角膜組織工程

1、疑問（1）到底什么是角膜？（2）常說的角膜移植是怎么回事？（3）角膜移植中的角膜來源于哪里？（4）盲人，近視，遠(yuǎn)視，白內(nèi)障都可以進(jìn)行角膜移植而恢復(fù)視力嗎？角膜 眼角膜是眼睛前端一層透明薄膜 ，角膜完全透明，位于眼球前部，呈橫橢圓形。角膜有十分敏感的神經(jīng)末梢，如有外物接觸角膜，眼瞼便會(huì)不由自主地合上以保護(hù)眼睛。 角膜分為五層，組織學(xué)上從前向后分為：上皮細(xì)胞層：厚約35m，由56層鱗狀上皮細(xì)胞組成，無角化，排列特別整齊，易與其內(nèi)面的前彈力層分離；前彈力層：厚約12m，為一層均質(zhì)無細(xì)胞成分的透明膜；基質(zhì)層：厚約500m，占角膜厚度的90%，由近200層排列規(guī)則的膠原纖維束薄板組成，其間有角膜細(xì)胞和少

2、數(shù)游走細(xì)胞，并有粘蛋白和糖蛋白填充；后彈力層：為較堅(jiān)韌的透明均質(zhì)膜，成年人厚約1012m；內(nèi)皮細(xì)胞層：厚5m，為一層六角形扁平細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞頂部朝向前房，基底面向后彈力層。 角膜移植概念 用正常的眼角膜替換患者現(xiàn)有病變的角膜，使患眼復(fù)明或控制角膜病變，達(dá)到增進(jìn)視力或治療某些角膜疾患的眼科治療方法。 適用癥狀 適合于各種原因造成的角膜混濁或水腫而嚴(yán)重影響視力的病變 。例如：病毒性角膜炎 被酸、堿化學(xué)物燒傷的角膜混濁患者 先天性角膜變性、圓錐角膜、角膜基質(zhì)變性、角膜內(nèi)皮細(xì)胞功能失代償?shù)然颊?角膜腫瘤、角膜瘺、角膜葡萄腫患者 已失明的角膜白斑患者 材料來源 傳統(tǒng) 現(xiàn)代活體捐贈(zèng) 尸體捐贈(zèng) 活體捐贈(zèng) 尸

3、體捐贈(zèng) 人工角膜 活體捐贈(zèng)顧名思義供體是活人，因外傷、視神經(jīng)疾患、顱內(nèi)疾患等原因?qū)е率鳎o光感）而角膜卻是完好無損的眼球，均是合適的供體。 返回人工角膜基本簡介世界上超過1000萬人的眼盲是由角膜病引起，為導(dǎo)致眼盲的第二大原因，僅次于白內(nèi)障。其中80%可以通過角膜移植手術(shù)脫盲。然而，傳統(tǒng)的角膜移植手術(shù)有其兩大弊端，一是角膜供體的來源困難，二是手術(shù)成功率低。人工角膜的出現(xiàn)及應(yīng)用為角膜盲患者帶來了希望。 基本結(jié)構(gòu) 人工角膜是用醫(yī)用高分子材料制成的類似人體角膜的產(chǎn)品 。人工角膜材料 無機(jī)材料有機(jī)材料生物材料玻璃，羥基磷灰石 ， 生物玻璃陶瓷 硅凝膠 ，聚甲基丙烯酸甲酯 ，氟碳多聚體 羊膜，動(dòng)物膠原

4、和殼聚糖，黏多糖組織工程角膜光學(xué)鏡柱周邊支架 聚甲基丙烯酸羥乙酯(PHEMA）、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA）、硅凝膠、玻璃 陶瓷、氟碳聚合物、羥基磷灰石、生物材料、聚四氟乙烯 角膜設(shè)計(jì)中，較為成功的是AlphaCor、Dohlman-Doan和Osteo-Odonto， 并獲得了FDA 批準(zhǔn)，進(jìn)入臨床階段。 種子細(xì)胞特點(diǎn) （1）具有較高的增殖能力 （2）能夠長期維持其生理功能和生物活性 種子細(xì)胞（角膜緣干細(xì)胞）1.1.取材取材 取一塊大小為12mm2，深度為基質(zhì)前的角膜緣組織一塊。Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93 2.2.培養(yǎng)培養(yǎng) 采用組織

5、塊培養(yǎng)法和酶消化法。所用的培養(yǎng)基采用DMEM與F12培養(yǎng)基1：1混合，加入10胎牛血清，5ng/ml的胰島素，10 ng/ml的上皮生長因子。消化酶使用0.25胰蛋白酶0.02EDTA的混合物。Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93 觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長情況 23天換液一次，在倒置顯微鏡下觀察角膜緣上皮細(xì)胞的生長情況。 培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)記物染色 將培養(yǎng)的角膜緣上皮細(xì)胞固定，進(jìn)行間接免疫組織化學(xué)染色。選用AE5抗角蛋白抗體，特異性識別角蛋白K3；4A4核轉(zhuǎn)錄因子p63的特異性抗體,特異性識別p63。 3.3.移植移植Tsai R, et al. N Eng

6、l J Med. 2000;343:86-93角膜緣干細(xì)胞理論的建立 19711971年，年，DavangerDavanger等研究發(fā)現(xiàn)角膜緣是角膜上皮增殖和移行的動(dòng)力根源，據(jù)等研究發(fā)現(xiàn)角膜緣是角膜上皮增殖和移行的動(dòng)力根源，據(jù)此提出角膜緣干細(xì)胞存在的假說此提出角膜緣干細(xì)胞存在的假說 。 19861986年，年，SchermerSchermer等首次通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)角膜緣基底細(xì)胞缺乏特異性分化蛋白等首次通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)角膜緣基底細(xì)胞缺乏特異性分化蛋白K3K3，為角膜緣干細(xì)胞的解剖部位提供了間接依據(jù)。，為角膜緣干細(xì)胞的解剖部位提供了間接依據(jù)。 角膜緣干細(xì)胞的解剖定位 角膜緣為角膜和結(jié)膜、鞏膜交界的部分角膜

7、緣為角膜和結(jié)膜、鞏膜交界的部分 在基底部乳頭形成特殊的在基底部乳頭形成特殊的“柵欄柵欄”(limbal palisades of vogt)(limbal palisades of vogt)樣結(jié)構(gòu)樣結(jié)構(gòu) 結(jié)膜 角膜緣 周邊角膜 中央角膜角膜緣干細(xì)胞理論建立的意義 認(rèn)知了多種眼表疾病的發(fā)病機(jī)理認(rèn)知了多種眼表疾病的發(fā)病機(jī)理 找到了許多眼表重建手術(shù)及角膜移植術(shù)失敗的原因找到了許多眼表重建手術(shù)及角膜移植術(shù)失敗的原因角膜緣干細(xì)胞移植的意義 角膜緣干細(xì)胞移植是角膜緣干細(xì)胞缺乏患者恢復(fù)眼表完整性和重建邊緣屏角膜緣干細(xì)胞移植是角膜緣干細(xì)胞缺乏患者恢復(fù)眼表完整性和重建邊緣屏障作用的有效方法。障作用的有效方法。

8、 角膜緣干細(xì)胞移植的局限性 異體供眼來源有限，而且存在免疫排斥反應(yīng)，可異體供眼來源有限，而且存在免疫排斥反應(yīng)，可能導(dǎo)致移植失敗。能導(dǎo)致移植失敗。 對單眼角膜緣干細(xì)胞受損患者的健眼取材（大于對單眼角膜緣干細(xì)胞受損患者的健眼取材（大于2/32/3圓周）有造成健眼角膜緣干細(xì)胞缺乏的潛在圓周）有造成健眼角膜緣干細(xì)胞缺乏的潛在威脅威脅 。 因此目前認(rèn)為對角膜緣干細(xì)胞先行體外培養(yǎng)擴(kuò)增因此目前認(rèn)為對角膜緣干細(xì)胞先行體外培養(yǎng)擴(kuò)增后再行移植術(shù)是非常有前景的治療方法。后再行移植術(shù)是非常有前景的治療方法。 Chen J, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci,1990;31:1301 載

9、體支架 的特點(diǎn) （1）生物相容性好 ； （2）細(xì)胞能夠正常生長且形成近似體內(nèi)器官的正常結(jié)構(gòu) ； （3）具備角膜特有的透明，透光，透氧的特性 ；目前常用的載體支架1 羊膜 2 膠原 3 纖維蛋白4 脫細(xì)胞角膜基質(zhì) 5 甲殼素與殼聚糖 羊膜 當(dāng)胚體下沉，其周圍的外胚層和中胚層向上突起形成羊膜褶，頭褶、尾褶向上生長，側(cè)褶向胚體背中部集中，最后，這些褶全部在胚體尾端背部會(huì)合，將胚體全包在膜內(nèi)，內(nèi)層稱羊膜，羊膜腔內(nèi)有羊水，外層稱漿膜，這兩層膜在會(huì)合處形成漿羊膜縫。 生物羊膜 羊膜的制備和保存 將胎盤取出后，立即在層流罩下用含50mg/L青霉素、50mg/L鏈霉素、100mg/L新霉素及25mg/L兩性霉

10、素的平衡鹽溶液清洗表面凝血塊.從絨毛膜間的潛在腔隙中鈍性分離出羊膜，將其上皮面朝上，平鋪于0.45m微孔硝酸纖維素膜上，切成3cm4cm大小，儲藏于-80，含有Eagle基質(zhì)和甘油（11）混合液的無菌瓶內(nèi)備用。鑒于羊膜的制作和保存條件不足所帶來的醫(yī)用安全問題，滅菌生物羊膜已上市并投入使用. 羊膜作為移植底物，是提供基質(zhì)，而不是移植上皮活細(xì)胞.羊膜中含有型膠原蛋白（與結(jié)膜中型膠原蛋白相同，可刺激杯狀細(xì)胞的分化）、整合素及板層體等多種成分，是結(jié)膜上皮化的合適附著物，為病變組織提供健康的上皮下基質(zhì)環(huán)境. 展望理想人工角膜應(yīng)具有以下特點(diǎn)： 優(yōu)良的光學(xué)特性，穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)。 能夠與自體角膜組織長期共

11、存，并緊密結(jié)合。 無不良反應(yīng)，并發(fā)癥少。 手術(shù)簡單，制作容易，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。今后，人工角膜的研究重點(diǎn)是集中生物材料學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)專家聯(lián)合攻關(guān)，選擇真正生物相容性材料，改善光學(xué)鏡柱和周邊支架的整合，更重要的是周邊支架和受體組織的整合。 角膜移植概念 用正常的眼角膜替換患者現(xiàn)有病變的角膜，使患眼復(fù)明或控制角膜病變，達(dá)到增進(jìn)視力或治療某些角膜疾患的眼科治療方法。 適用癥狀 適合于各種原因造成的角膜混濁或水腫而嚴(yán)重影響視力的病變 。例如：病毒性角膜炎 被酸、堿化學(xué)物燒傷的角膜混濁患者 先天性角膜變性、圓錐角膜、角膜基質(zhì)變性、角膜內(nèi)皮細(xì)胞功能失代償?shù)然颊?角膜腫瘤、角膜瘺、角膜葡萄腫患

12、者 已失明的角膜白斑患者 角膜緣干細(xì)胞理論的建立 19711971年，年，DavangerDavanger等研究發(fā)現(xiàn)角膜緣是角膜上皮增殖和移行的動(dòng)力根源，據(jù)等研究發(fā)現(xiàn)角膜緣是角膜上皮增殖和移行的動(dòng)力根源，據(jù)此提出角膜緣干細(xì)胞存在的假說此提出角膜緣干細(xì)胞存在的假說 。 19861986年，年，SchermerSchermer等首次通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)角膜緣基底細(xì)胞缺乏特異性分化蛋白等首次通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)角膜緣基底細(xì)胞缺乏特異性分化蛋白K3K3，為角膜緣干細(xì)胞的解剖部位提供了間接依據(jù)。，為角膜緣干細(xì)胞的解剖部位提供了間接依據(jù)。 角膜緣干細(xì)胞移植的局限性 異體供眼來源有限，而且存在免疫排斥反應(yīng)，可異體供眼來源有限，而且存在免疫排斥反應(yīng)，可能導(dǎo)致移植失敗。能導(dǎo)致移植失敗。 對單眼角膜緣干細(xì)胞受損患者的健眼取材（大于對單眼角膜緣干細(xì)胞受損患者的健眼取材（大于2/32/3圓周）有造成健眼角膜緣干細(xì)胞缺乏的潛在圓周）有造成健眼角膜緣干細(xì)胞缺乏的潛在威脅威脅 。 因此目前認(rèn)為對角膜緣干細(xì)胞先行體外培養(yǎng)擴(kuò)增因此目前認(rèn)為對角膜緣干細(xì)胞先行體外培養(yǎng)擴(kuò)增后再行移植術(shù)是非常有前景的治療方法。后再行移植術(shù)是非常有前景的治療方法。 Chen J, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci,1990;31:1301 羊膜的制備和保