進出口動物源性食品中三聚氰胺快速檢測方法—ELISA編制說明

1、進出口動物源性食品中三聚氰胺快速檢測方法 ELISA法編制說明一、 標準制定的任務來源及意義本標準的制定工作是由中華人民共和國國家認證認可監(jiān)督管理委員會提出并歸口，由北京出入境檢驗檢疫局研究起草，計劃編號為2008B184。本標準制定了進出口動物源性食品中三聚氰胺快速檢測方法 ELISA法。三聚氰胺（英文名Melamine，CAS:108-78-1，分子式C3N6H6）是一種用途廣泛的有機化工原料，禁止在食品和動物食品中添加，但因其結(jié)構(gòu)中含有多個氨基氮而被一些不法商販添加到植物蛋白中以提高蛋白的含量。其危害最早源于2007年3月美國發(fā)生的寵物貓、狗中毒死亡事件。經(jīng)美國FDA證實，貓、狗死亡是寵

2、物食品的原料受三聚氰胺污染，并指出其中小麥蛋白原料來自中國，由此引起了國內(nèi)外對三聚氰胺的高度關(guān)注。三聚氰胺一方面可能殘留于食用動物組織，進而污染畜產(chǎn)品食品；另一方面，三聚氰胺也可以直接污染小麥、大米等谷物食品。無論何種污染途徑，都可能危害人類健康、甚至造成人類中毒、死亡的危險。2008年9月16日，國家質(zhì)檢總局公布了全國嬰幼兒配方奶粉22家生產(chǎn)企業(yè)的69批次產(chǎn)品檢出了含量不同的三聚氰胺的檢查結(jié)果，再次將三聚氰胺聚焦為食品安全檢測中的重要檢測對象。三聚氰胺在食品中的限量值，目前僅針對乳和乳制品。對于嬰幼兒配方奶粉限量值我國和香港地區(qū)、澳大利亞、新西蘭、加拿大以及歐盟都制定在1mg/kg，美國沒有

3、對嬰幼兒配方奶粉制定一個控制的限量；我國對其他乳和含乳15%的食品限量值為2.5mg/kg。三聚氰胺傳統(tǒng)的檢測方法有重量法、升華法，但方法檢測限不能滿足要求。近來發(fā)展起了色譜法。我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布飼料中三聚氰胺的測定公告，確定了飼料中三聚氰胺測定的農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T1372-2007，該標準采用高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC/MS），HPLC法最低定量限為2mg/kg，GC/MS法最低定量限為0.05mg/kg。2008年10月7號，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局、國家標準化管理委員會批準發(fā)布了原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法（GB/T 22388-2008）國家標準，規(guī)定了高

4、效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法三種方法為三聚氰胺的檢測方法，檢測定量限分別為2 mg/kg 、0.05 mg/kg 和0.01 mg/kg。2008年10月15日，又發(fā)布了原料乳中三聚氰胺快速檢測 液相色譜法（GB/T22400-2008）國家標準，該標準的定量限為0.3 mg/kg。然而，盡管色譜法已經(jīng)很多，但不能完成現(xiàn)場大量樣本的檢測，而基于抗原抗體反應的免疫檢測方法是一項大樣本量現(xiàn)場快速的、準確的、成熟的篩查檢測技術(shù)。本項目是參照美國Abraxis LLC公司建立的動物源性食品中三聚氰胺快速檢測方法-ELISA法，制定相應的出入境檢驗檢疫行業(yè)標準，作為 GB/

5、T 22388-2008和GB/T22400-2008方法的補充，為實驗室和現(xiàn)場針對動物源性食品中三聚氰胺快速篩查提供檢測依據(jù)，更為保障我國人民食品安全及對外出口貿(mào)易健康發(fā)展提供有力的技術(shù)支撐。二、 編制依據(jù)1. 本標準是按照GB/T 1.1-2000標準化工作導則 第1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫的規(guī)則、/GN/T 20001.4-2001標準編寫規(guī)則 第4部分：化學分析方法及SN/T 0001-1995出口商品中農(nóng)藥、獸藥殘留量及生物毒素檢驗方法標準編寫的基本規(guī)定（簡稱基本規(guī)定）的要求編寫的。2. 本標準是經(jīng)大量實驗研究、評估和驗證后制定的。三、 方法概述基于競爭性ELISA的原理。先用甲醇-磷

6、酸鹽緩沖溶液(PBS)溶液將三聚氰胺從樣品中萃取出來，再將所獲得的樣品萃取液與三聚氰胺辣根過氧化物酶（HRP）耦合物和標準品一起加入包備有三聚氰胺抗體的多孔試劑板的微孔中發(fā)生反應，經(jīng)過30分鐘的培養(yǎng)，樣品中的三聚氰胺和三聚氰胺HRP酶耦合物與三聚氰胺抗體競爭性結(jié)合。經(jīng)過這30分鐘的培養(yǎng)，任何沒有結(jié)合的三聚氰胺和三聚氰胺HRP酶耦合物將被沖洗掉，顯色酶底物加入微孔中，任何結(jié)合的酶耦合物都會使液體呈現(xiàn)藍色。經(jīng)過10-20分鐘的培養(yǎng)，反應結(jié)束，用酶標儀讀數(shù)。將未知樣品的讀數(shù)和標準品的讀數(shù)比較就能得出樣品中的三聚氰胺濃度。四、 主要實驗技術(shù)論證酶聯(lián)免疫法之所以能夠方便快捷地應用在食品分析中主要是由于其

7、不需要經(jīng)過繁瑣的凈化步驟，從而大大縮短了時間。實驗比較了超純水、PBS、PBST等幾種常用的掩蔽劑對于消除基質(zhì)影響的作用情況。結(jié)果顯示采用PBS作為基質(zhì)掩蔽劑可較好地消除基質(zhì)影響。五、 方法的主要技術(shù)指標1、方法檢測限研究建立的三聚氰胺直接競爭ELISA檢測方法，其標準溶液的線性范圍為20500 µg/L。經(jīng)加標回收試驗，針對嬰兒奶粉和嬰兒豆奶粉的檢測限1.0mg/kg，液態(tài)奶及含乳巧克力、乳清粉、酸奶等含乳食品樣品經(jīng)前處理及掩蔽劑稀釋后的檢測限2.5mg/kg，均滿足目前三聚氰胺的安全限量標準（MRLs）的要求，即針對嬰幼兒為1.0mg/kg和其他乳品和含乳制品為2.5mg/kg。

8、同時本方法還使用于肉類（雞、魚肉）、雞蛋和醬油。 2、方法精密度嚴格按本標準所確定的操作程序，對三聚氰胺檢測進行了精密度的測試，分別以板內(nèi)變異和板間變異表示。取六個含不同三聚氰胺濃度的實驗樣品，進行ELISA分析，每個濃度實驗樣品作10個復孔，對測得抑制率（IC）進行分析，變異系數(shù)均10 %。取六個不同濃度的三聚氰胺標準溶液，進行ELISA分析，每個濃度每天作兩次分析，綜合5天測得的抑制率（IC）吸光度值進行分析，變異系數(shù)均10 %。3、方法準確度選擇10種不含三聚氰胺的樣品，分別添加三聚氰胺至樣品中3個不同含量水平，提取后采用直接競爭ELISA方法檢測，計算樣品加標回收率，以加標回收率表示檢

9、測方法的準確度。結(jié)果顯示，回收率均在81-128%之間（見表1）。表1 不同樣品中三聚氰胺的加標回收率（n6）樣品加標水平(mg/kg)平均回收率（%）雞蛋1.81005841088冰激淋2.410451021098巧克力2.5965941088液態(tài)奶0.061170.251200.5102酸奶0.161060.251120.5105肉類（雞肉）1.25812.592590乳糖0.021200.051120.1122嬰兒豆奶粉0.81242.51255128嬰兒奶粉0.11100.259611164、方法特異性抗三聚氰胺抗體與三嗪類似物的交叉反應可用最低檢測劑量（LLD，約為90%B/Bo）或

10、用抑制50%的吸光值所需的劑量（50%B/Bo）表示。表2 抗三聚氰胺抗體交叉反應化合物LLD（ng/mL）50%B/Bo (ng/mL)三聚氰胺10400三聚氰酸40010,000三嗪10,00010,000三嗪二銨0.12由表2 可以看出所制備的抗三聚氰胺抗體與三嗪二銨有交叉反應，與三聚氰酸和三嗪的交叉反應性則很低。5、三聚氰胺檢測的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法驗證及實際應用依據(jù)GB/T 22388-2008 原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法中的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）驗證本研究建立的ELISA方法，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，三聚氰胺直接競爭ELISA檢測與儀器分析結(jié)果一致，但儀器

11、方法回收率偏低。表3 三聚氰胺直接競爭ELISA檢測與儀器分析結(jié)果對照（n=3）樣品加標水平(mg/kg)ELISAUPLC-MS/MS回收率(%)回收率(%)冰激淋2.410479.3液態(tài)奶0.0611789.4酸奶0.1610674.7嬰兒奶粉0.111079.4應用本標準方法對約40個實際樣品進行了三聚氰胺的定量分析，并隨機抽取了陰性檢出結(jié)果樣品（n=20），再以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，均未檢出三聚氰胺殘留，表明陰性檢出準確率為100%，即假陰性為0%；進一步對陰性樣品（n=20）進行三聚氰胺標準添加實驗，添加水平為0.1 mg/kg 2.4 mg/kg。以本標準所建立的ELISA方法

12、與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行比對分析，添加樣品的測定結(jié)果均為陽性，且回收率分布在70% 110% 之間。6、實驗室間驗證試驗分別對液態(tài)奶和雞肉樣品添加三聚氰胺，針對液態(tài)奶添加水平分別為0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0mg/kg，針對雞肉樣品添加水平分別為1.8、5.0 mg/kg、 10.0 mg/kg。上述樣品經(jīng)北京化工大學分析測試中心、中國疾控中心、河北局、天津局、北京生命科學研究所等五個實驗室的有關(guān)技術(shù)人員運用該測定方法進行驗證，檢測結(jié)果如表4。表4 驗證實驗結(jié)果及實驗室間精密度樣品名稱液態(tài)奶雞肉添加水平mg/kg0.51.02.01.85.010.0參加單位北京化工大學分析

13、測試中心0.4571.011.831.454.529.250.4120.921.791.574.388.15中國疾控中心0.4470.891.781.694.817.970.4340.931.881.594.278.13河北出入境檢驗檢疫局0.4010.871.661.474.118.280.3950.971.611.784.368.69天津出入境檢驗檢疫局0.4110.831.731.834.339.010.3980.891.851.514.098.73北京生命科學研究所0.3881.051.881.884.028.110.4490.941.831.624.168.51平均回收率(%)0.420.931.781.644.318.48RSD (%)5.76.65.39.05.15.8六、結(jié)論本標準簡便易行，可快速、準確地對食品及農(nóng)產(chǎn)品中的三聚氰胺殘留進行篩選檢驗。方法的準確度、精確度、檢測限均符合殘留物檢測的定量要求。參考文獻主要參