酵母雙雜交操作步驟中文翻譯

1、 （酵母菌儲存在-70中，引物和質(zhì)粒DNA儲存在-20中）概念：1. 次序轉(zhuǎn)化:指的是先將一種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在選擇培養(yǎng)基中選擇出陽性克隆，之后再將另外一個質(zhì)粒（AD fusion library）轉(zhuǎn)化進去。優(yōu)點：就是比共轉(zhuǎn)化使用更少的質(zhì)粒DNA，也就是節(jié)約質(zhì)粒DNA。2. 共同轉(zhuǎn)化：將兩種質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)化進酵母中。優(yōu)點：比次序轉(zhuǎn)化更容易操作。pGBKT7-的選擇物是：kanamycin（卡那霉素）？pGADT7-的選擇物是：ampicillin (氨芐西林) ？各種SD培養(yǎng)基：1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/

2、-his （組氨酸）(1000 ml) （？“四缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （購買來就配好的） ; 葡萄糖 20g (即2%)2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （購買來就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”）酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement

3、0.64g （購買來就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%)4) SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （購買來就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5) SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （購買來就配好的） 葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有兩種，一種含有硫酸胺，另外一種不含硫酸胺。我們這用的是含硫酸銨的。（買來就加進去了的）。如果不含硫酸銨，那么要在終濃度0.17%的YNB中再加入0.5

4、%的硫酸銨，即最終在1000 ml溶液中加入總量為6.7g的YNB與硫酸銨。實際配制的方法是：1. 配制40%的葡萄糖貯存液（貯存在4），過濾除菌，待高壓滅菌的溶液溫度降至55以下時，再將50ml葡萄糖貯存液加入。（過濾即可使用）2. 酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，調(diào)PH至5.8（大約加10M NaOH 200ul即可），之后補水至950 ml。3. 高壓完后待溫度降至55以下，加入50 ml40%葡萄糖。YPD培養(yǎng)基(1000 ml)20 g/L 蛋白胨10 g/L 酵母提取物20 g/L 瓊脂（只有制作平板才用）20 g/L 葡萄糖 (即2%)1x

5、YPDA培養(yǎng)基(1000 ml) 20 g/L 蛋白胨10 g/L 酵母提取物0.03 g/L 腺嘌呤 （即終濃度為0.003）腺嘌呤可以耐受高溫20 g/L 葡萄糖 (即2%)實際配制的方法是：1. 配制40%的葡萄糖貯存液（貯存在4），過濾除菌，待高壓滅菌的溶液溫度降至55以下時，再將50ml葡萄糖貯存液加入。（李博士經(jīng)驗這一步不高壓，過濾即可使用）2. 配制0.2%的腺嘌呤溶液，過濾除菌，待高壓滅菌的溶液溫度降至55以下時，再將15ml腺嘌呤溶液加入。（或?qū)⑾汆堰手苯蛹舆M去，為了方便我將直接加進去一起高壓）3. （蛋白胨 20g ；酵母提取物10g ；水大約925ml）混合后，調(diào)至PH至

6、6.5，加水至935ml，121高壓15min。注意：u 高壓的溫度和時間不能太長與太高，121高壓15min即可。u 可以在YPDA中加入20 g/L的瓊脂，以配成平板。u 需要加kanamycin時，kan終濃度是1015 mg/L。（kanamycin可以20貯存一個月，加入到平板中去可以4貯存一個月。）PEG/LiAc溶液（即配即用）用下列貯存液來配制50% PEG 3350：用滅菌水配，如需要可以加熱至50以助溶。10X TE buffer：用滅菌水配，如需要可以加熱至50以助溶。10X LiAc：用滅菌水配，如需要可以加熱至50以助溶。最后配成PEG/LiAc溶液是：（以10ml為

7、例） 終濃度 為配制10mlPEG/LiAc需要加入的物質(zhì)PEG 4000 40% 8 ml of 50% PEGTE buffer 1X 1 ml of 10X TELiAc 1X 1 ml of 10X LiAc無菌1x TE/LiAc溶液（用10x已滅菌的貯存液稀釋）10x TE buffer : 0.1 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 7.5(高壓)10x LiAc ： 1 M 用稀醋酸調(diào)節(jié)PH至7.5 高壓For -galactosidase 濾膜實驗Z buffer溶液：Na2HPO4 7H2O 16.1 g/L （如換Na2HPO4 14H2O 則 20.7

8、39 g/L）NaH2PO4 H2O 5.50 g/L （如換NaH2PO4 2H2O 則 6. 21g/L）KCl 0.75 g/LMgSO4 7H2O 0.246 g/L最后調(diào)PH至7.0，高壓，室溫下可以貯存1年X-gal 溶液：X-GAL溶解于DMF（二甲基甲酰胺）中至濃度為20 mg/ml.，20°C避光保存Z buffer/X-gal 溶液：100 ml Z buffer0.27 ml -mercaptoethanol （-巰基乙醇）1.67 ml X-gal 貯存液ONPG 溶液：（即配即用）ONPG溶于Z buffer中，終濃度4 mg/ml，調(diào)PH至7.0.注意：1

9、. ONPG需要12h才能溶解2. 每次用之前新鮮制備。帶有-巰基乙醇的Z buffer將0.27 ml-巰基乙醇加入100 ml Z buffer中即可為了轉(zhuǎn)化成功的小提示： 1.用一個13周齡（直徑23mm）的菌落去接種液體培養(yǎng)基。如果菌落直徑2mm，就用多幾個菌落去接種。（也要大力渦旋使細胞團分散開來。） 2.如果過夜或者3hr之后的培養(yǎng)基明顯成塊，那么在使用之前一定要充分渦旋使培養(yǎng)基。 3.當(dāng)通過離心收集細胞的時候，使用一個離心管即可，可以更好、更充分地收集細胞。 4.為了提高轉(zhuǎn)化效率，要在1小時內(nèi)準(zhǔn)備酵母感受態(tài)細胞。如果有必要，可以在11步之后在室溫條件下儲存酵母感受態(tài)細胞幾個小時，

10、而活性卻只有一點降低。 5.當(dāng)進行通同轉(zhuǎn)化的時候，誘餌（BD）質(zhì)粒的量必須過度，而AD質(zhì)粒的量要不足。一般BD是AD的兩倍。（李博士：此要求一般是針對文庫篩選而言）6.為了使菌落更好地生長，在涂布轉(zhuǎn)化復(fù)合物到瓊脂平板上時要直到所有液體被吸收?？梢赃x擇直徑5mm的無菌玻璃珠（每一個100mm的平板用5-7個玻璃珠，直徑150mm的平板用7-9個玻璃珠）去促進轉(zhuǎn)化復(fù)合物的擴散，搖動的時候shake the plate back and forthnot round and round. （科內(nèi)似并無此操作，而僅僅以玻棒涂布耳）一. 復(fù)蘇酵母：將酵母細胞接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)1-3周。（

11、接種的時候采取四區(qū)分區(qū)畫線法）二. 酵母感受態(tài)細胞置備和轉(zhuǎn)化步驟：1.取直徑23mm的克隆接種到1ml的YPD或SD培養(yǎng)基中。2.劇烈振蕩或渦旋5min，使所有團塊分散開來。3.轉(zhuǎn)移酵母液到50 mlYPD（？固體也有液態(tài)的，未加入瓊脂粉耳）或者SD培養(yǎng)基中。4.置于30搖床中，以250 rpm的轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)基1618h，直到OD600>1.55.轉(zhuǎn)移部分過夜培養(yǎng)物（30ml）到300mlYPD培養(yǎng)基（？固體）中，使最終OD600 在0.20.3之間。6.30搖床以230 rpm的轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)基34h直至OD為 0.40.6.（If the OD600 is < 0.4, some

12、thing is wrong with the culture）7.轉(zhuǎn)移酵母液至50ml離心管中，1000g室溫（2021°C）離心5min8.棄去上清，加入2550ml無菌水或無菌的1x TE重懸酵母。9.在1000g室溫（2021°C）條件下離心5min10.輕輕倒出（棄去）上清11.將細胞重懸于1.5ml新鮮準(zhǔn)備的，無菌的1xTE/1xLiAc（在實驗開始之前置備）(至此酵母感受態(tài)細胞制備完畢)12. 向無菌的1.5ml微量離心管中加入質(zhì)粒DNA各0.1ug和0.1mg鯡魚精載體DNA，之后輕輕混勻。13.再向每管中加入0.1 ml 酵母感受態(tài)細胞，并且震蕩混勻。14

13、.向每一管加入600 ul無菌PEG/LiAc溶液，高速振蕩混勻。15.30搖床以200 rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)30 min16.向每一管加入70 ul DMSO 輕輕顛倒混勻，不要震蕩。17.42水浴熱激15 min18.取出后在冰上冷卻1-2 min19.1000 rpm室溫離心5 min，棄去上清。20.用0.5 ml 無菌的1×TE重懸酵母。21.取合適體積的菌液（一般是100 ul）涂在選擇性的SD培養(yǎng)基的平板上，在30培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4天。（將克隆分成三份涂與不同平板上，1/3涂在SD/His/Leu/Trp，1/3涂在SD/Ade/His/Leu/Trp，最后1/3涂在S

14、D/Leu/Trp上。） （科內(nèi)僅涂布二缺與四缺板）（在21步之后涂一個二缺板和一個四缺板）因為在二缺板中AH109能生長，說明BD和AD已經(jīng)轉(zhuǎn)進去了。如果在四缺板中能生長，說明誘餌和文庫肯定有作用，接著做一個- gal實驗。如果是將質(zhì)粒轉(zhuǎn)到Y(jié)187中的話，21步之后涂一個二缺板就行了。如果酵母能生長的話就接著做一個- gal。所以有的人同時轉(zhuǎn)化兩種菌種。這樣就完全可以確定兩蛋白是否有作用了。之后計算轉(zhuǎn)化率，如果轉(zhuǎn)化率達到10的6次方以上，那么就可以接著做后面的檢驗實驗。三. 和-gal實驗：（我就做-gal試驗，要注意如果做-gal的話，這時候菌種要換成Y187，而不是之前的AH109）（在

15、protocol 的2428頁）1.試劑：2.原理：u ONPG為無色物質(zhì)，在-半乳糖苷酶的作用催化下生成黃色的onitrophenol(硝基苯酚)，在420 nm (OD410)處有光吸收。u Na2CO3可以提高PH值，使酶變性，從而終止反應(yīng)。（Na2CO3在配制時，不需要高壓）3.實驗方法一. Colony-lift Filter Assay（濾膜分析或濾膜試驗）（這是定性試驗）a) 將要測試的菌株（直徑1-3mm）轉(zhuǎn)接到新的選擇性SD培養(yǎng)基中，30培養(yǎng)2-4天。b) 準(zhǔn)備Z buffer/X-gal 溶液。c) 為每一個要測試的平板準(zhǔn)備好一張無菌的Whatman 濾紙，置于100mm或

16、150mm無菌平板中用2.5-5ml Z buffer/X-gal 溶液浸泡。d) 用無菌的鑷子小心地將無菌Whatman 濾紙覆蓋到平板表面，要使所有的待測菌株都有部分沾到濾紙上。e) 用注射器在濾紙上打3個或更多的不對稱的孔，以標(biāo)志方向。f) 濾紙放入液氮中0.51min至結(jié)冰，之后再放置于室溫融化，如此反復(fù)凍融3次。g) 小心地將帶有菌株的濾紙放到預(yù)浸泡的濾紙上，有菌株一面向上，注意兩層濾紙中間不要有氣泡。h) 平板放到30培養(yǎng)箱中，觀察其是否變藍。一般陽性克隆在0.58h內(nèi)會變藍，超過8h容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。二 . Liquid Culture Assay（以O(shè)NPG為底物的液體培養(yǎng)法

17、）（這是定量試驗）1) 在合適的SD培養(yǎng)基中制備5 ml過度培養(yǎng)物。注意：你所選用的SD培養(yǎng)基要適合你所用的系統(tǒng)和質(zhì)粒。2) 在進行實驗當(dāng)天，將ONPG以4 mg/ml 的濃度溶于Z buffer中，振蕩12h確保完全溶解。3) 大力渦旋過夜培養(yǎng)基1min以分散細胞團塊，立即轉(zhuǎn)移2ml（0.5ml）過夜培養(yǎng)基物到8ml (2ml)YPD培溶液中。（以25%的含量加）4) 30培養(yǎng)35h（230-250 rpm）直至細胞進入對數(shù)生長期（1ml溶液的OD600應(yīng)在0.5-0.8之間）在收獲細胞的同時記錄OD600值。注意：在檢測OD值的時候，渦旋培養(yǎng)基0.5-1ml以分散細胞團塊5) 各吸取1.5

18、 ml（0.5 ml）培養(yǎng)物到各3個1.5 ml離心管（每個管子就是1.5ml），離心14000 rpm/30sec。6) 小心移去上清，加上1.5 ml（0.5 ml）Z buffer到每個管中，渦旋直到細胞重懸。7) 再次離心并移去上清，加上300ul（100 ul）Z buffer到每個管中，渦旋直到細胞重懸。這樣，終濃度就是1.5/0.3 = 5倍。注意：在這個清洗步驟之后，細胞收獲物的差異可以通過再次讀取OD600值來糾正。8) 轉(zhuǎn)移0.1ml細胞懸液至新的離心管中。9) 將細胞置于液氮中（約0.51min）直至細胞冰凍。10) 將離心管放于37水浴中0.51min使其融化。11) 反復(fù)凍融3次（重復(fù)9和10步）確保細胞裂解。12) 用100 ul Z buffer.來設(shè)置一個空白對照。13) 加0.7 ml 的Z buffer 與-巰基乙醇到反應(yīng)管和空白管中注意：在冰凍之前不要加Z buffer14) 立即加1