昆蟲線粒體基因組研究方法

1、昆蟲線粒體基因組研究方法一. 昆蟲線粒體基因組的研究意義 （一） 適合做進(jìn)化生物學(xué)研究。被廣泛用于研究基因組結(jié)構(gòu)和功能、群體遺傳結(jié)構(gòu)，譜系地理學(xué)和各種分類學(xué)水平上的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究。 （二）功能基因的研究二. 研究方法 （一）獲取待研究昆蟲的線粒體基因組 （二）對線粒體基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析 （三）與其他昆蟲線粒體基因組進(jìn)行比對 （四）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析具體步驟 1. 采集標(biāo)本并冷凍 2. 提取DNA 3. 擴(kuò)增線粒體基因組上的經(jīng)典片段 4. 設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其他片段 5. 將所有片段拼接成完整的線粒體組（環(huán)形） 6. 校對數(shù)據(jù)，利用軟件、比對等方法，標(biāo)出tRNA、16S、12S及13個(gè)蛋白質(zhì)基因的位

2、置，上傳線粒體基因組數(shù)據(jù)至Genbank。 7. 對tRNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測 8. 對12S及16S進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測 9. 對該昆蟲線粒體基因組上特殊位置進(jìn)行討論 10. 系統(tǒng)發(fā)育分析1. 采集標(biāo)本及冷凍 利用高壓汞燈及黑光燈誘集，然后將標(biāo)本低溫冷凍致死，取一側(cè)后足泡入無水乙醇，置于-20度冰箱保存，供提取DNA。標(biāo)本展翅并保存，以待進(jìn)一步形態(tài)鑒定。2. DNA提取 總DNA提取試劑盒為德國默克公司QIAGEN DNeasy Tissue kit。PCR試劑使用TIANGEN天根生化科技有限公司生產(chǎn)的PCR MasterMix。 將浸泡于無水乙醇中的足取出，晾干，分成2-3段，放在1.5ul的離心管中

3、。按照QIAGEN DNeasy Tissue kit使用手冊的說明進(jìn)行總DNA提取。抽提的DNA溶于200-300ul的AE緩沖液，并置于在-20冰箱保存?zhèn)溆谩?. PCR擴(kuò)增和測序 先擴(kuò)增線粒體基因組上的經(jīng)典片段，如CO、CO、CO、Cob等。 例：擴(kuò)增COI基因片段 擴(kuò)增引物為通用引物L(fēng)COI490（5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3）和HCO2198（5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3）（Folmer et al , 1994）。反應(yīng)體系為25l，其中上下游引物各0.5l，PCR MasterMix 12.5l ，DNA模板3l，ddH

4、2O 8.5l。擴(kuò)增反應(yīng)條件：預(yù)變性94 2分鐘，變性94 1分鐘，退火50 1分鐘，延伸72 1分鐘, 進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。取3l PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖膠電泳檢驗(yàn)。PCR產(chǎn)物測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。4. 設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其他片段 利用軟件Primer5.0 設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其他片段。最難擴(kuò)增的片段是控制區(qū)（A+T-rich）。因?yàn)橐锖茈y設(shè)計(jì)，所以需要花費(fèi)一些時(shí)間及精力。5. 將所有片段拼接成完整的線粒體組（環(huán)形） 利用軟件DNAstar對擴(kuò)增好的各個(gè)片段進(jìn)行拼接。用Bioedit軟件查看測序原始峰圖，校對各個(gè)堿基。將校對好的數(shù)據(jù)上傳至Genbank。獲取Genbank

5、的accession number。6. 尋找tRNA及預(yù)測tRNA結(jié)構(gòu) 用tRNAscan-SE Search Server 在線軟件，尋找tRNA，一次可找出17-19個(gè)。其余與其他昆蟲線粒體進(jìn)行比對找出。 用DNAsis預(yù)測tRNA結(jié)構(gòu)，對于較為特殊的tRNASer(AGN)，需手工畫出。7. 預(yù)測12S及16S結(jié)構(gòu) 用軟件XRNA進(jìn)行預(yù)測。預(yù)測不到的，用手工畫出。8. 對特殊結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析討論 例：控制區(qū)的結(jié)構(gòu)分析 在線軟件 Mfold Web Server (Zuker, 2003; /?q =mfold)9. 系統(tǒng)發(fā)育分析 用軟件M

6、EGA5.0，RAxML,Paup4.0,mrbayes等軟件進(jìn)行分析具體步驟 1. 采集標(biāo)本并冷凍 2. 提取DNA 3. 擴(kuò)增線粒體基因組上的經(jīng)典片段 4. 設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增其他片段 5. 將所有片段拼接成完整的線粒體組（環(huán)形） 6. 校對數(shù)據(jù)，利用軟件、比對等方法，標(biāo)出tRNA、16S、12S及13個(gè)蛋白質(zhì)基因的位置，上傳線粒體基因組數(shù)據(jù)至Genbank。 7. 對tRNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測 8. 對12S及16S進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測 9. 對該昆蟲線粒體基因組上特殊位置進(jìn)行討論 10. 系統(tǒng)發(fā)育分析1. 采集標(biāo)本及冷凍 利用高壓汞燈及黑光燈誘集，然后將標(biāo)本低溫冷凍致死，取一側(cè)后足泡入無水乙醇，置于-20度冰箱保存，供提取DNA。標(biāo)本展翅并保存，以待進(jìn)一步形態(tài)鑒定。3. PCR擴(kuò)增和測序 先擴(kuò)增線粒體基因組上的經(jīng)典片段，如CO、CO、CO、Cob等。 例：擴(kuò)增COI基因片段 擴(kuò)增引物為通用引物L(fēng)COI490（5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3）和HCO2198（5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3）（Folmer et al , 1994）。反應(yīng)體系為25l，其中上下游引物各0.5l，PCR MasterMix 12.5l ，DNA模板3l，ddH2O 8.