金銀花檢驗方法驗證方案

1、金銀花檢驗方法驗證方案本品為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花。夏初花開放前采收，干燥。 性狀 本品呈棒狀，上粗下細，略彎曲，長23cm，上部直徑約3mm，下部直徑約1.5mm。表面黃白色或綠白色（貯久色漸深），密被短柔毛。偶見葉狀苞片?；ㄝ嗑G色，先端5裂，裂片有毛，長約2mm。開放者花冠筒狀，先端二唇形；雄蕊5，附于筒壁，黃色；雌蕊1，子房無毛。氣清香，味淡、徼苦。 鑒別 取本品粉末0.2g，加甲醇5ml，放置12小時，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取綠原酸對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(附錄 B)試驗

2、，吸取供試品溶液1020l、對照品溶液lOl，分別點于同一硅膠H薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水(7：2.5：2.5)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。 檢查 水分 不得過12.0%(附錄H 第二法)。 總灰分 不得過10. 0%(附錄K)。 酸不溶性灰分 不得過3O%（附錄K）。 重金屬及有害元素 照鉛、鎘、砷、汞、銅測定法（附錄B原子吸收分光光度法或電感耦合等離子體質(zhì)譜法）測定，鉛不得過百萬分之五；鎘不得過千萬分之三；砷不得過百萬分之二；汞不得過千萬分之二；銅不得過百萬分之二十。 含量測定 綠

3、原酸 照高效液相色譜法(附錄D)測定。 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.4%磷酸溶液(13：87)為流動相；檢測波長為327nm。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于1000。 對照品溶滾的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每Iml含40g的溶液，即得(10以下保存)。 供試品溶液的制備 取本品粉末（過四號篩）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率30kHz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置25ml棕色量瓶

4、中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。 測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5lOl，注入液相色譜儀，測定，即得。 本品按干燥品計算，含綠原酸(Cl6H1809)不得少于1.5%。 木犀草苷 照高效液相色譜法(附錄D)測定。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用苯基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6mm×250mm,5pm），以乙腈為流動相A，以o5%冰醋酸溶液為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為350nm。理論板數(shù)按木犀草苷峰計算應(yīng)不低于20000。 時間（分鐘） 流動相A（%） 流動相B（%） 015 1020 9080 15

5、30 20 80 3040 2030 8070 對照品溶液的制備 取木犀草苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每Iml含40g的溶液，即得。 供試品溶液的制備 取本品細粉末（過四號篩）約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率35kHz)l小時，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液lOml，回收溶劑至干，殘渣用70%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。 測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10弘l，注入液相色譜儀，測定，即得。 本品按干燥品計算，含木犀草苷(C21H20O

6、11)不得少于0.050%。四、驗證小組成員及職責(zé)4.1驗證小組成員4.2人員職責(zé)人 員職 責(zé)驗證小組組長組織相關(guān)的驗證培訓(xùn)；負責(zé)起草驗證方案、組織項目的具體驗證、督促驗證小組成員按照驗證方案的要求做好驗證記錄；起草并完成驗證報告，對整個驗證項目負責(zé)。驗證小組成員按照方案實施驗證、并做好記錄、意外情況及時匯報和記錄、協(xié)助起草驗證方案和報告。 表1：五、驗證實施步驟5.1、為了確保驗證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠，采取以下幾個先行保障措施5.2儀器：己經(jīng)過校正并在有效期內(nèi)5.3人員：均經(jīng)過培訓(xùn)，熟悉方法及使用的儀器5.4對照品：均購自藥品檢驗所5.5材料：均符合檢驗要求5.6參考資料：中國藥典2010年版一部

7、藥品生產(chǎn)驗證指南(2003版) 檢測結(jié)果:表檢驗結(jié)果結(jié)果判斷試驗A試驗B檢測人: 檢測日期:5.7 驗證標(biāo)準(zhǔn):試驗A供試品溶液在與對照藥材溶液及對照品溶液相同的位置顯相同顏色的斑點。試驗B供試品溶液在與對照品溶液相同的位置未顯斑點。5.8 檢驗結(jié)果評價 六 含量測定照高效液相色譜法測定。儀器：LC-10AT液相色譜儀6.1空白溶液的制備：直接取甲醇作為空白溶液。6.2將結(jié)果填入下表。表 含量測定專屬性試驗表保留時間供試品溶液對照品溶液空白溶液檢測人： 檢測日期：6.3驗證標(biāo)準(zhǔn)：供試品溶液中應(yīng)呈現(xiàn)與木犀草苷對照品保留時間相同的色譜峰；空白溶液中在這點應(yīng)無色譜峰。6.4結(jié)果評價以濃度為橫坐標(biāo)，峰面

8、積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將結(jié)果填入下表。表 木犀草苷不同濃度的峰面積濃度（mg/ml）峰面積（v*sec）回歸方程相關(guān)系數(shù)檢測人： 檢測日期：6.5結(jié)果評價6.6準(zhǔn)確度6.7 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用苯基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6mm×250mm,5pm），以乙腈為流動相A，以o5%冰醋酸溶液為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為350nm。理論板數(shù)按木犀草苷峰計算應(yīng)不低于20000。 時間（分鐘） 流動相A（%） 流動相B（%） 015 1020 9080 1530 20 80 3040 2030 8070 6.

9、8 對照品溶液的制備 取木犀草苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每Iml含40g的溶液，即得。6.9供試品溶液的制備 取本品細粉末（過四號篩）約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率35kHz)l小時，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液lOml，回收溶劑至干，殘渣用70%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。 測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10Ml，注入液相色譜儀，測定，即得。 本品按干燥品計算，含木犀草苷(C21H20O11)不得少于0.050%。式中f為對照

10、品的濃度除以對照品峰面積得到的值的平均值；AT為對照品峰面積；單位v*sec ；n為供試品的稀釋倍數(shù)；WT為供試品的稱量；單位g。6.11 計算結(jié)果填入下表：表5 含量測定木犀草苷加樣回收率試驗表序號樣品稱量（g）樣品中木犀草苷含量（mg）對照品加入量（mg）實測值（mg）回收率（%）回收率的平均值（）RSD（%）123456789檢測人： 檢測日期：6.12 結(jié)果評價七 精密度7.1重復(fù)性（設(shè)操作人員A）7.1.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用苯基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6mm×250mm,5pm），以乙腈為流動相A，以o5%冰醋酸

11、溶液為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為350nm。理論板數(shù)按木犀草苷峰計算應(yīng)不低于20000。 時間（分鐘） 流動相A（%） 流動相B（%） 015 1020 9080 1530 20 80 3040 2030 80707.1.2對照品溶液的制備 取木犀草苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每Iml含40g的溶液，即得。7.1.3供試品溶液的制備 取本品細粉末（過四號篩）約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率35kHz)l小時，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液lOml，回收

12、溶劑至干，殘渣用70%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。 測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10Ml，注入液相色譜儀，測定，即得。 本品按干燥品計算，含木犀草苷(C21H20O11)不得少于0.050%。7.1.4計算 式中f為對照品的濃度除以對照品峰面積得到的值的平均值；AT為對照品峰面積；單位v*sec ；n為供試品的稀釋倍數(shù)；WT為供試品的稱量；單位g。7.1.5將計算的結(jié)果填入下表表 含量測定木犀草苷重復(fù)性試驗表序號樣品稱量（g）含量（g/g）含量的平均值（g/g）RSD（%）123456檢測人： 檢測日期：7.1.6結(jié)果評價7.2中間精密度（換一時間，換

13、一操作人員，設(shè)操作人員為B）7.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用苯基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6mm×250mm,5pm），以乙腈為流動相A，以o5%冰醋酸溶液為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為350nm。理論板數(shù)按木犀草苷峰計算應(yīng)不低于20000。 時間（分鐘） 流動相A（%） 流動相B（%） 015 1020 9080 1530 20 80 3040 2030 80707.2.2對照品溶液的制備 取木犀草苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每Iml含40g的溶液，即得。7.2.3供試品溶液的制備 取本品細粉末

14、（過四號篩）約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率35kHz)l小時，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液lOml，回收溶劑至干，殘渣用70%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。 測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10Ml，注入液相色譜儀，測定，即得。 本品按干燥品計算，含木犀草苷(C21H20O11)不得少于0.050%。7.2.4計算 式中f為對照品的濃度除以對照品峰面積得到的值的平均值；AT為對照品峰面積；單位v*sec ；n為供試品的稀釋倍數(shù)；WT為供試品的稱量

15、；單位g。7.2.5將計算的結(jié)果填入下表表： 含量測定木犀草苷中間精密度試驗表序號樣品稱量（g）含量（g/g）含量的平均值（g/g）RSD（%）操作員A123456操作員B123456檢測人： 檢測日期：7.2.6結(jié)果評價八 耐用性8.1以流動相的組成比例、同一規(guī)格的色譜柱為變動因素，得出測定結(jié)果不受影響的程度，為使方法用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)。8.2色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用苯基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6mm×250mm,5pm），以乙腈為流動相A，以o5%冰醋酸溶液為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為350nm。理論板數(shù)按木犀草苷峰計算應(yīng)不低于20000。 時間（分鐘） 流動相A（%） 流動相B（%） 015 1020 9080 1530 20 80 3040 2030 80708.3對照品溶液的制備 取木犀草苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每Iml含40g的溶液，即得。8.4供試品溶液的制備 取本品細粉末（過四號篩）約2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率35kHz)l小時，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重