物傳感分析技術(shù)。不必使用熒光標(biāo)記和同位素標(biāo)記，從而保持了生物分子的天然活性。當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同透明介質(zhì)的界面時將產(chǎn)生全反射，且反射光強(qiáng)度在各個角度上都應(yīng)相同，但若在介質(zhì)表面鍍上一層金屬薄膜后，由于入射光可以引起金屬中自由電子的共振，從而導(dǎo)致反射光在一定的角度內(nèi)大大減弱，其中使反射光完全消失的角度稱為共振角。共振角會隨金屬薄膜表面通過的液相的折射率的改

3、變而改變，折射率的變化（RU）又和結(jié)合在金屬表面的大分子質(zhì)量成正比。因此，BIA技術(shù)可以通過對反應(yīng)全過程中各種分子反射光的吸收獲得初始的數(shù)據(jù)，并經(jīng)相關(guān)處理獲得結(jié)果傳感圖。一 各種傳感片的理化特性及用途傳感器芯片是實時信號傳導(dǎo)的載體。芯片結(jié)構(gòu)是在玻璃片上覆蓋了一層金膜，各種類型的芯片在金膜表面連有不同的多聚物以形成不同的表面環(huán)境，利于固定不同性質(zhì)的生物分子。實驗時先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面，將與之相互作用的分子溶于溶液流過芯片表面。檢測器能跟蹤檢測溶液中的分子與芯片表面的分子結(jié)合、解離整個過程的變化。目前傳感器芯片的種類有十余種。 根據(jù)傳感器芯片表面的物理化學(xué)特性適合耦聯(lián)不同的蛋白質(zhì)或

4、其它生物大分子。一張傳感器芯片固定耦聯(lián)同一種蛋白質(zhì)或其它生物大分子，可反復(fù)使用十次以上。傳感器芯片耦聯(lián)細(xì)胞時則需要保證細(xì)胞的數(shù)量和結(jié)構(gòu)的完整。目前平臺備有CM5、SA、NTA現(xiàn)貨，可供大家使用。1. 傳感片CM5用途最廣的芯片傳感片CM5表面覆蓋了一層葡聚糖。帶有化學(xué)基團(tuán)如NH2，SH，CHO，OH，COOH的生物分子（Ligand）可通過化學(xué)反應(yīng)，以共價鍵耦聯(lián)的方式與葡聚糖上的羧基耦聯(lián)。從而使生物分子耦聯(lián)到傳感片表面。2. 傳感片SA捕獲生物素標(biāo)記的肽片段、蛋白質(zhì)、DNA傳感片SA表面覆蓋了一層鏈霉抗生物素（Streptavidin），能與被生物素標(biāo)記的分子量大小各異的肽片段、蛋白質(zhì)、DNA

5、結(jié)合。是研究DNADNA，RNADNA，RNA蛋白質(zhì)間相互作用的理想芯片。3. 傳感片NTA通過金屬螯合作用捕獲生物分子（Ligands）傳感片NTA表面耦聯(lián)了氨三乙酸（NTA），通過鎳組氨酸修飾離子螯合作用將末端組氨酸修飾的生物分子（Ligands）連接到芯片表面。類似組氨酸修飾的親和層析，組氨酸修飾在生物分子的末端，因此用次法將生物分子連接到芯片，可以很好地保持生物分子的空間結(jié)構(gòu)。4. 傳感片HPA構(gòu)建細(xì)胞膜研究模型傳感片HPA提供了一個疏水表面，研究者可方便地在芯片表面鋪上脂質(zhì)體。要研究的受體就嵌在磷酸分子層中，因此HPA芯片是研究細(xì)胞膜受體在膜環(huán)境中與配體相互作用的理想芯片。5. 傳感

6、片L1直接抓住細(xì)胞的芯片傳感片L1表面由親脂的葡聚糖化合物組成，該化合物能直接插入磷脂雙分子層將脂質(zhì)體或細(xì)胞抓獲到芯片表面。可研究位于與膜內(nèi)外或跨膜的蛋白、受體等，是研究膜蛋白信號傳導(dǎo)的理想芯片。二 樣本的要求1 通過等電聚焦或者使用軟件預(yù)測，確定待分析蛋白的等電點(diǎn)。對等電點(diǎn)高于7或者小于3的蛋白一般不推薦進(jìn)行Biacore分析，特殊需求可與相關(guān)技術(shù)人員進(jìn)行個例商討。2 固定于傳感片上的靶蛋白（例如：受體蛋白）和待分析蛋白，純度要達(dá)到95以上。3 用PBS（或者用戶蛋白所需的特殊緩沖液）對蛋白溶液進(jìn)行透析，然后濃縮至200ug/ml1mg/ml的濃度。4 化合物溶解在含1 DMSO的HBS緩沖

7、液中，并稀釋成10-5M和10-6M兩種濃度進(jìn)行初步分析；初步分析呈陽性的化合物再用含1 DMSO的緩沖液稀釋成10-5M，510-6M，210-6M，110-6M，510-7M和110-7M的濃度梯度進(jìn)行動力學(xué)常數(shù)分析。5 如果化合物無法溶解在含1 DMSO的HBS緩沖液中，則可以提高DMSO的濃度，最高可至1%的濃度。同時配制相應(yīng)濃度的DMSO緩沖液作為對照進(jìn)行實驗。HBS：HBS-EP緩沖液（有現(xiàn)貨）：常用的緩沖溶液，0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005% v/v Surfactant P20HBS-P緩沖溶液：0.01M HEPES，

8、pH7.4，0.15M NaCl，0.005% v/v Surfactant P20HBS-N緩沖溶液：0.01M HEPES，pH7.4，0.15M NaClPBS 10X緩沖溶液：pH 7.4 的PBS，5%DMSO（二甲基亞砜），適合小分子化合物的分析三 操作流程1. 樣品準(zhǔn)備 樣品包括耦聯(lián)到芯片表面的分子（ligand）和在溶液中流過的樣品，稱作analyte。如果ligand是小分子，要檢查該分子結(jié)構(gòu)上是否有可供耦聯(lián)的氨基基團(tuán)，如果沒有需要考慮對分子進(jìn)行修飾。2. 緩沖液準(zhǔn)備 該實驗要求所有緩沖液都經(jīng)過過濾和脫氣處理。如果緩沖液能夠耐受高溫的話，可以對緩沖液進(jìn)行滅菌處理。這樣滅菌有脫氣的效果，同時也能保存更長的時間。3. 耦聯(lián) 參照耦聯(lián)的具體方法。由于芯片表面帶有負(fù)電，因此要耦聯(lián)到芯片上的分子必須帶上正電，才有利于分子吸附到芯片表面，以利于共價耦聯(lián)反應(yīng)的完成。預(yù)結(jié)合實驗就是將樣品溶解在不同PH值的緩沖液中，使其帶上不同量的電荷。然后，將樣品流過芯片表面，觀察它與芯片的結(jié)合曲線，就