鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗

1、1 1Ames試驗試驗Ames試驗，即污染物致突變性檢測，也稱為鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗 污染物對人體的潛在危害，引起人們的普遍關(guān)注。世界上已發(fā)展了百余種短期快速測試法，檢測污染物的遺傳毒性效應(yīng)。B.N.Ames等經(jīng)十余年努力，于1975年建立并不斷發(fā)展完善的沙門氏菌回復(fù)突變試驗（亦稱Ames試驗）已被世界各國廣為采用。 2 2 原理：檢測受試物誘發(fā)原理：檢測受試物誘發(fā)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株養(yǎng)缺陷型突變株(his(his- -) )回復(fù)突變成野生型回復(fù)突變成野生型(his(his+ +) )的能的能力。即組氨酸突變菌力。即組氨酸突變菌(his(his- -

2、) ) 在不含組氨酸的最低營養(yǎng)在不含組氨酸的最低營養(yǎng)平皿上不能生長；回復(fù)突變成野生型平皿上不能生長；回復(fù)突變成野生型(his(his+ +) )，可在不，可在不含組氨酸的最低營養(yǎng)平皿上生長。含組氨酸的最低營養(yǎng)平皿上生長。 是應(yīng)用最廣泛的檢測是應(yīng)用最廣泛的檢測基因突變基因突變的體外試驗。的體外試驗。 Ames試驗試驗3 3u標(biāo)準(zhǔn)試驗菌株標(biāo)準(zhǔn)試驗菌株(配套菌株配套菌株)：有四種：有四種 TA98、TA97 ：檢測移碼突變：檢測移碼突變 TA100：檢測堿基置換突變：檢測堿基置換突變 TA102：對醛、過氧化物及：對醛、過氧化物及DNA交聯(lián)劑較敏感交聯(lián)劑較敏感 u這四個試驗菌株除了含有這四個試驗菌株

3、除了含有hishis- -突變，還有一些附加突突變，還有一些附加突變，以提高敏感性變，以提高敏感性 Ames試驗試驗4 4不加不加S9 混合液得到陽性結(jié)果，說明受試物是混合液得到陽性結(jié)果，說明受試物是直接致突變物直接致突變物 加加S9 混合液才得到陽性結(jié)果，說明該受試物混合液才得到陽性結(jié)果，說明該受試物是間接致突變物是間接致突變物 Ames試驗試驗5 5 Ames試驗試驗常規(guī)方法： 斑點試驗 平板摻入試驗6 6 Ames試驗試驗斑點試驗：1、吸取測試菌增菌培養(yǎng)后的菌液0.1ml，注入融化并保溫45左右的上層軟瓊脂中，需S9活化的再加0.3ml0.4mlS9混合液，立即混勻，傾于底平板上，鋪平冷

4、凝。2、用滅菌尖頭鑷夾滅菌圓濾紙片邊緣，紙片浸濕受試物溶液，或直接取固態(tài)受試物，貼放于上層培養(yǎng)基的表面。同時做溶劑對照和陽性對照，分別貼放于平板上相應(yīng)位置。3、平皿倒置于37溫箱培養(yǎng)48h。在紙片外圍長出密集菌落圈，為陽性；菌落散布，密度與自發(fā)回變相似，為陰性。 7 7 Ames試驗試驗平板摻入試驗：1、將一定量樣液和0.1ml測試菌液均加入上層軟瓊脂中，需代謝活化的再加0.3ml0.4ml S9混合液，混勻后迅速傾于底平板上鋪平冷凝。2、同時做陰性和陽性對照，每種處理做3個平行。試樣通常設(shè)4個5個劑量。選擇劑量范圍開始應(yīng)大些，有陽性或可疑陽性結(jié)果時，再在較窄的劑量范圍內(nèi)確定劑量反應(yīng)關(guān)系。培養(yǎng)

5、同上。3、同一劑量各皿回變菌落均數(shù)與各陰性對照皿自發(fā)回變菌落均數(shù)之比，為致變比（MR）。MR值2，且有劑量-反應(yīng)關(guān)系，背景正常，則判為致突變陽性。 8 8鼠傷寒沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌野生型（野生型（his） 鼠傷寒沙門氏菌鼠傷寒沙門氏菌 突變型（突變型（his） 正向突變正向突變回復(fù)突變回復(fù)突變受試物受試物試驗菌種試驗菌種(his(his- -) )S S9 9試驗菌種試驗菌種(his(his- -) )S S9 9Ames試驗原理試驗原理9 9 結(jié)果判斷結(jié)果判斷: 只要在一種試驗菌株得到陽性結(jié)果，即認(rèn)為只要在一種試驗菌株得到陽性結(jié)果，即認(rèn)為受試物是致突變物受試物是致突變物 僅當(dāng)四種試驗菌株均

6、得到陰性結(jié)果，才認(rèn)為僅當(dāng)四種試驗菌株均得到陰性結(jié)果，才認(rèn)為受試物是非致突變物受試物是非致突變物 Ames試驗試驗1010 Ames試驗試驗應(yīng)用1斑點試驗只局限于能在瓊脂上擴散的化學(xué)物質(zhì)，大多數(shù)多環(huán)芳烴和難溶于水的化學(xué)物質(zhì)均不適宜用此法。此法敏感性較差，主要是一種定性試驗，適用于快速篩選大量受試化合物。2平板摻入試驗可定量測試樣品致突變性的強弱。此法較斑點試驗敏感，獲陽性結(jié)果所需的劑量較低。點試獲陽性結(jié)果的濃度用于摻入試驗（每皿0.1ml），往往出現(xiàn)抑（殺）菌作用。3致變作用遲緩或有抑菌作用的試樣，培養(yǎng)時間延長至72h。1111 Ames試驗試驗應(yīng)用4揮發(fā)性的液體和氣體試樣，可用干燥器內(nèi)試驗法進行測試。5目前，Ames試驗作為檢測環(huán)境誘變劑的