流式細(xì)胞儀培訓(xùn)

1、流式細(xì)胞儀原理與應(yīng)用流式細(xì)胞儀原理與應(yīng)用陳玉嬋陳玉嬋提提 要要n流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介n流式細(xì)胞儀工作原理流式細(xì)胞儀工作原理n流式實(shí)驗(yàn)流程流式實(shí)驗(yàn)流程n流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展史流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展史n1930s1950s:1930s1950s:開(kāi)始出現(xiàn)自動(dòng)細(xì)胞分析技術(shù)（細(xì)開(kāi)始出現(xiàn)自動(dòng)細(xì)胞分析技術(shù)（細(xì)胞的計(jì)數(shù)，是通過(guò)光電儀記錄流過(guò)一根毛細(xì)管胞的計(jì)數(shù)，是通過(guò)光電儀記錄流過(guò)一根毛細(xì)管的細(xì)胞的細(xì)胞, ,用結(jié)合了熒光素的抗體去標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)用結(jié)合了熒光素的抗體去標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白，應(yīng)用分層鞘流原理，成功的設(shè)計(jì)的特定蛋白，應(yīng)用分層鞘流原理，成功的設(shè)計(jì)紅細(xì)胞光學(xué)自動(dòng)計(jì)數(shù)器。）紅細(xì)胞

2、光學(xué)自動(dòng)計(jì)數(shù)器。） n1960s1960s晚期發(fā)展：熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì)晚期發(fā)展：熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì) 、細(xì)胞分選、細(xì)胞分選器檢測(cè)細(xì)胞的熒光信號(hào)器檢測(cè)細(xì)胞的熒光信號(hào) 、單克隆抗體技術(shù)、單克隆抗體技術(shù) n19731973年，年，BDBD公司與美國(guó)斯坦福大學(xué)合作，研制公司與美國(guó)斯坦福大學(xué)合作，研制開(kāi)發(fā)并生產(chǎn)了世界第一臺(tái)商用流式細(xì)胞儀開(kāi)發(fā)并生產(chǎn)了世界第一臺(tái)商用流式細(xì)胞儀FACS FACS I I。什么是流式細(xì)胞儀？什么是流式細(xì)胞儀？n在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞各種物理及生物特征的一種儀器在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞各種物理及生物特征的一種儀器n儀器特點(diǎn)：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞通過(guò)狹窄激光束，產(chǎn)生能夠反映細(xì)胞儀器特點(diǎn)：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞通過(guò)狹窄激

3、光束，產(chǎn)生能夠反映細(xì)胞大小的信號(hào)，激光束激發(fā)不同的熒光素所標(biāo)記的細(xì)胞成分大小的信號(hào)，激光束激發(fā)不同的熒光素所標(biāo)記的細(xì)胞成分能發(fā)射出不同的熒光。能發(fā)射出不同的熒光。Injector TipSheath fluid流式細(xì)胞儀的檢測(cè)對(duì)象流式細(xì)胞儀的檢測(cè)對(duì)象藻類(lèi)細(xì)胞藻類(lèi)細(xì)胞染色體染色體血細(xì)胞血細(xì)胞原生動(dòng)物細(xì)胞原生動(dòng)物細(xì)胞任何存在于懸液中的直徑為任何存在于懸液中的直徑為0.2-50微米微米的粒子或細(xì)胞都適用于流式分析的粒子或細(xì)胞都適用于流式分析流式細(xì)胞儀工作原理示意圖流式細(xì)胞儀工作原理示意圖流式的基本組流式的基本組成：成：1.流動(dòng)室和流動(dòng)室和 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)2.光路系統(tǒng)光路系統(tǒng)3.電系統(tǒng)電系統(tǒng)流式細(xì)胞

4、儀可提供的信息流式細(xì)胞儀可提供的信息n物理信息：通過(guò)散射光信號(hào)反映物理信息：通過(guò)散射光信號(hào)反映n相對(duì)細(xì)胞大小相對(duì)細(xì)胞大小n相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度n熒光信息：通過(guò)熒光強(qiáng)度反映熒光信息：通過(guò)熒光強(qiáng)度反映 散射光信號(hào)的產(chǎn)生散射光信號(hào)的產(chǎn)生n488nm激光產(chǎn)生散射光激光產(chǎn)生散射光1. 散射光信號(hào)散射光信號(hào)n前向角散射光（前向角散射光（FSC,Forward Scatter） 入射激光的入射激光的同向同向散射光信號(hào)散射光信號(hào) 反映細(xì)胞相對(duì)反映細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積大小及其表面積n側(cè)向角散射光（側(cè)向角散射光（SSC, Side Scatter） 入射激光入射激光90 角角

5、的的散射光信號(hào)散射光信號(hào) 反映細(xì)胞反映細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性 散射光散射光n散射光能被用來(lái)區(qū)分不同細(xì)胞群體的基散射光能被用來(lái)區(qū)分不同細(xì)胞群體的基本形態(tài)上的差異本形態(tài)上的差異n通常使用通常使用“散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖”來(lái)看散射光信號(hào)來(lái)看散射光信號(hào)n散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)細(xì)胞顆粒散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)就代表一個(gè)細(xì)胞顆粒的數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù) 利用散射光信號(hào)對(duì)混合細(xì)胞分群利用散射光信號(hào)對(duì)混合細(xì)胞分群2. 熒光信號(hào)熒光信號(hào)n熒光素與特異抗體結(jié)合熒光素與特異抗體結(jié)合n熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號(hào)越強(qiáng)熒光信號(hào)越強(qiáng)熒光信號(hào)的表示方法熒光信號(hào)的表示方法雙參數(shù)

6、點(diǎn)圖雙參數(shù)點(diǎn)圖單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖一個(gè)完整流式實(shí)驗(yàn)的組成一個(gè)完整流式實(shí)驗(yàn)的組成n樣品的處理樣品的處理n調(diào)整儀器條件調(diào)整儀器條件n數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理1.樣品處理樣品處理n單細(xì)胞懸液的制備單細(xì)胞懸液的制備n濃度濃度5 5 10105 5 1 1 10106 6/mL/mLn外周血、骨髓、培養(yǎng)細(xì)胞、組織外周血、骨髓、培養(yǎng)細(xì)胞、組織( (經(jīng)尼龍網(wǎng)經(jīng)尼龍網(wǎng)300300目目過(guò)過(guò)濾濾) ) 制成單細(xì)胞懸液制成單細(xì)胞懸液n選擇合適的熒光染料染色選擇合適的熒光染料染色n必須能夠被流式細(xì)胞儀上所配備的激光器所激發(fā)必須能夠被流式細(xì)胞儀上所配備的激光器所激發(fā)n激發(fā)的光譜必須在儀器上濾光片能夠接受的合適范激發(fā)的光譜必

7、須在儀器上濾光片能夠接受的合適范圍內(nèi)圍內(nèi)n熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少熒光素光譜的重疊應(yīng)當(dāng)盡量減少2.儀器條件的確定儀器條件的確定n電壓電壓n閾值閾值n熒光補(bǔ)償（多色分析）熒光補(bǔ)償（多色分析）n處在液流中的粒子通過(guò)激光束時(shí)產(chǎn)生光信號(hào)，這些處在液流中的粒子通過(guò)激光束時(shí)產(chǎn)生光信號(hào)，這些光信號(hào)通過(guò)光電探測(cè)器轉(zhuǎn)換成電信號(hào)（電壓）。調(diào)光信號(hào)通過(guò)光電探測(cè)器轉(zhuǎn)換成電信號(hào)（電壓）。調(diào)整電壓，可使信號(hào)強(qiáng)度改變。整電壓，可使信號(hào)強(qiáng)度改變。nBDBD流式細(xì)胞儀有兩種類(lèi)型的光電探測(cè)器：光電二極流式細(xì)胞儀有兩種類(lèi)型的光電探測(cè)器：光電二極管和光電倍增管（管和光電倍增管（PMTsPMTs）。）。 nPMTPMT用于檢測(cè)較弱

8、的用于檢測(cè)較弱的SSCSSC信號(hào)和熒光信號(hào)信號(hào)和熒光信號(hào) ，光電二，光電二極管用于檢測(cè)較強(qiáng)的極管用于檢測(cè)較強(qiáng)的FSCFSC信號(hào)信號(hào) 電壓電壓閾值閾值n閾值：閾值：信號(hào)放大過(guò)程會(huì)產(chǎn)生不需要的脈沖信號(hào)，通常信號(hào)放大過(guò)程會(huì)產(chǎn)生不需要的脈沖信號(hào)，通常來(lái)自于碎片。通過(guò)設(shè)定某一信號(hào)的最低強(qiáng)度值，可將來(lái)自于碎片。通過(guò)設(shè)定某一信號(hào)的最低強(qiáng)度值，可將不需要的脈沖信號(hào)去除，這一設(shè)定值稱為閾值。不需要的脈沖信號(hào)去除，這一設(shè)定值稱為閾值。熒光補(bǔ)償熒光補(bǔ)償n采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差熒光補(bǔ)償熒光補(bǔ)償補(bǔ)償調(diào)整的實(shí)驗(yàn)過(guò)程補(bǔ)償調(diào)整的實(shí)驗(yàn)過(guò)程n樣本準(zhǔn)備：陰性樣本

9、，單陽(yáng)性樣本樣本準(zhǔn)備：陰性樣本，單陽(yáng)性樣本n調(diào)整：第一步：陰性樣本調(diào)整所有調(diào)整：第一步：陰性樣本調(diào)整所有PMT 第二步：?jiǎn)侮?yáng)性樣本調(diào)整補(bǔ)償?shù)诙剑簡(jiǎn)侮?yáng)性樣本調(diào)整補(bǔ)償n判斷標(biāo)準(zhǔn)：判斷標(biāo)準(zhǔn)：補(bǔ)償模型補(bǔ)償模型PE-X%FITC補(bǔ)償前補(bǔ)償前補(bǔ)償后補(bǔ)償后FITC單染單染數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析n設(shè)門(mén)設(shè)門(mén)n設(shè)定陰性與陽(yáng)性群體的界限設(shè)定陰性與陽(yáng)性群體的界限n確定陽(yáng)性與陰性細(xì)胞群體確定陽(yáng)性與陰性細(xì)胞群體n統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性或陰性細(xì)胞群體的百分率，平統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性或陰性細(xì)胞群體的百分率，平均熒光值，絕對(duì)數(shù)或抗體結(jié)合數(shù)均熒光值，絕對(duì)數(shù)或抗體結(jié)合數(shù)設(shè)門(mén)設(shè)門(mén)n設(shè)門(mén)的意義：選定要分析的目標(biāo)細(xì)胞設(shè)門(mén)的意義：選定要分析的目標(biāo)細(xì)胞設(shè)門(mén)設(shè)門(mén)如何設(shè)定陰

10、性與陽(yáng)性的界限如何設(shè)定陰性與陽(yáng)性的界限流式檢測(cè)結(jié)果的表示方法流式檢測(cè)結(jié)果的表示方法n百分率百分率n絕對(duì)計(jì)數(shù)絕對(duì)計(jì)數(shù)n平均熒光強(qiáng)度平均熒光強(qiáng)度n圖形：直方圖、散點(diǎn)圖圖形：直方圖、散點(diǎn)圖流式細(xì)胞儀可以告訴我們什么？流式細(xì)胞儀可以告訴我們什么？流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞學(xué)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞學(xué)應(yīng)用細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞結(jié)構(gòu)n細(xì)胞大小細(xì)胞大小n細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞學(xué)應(yīng)用粒度胞學(xué)應(yīng)用粒度n細(xì)胞表面面積細(xì)胞表面面積n核漿比例核漿比例nDNADNA含量與細(xì)胞周期含量與細(xì)胞周期nRNARNA含量含量n蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量n染色體分析染色體分析 細(xì)胞功能細(xì)胞功能n細(xì)胞表面細(xì)胞表面/ /胞漿胞漿/ /核的核的特異性

11、抗原特異性抗原n細(xì)胞活性細(xì)胞活性n細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子n酶活性酶活性n激素結(jié)合位點(diǎn)激素結(jié)合位點(diǎn)n細(xì)胞受體細(xì)胞受體n細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀在微生物研究中的應(yīng)用流式細(xì)胞儀在微生物研究中的應(yīng)用nDNADNAn蛋白蛋白n過(guò)氧化物生成過(guò)氧化物生成n胞內(nèi)胞內(nèi)pHpHn鑒別死鑒別死/ /活細(xì)菌和酵母菌并計(jì)數(shù)活細(xì)菌和酵母菌并計(jì)數(shù)n區(qū)分革蘭氏陽(yáng)區(qū)分革蘭氏陽(yáng)/ /陰性細(xì)菌陰性細(xì)菌n研究酵母菌細(xì)胞器研究酵母菌細(xì)胞器n基因表達(dá)基因表達(dá)- -綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白n病原菌與吞噬細(xì)胞的關(guān)系病原菌與吞噬細(xì)胞的關(guān)系- -吞噬引起的呼吸爆發(fā)吞噬引起的呼吸爆發(fā)n病毒病毒- -細(xì)胞相互作用：病毒感染導(dǎo)致細(xì)胞蛋白表達(dá)的

12、改細(xì)胞相互作用：病毒感染導(dǎo)致細(xì)胞蛋白表達(dá)的改變，對(duì)細(xì)胞周期的干擾，對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的影響變，對(duì)細(xì)胞周期的干擾，對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的影響n病毒引起的凋亡病毒引起的凋亡流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用=HIVHIV免疫分型，免疫分型，CD4CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)絕對(duì)計(jì)數(shù)=白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型=腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析腫瘤的細(xì)胞周期和倍體分析=網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)=細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞移植的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測(cè)=干細(xì)胞計(jì)數(shù)干細(xì)胞計(jì)數(shù)=殘量白血病細(xì)胞檢查殘量白血病細(xì)胞檢查=HLA-B27HLA-B27檢查檢查=血小板功能及相關(guān)疾病血小板功能及相關(guān)

13、疾病補(bǔ)償調(diào)整實(shí)驗(yàn)補(bǔ)償調(diào)整實(shí)驗(yàn)藻類(lèi)細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)藻類(lèi)細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期分析nDNADNA含量分析含量分析-PI-PI染色染色細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡n細(xì)胞膜分析細(xì)胞膜分析-PS-PS外翻外翻 PSPS（磷脂酰絲氨酸）正常暴露在胞膜的內(nèi)表（磷脂酰絲氨酸）正常暴露在胞膜的內(nèi)表面，凋亡時(shí)，面，凋亡時(shí)，PSPS外翻向細(xì)胞外表面。重組蛋白外翻向細(xì)胞外表面。重組蛋白Annexin-VAnnexin-V可與可與PSPS結(jié)合結(jié)合細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞生理學(xué)研究nCaCa2+2+流動(dòng)性檢測(cè)流動(dòng)性檢測(cè)nCaCa2+2+ 是非常重要的細(xì)胞內(nèi)離子，在胞膜到是非常重要的細(xì)胞內(nèi)離子，在胞膜到胞漿的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中

14、起重要的作用。細(xì)胞受到胞漿的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的作用。細(xì)胞受到刺激后，胞內(nèi)刺激后，胞內(nèi)CaCa2+2+濃度會(huì)發(fā)生改變。濃度會(huì)發(fā)生改變。n最常用的染料最常用的染料nIndo-1 excited at UVnFluo-3 excited at 488nmnFura red excited at 488nm細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞生理學(xué)研究n細(xì)胞活性分析細(xì)胞活性分析 Fluorescein DiacetateFluorescein Diacetate進(jìn)入活細(xì)胞后進(jìn)入活細(xì)胞后, ,被胞內(nèi)被胞內(nèi)酯酶降解酯酶降解, ,生成熒光底物生成熒光底物. .活細(xì)胞會(huì)發(fā)綠色熒光活細(xì)胞會(huì)發(fā)綠色熒光細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞生理學(xué)研究n細(xì)胞膜電位的改變細(xì)胞膜電位的改變n超極化的細(xì)胞攝取更多的染料，細(xì)胞總的熒超極化的細(xì)胞攝取更多的染料，細(xì)胞總的熒光強(qiáng)度增大；細(xì)胞去極化時(shí)，染料釋放到細(xì)光強(qiáng)度增大；細(xì)胞去極化時(shí)，染料釋放到細(xì)胞外，總的熒光強(qiáng)度減少胞外，總的熒光強(qiáng)度減少。n染料和試劑染料和試劑