質(zhì)粒DNA的提取及鑒定ppt課件

1、質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取及鑒定的提取及鑒定1.實驗目的1、堿裂解法提取質(zhì)粒的原理。2、DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理和方法。常用提取方法：水煮法簡單、及其廉價，堿常用提取方法：水煮法簡單、及其廉價，堿裂解法簡單、方便，試劑盒等裂解法簡單、方便，試劑盒等二、實驗原理n利用染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復性的差別而到達分別的目的。在堿變性條件下，細菌在NaOH和SDS溶液中裂解，蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生變性，但是染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋解開而變性，質(zhì)粒DNA氫鍵也大部分斷裂，雙螺旋也有部分解開，但共價閉合環(huán)狀構造的兩條互補鏈不會完全分別。二、實驗原理n當pH=4.8的乙酸鉀將其pH調(diào)到中性時，變性的質(zhì)粒

2、DNA又恢復到原來的構型，而染色體DNA不能復性，構成纏繞的致密網(wǎng)狀構造。同時，在反響體系中變性的蛋白質(zhì)會構成大量沉淀以及十二烷基磺酸鉀沉淀，染色體DNA會進一步纏繞在這些沉淀上。離心后，染色體DNA與蛋白質(zhì)-SDS復合物等一同沉淀下來而被除去，質(zhì)粒DNA留在上清里。 二、實驗原理n瓊脂糖凝膠電泳是基因工程操作中最常規(guī)的實驗方法，它簡單易行，只需少量的DNA就能檢測。在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應，前者由分子所帶凈電荷的多少而定，后者那么主要與分子大小及構型有關。DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電荷。在電場中

3、向著正極挪動，在用電泳法檢測DNA分子時，該當盡量減少電荷效應。添加凝膠的濃度可以在一定程度上降低電荷效應，使得分子的遷移速度主要由分子受凝膠阻滯程度差別所決議，提高分辨率。同時適當降低電泳時的電壓，也可以使分子篩效應相應加強而提高分辨率。三、儀器、試劑和資料 n1、設備：恒溫培育箱、恒溫搖床、臺式離心機、超凈任務臺、高壓滅菌鍋、瓊脂糖凝膠電泳及分析系統(tǒng)等。n2、試劑：Tris、EDTA、SDS、限制性內(nèi)切酶、含質(zhì)粒大腸桿菌、瓊脂糖、溴化乙錠、DNA marker等。超凈任務臺制冰機漩渦混勻器高速冷凍離心機和超速離心機等高速冷凍離心機和超速離心機等程度電泳安裝四、實驗操作n1、用堿裂解法提取質(zhì)

4、粒DNA：挑選單菌落小規(guī)模擴增后，將2 mL含相應抗生素的 LB參與到容量為15 mL并通氣良好的試管中，然后接種入一單菌落，于37猛烈振搖下培育過夜，搜集細菌。n2、將細菌團塊重懸于100L用冰預冷的溶液150 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L TrisHCl，pH80，10 mmol/L EDTA， pH8.0中猛烈振蕩。加200L新配制的溶液(0.2mol/L Na0H, 1%SDS)蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，將離心管放置于冰上。四、實驗操作n加150 L用冰預冷的溶液 由5 mol/L乙酸鉀60mL，冰乙酸11.5 mL和水28.5 mL配制而成。蓋緊管口，將離心管倒置后溫

5、暖地使溶液在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后將離心管置于冰上3-5min。4，12 000g離心5min，將上清轉移到另離心管中。加等量酚：氯仿，振蕩混勾，4，12 000g離心2min，將上清轉移到另離心管中。加2倍體積的乙醇混勻，室溫放置2 min。4，12 000g離心5min，沉淀DNA。用1 mL 70% 乙醇于4洗滌DNA沉淀，在空氣中讓DNA沉淀枯燥10min。用50L含無DNA酶的胰RNA酶(20L/mL)的 TE重新溶解DNA，儲存于-20。用紫外分光光度計測定DNA濃度和純度。四、實驗操作n3、對提取的質(zhì)粒、對提取的質(zhì)粒DNA進展純化及酶切鑒定：進展純化及酶切鑒定：瓊脂糖凝

6、膠電泳檢測質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA，采用膠回收，采用膠回收試劑盒純化質(zhì)粒試劑盒純化質(zhì)粒DNA；分析質(zhì)粒；分析質(zhì)粒DNA的限制的限制性酶切圖譜，選擇適宜的限制性內(nèi)切酶對質(zhì)性酶切圖譜，選擇適宜的限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒粒DNA進展酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切進展酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物。產(chǎn)物。五、 結果處置 利用凝膠成像系統(tǒng)進展檢測開環(huán)(部分解鏈 )閉環(huán)(螺旋) 閉環(huán)(超螺旋)質(zhì)粒DNA六、 本卷須知 1實驗菌種生長的好壞直接影響質(zhì)粒DNA的提取，因此對存放時間較長的菌種需求事先加以活化。有關細菌培育、保管的方法請查閱微生物有關書籍。 2細菌培育過程要求無菌操作?？咕氐炔荒芨邷販缇?，應運用細菌濾器過濾后運用。細菌培育液、配試劑用的蒸餾水、試管和離心管等有關器具和某些試劑須經(jīng)高壓滅菌處置。接觸過細菌的器具用后應消毒滅菌再洗凈。 3制備質(zhì)粒過程中，一切操作必需緩和，不要猛烈振蕩，以防止機械剪切力對DNA的斷裂作用。同時