細胞生物學(xué)課件第三章細胞技術(shù)

1、METHODS AND TECHNIQUES內(nèi)容提要內(nèi)容提要第一節(jié)第一節(jié) 顯微技術(shù)顯微技術(shù) 一、光學(xué)顯微鏡一、光學(xué)顯微鏡 二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡 三、顯微操作技術(shù)三、顯微操作技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)第三節(jié)第三節(jié) 細胞分離技術(shù)細胞分離技術(shù)第四節(jié)第四節(jié) 細胞培養(yǎng)與細胞雜交細胞培養(yǎng)與細胞雜交第五節(jié)第五節(jié) 模式生物模式生物第一節(jié)第一節(jié) 顯微技術(shù)顯微技術(shù) 光學(xué)顯微鏡：以可見光可見光（或紫外線）為光源。 電子顯微鏡：以電子束電子束為光源。、光學(xué)顯微鏡、光學(xué)顯微鏡 1. 構(gòu)成： 照明系統(tǒng) 光學(xué)放大系統(tǒng) 機械裝置 2. 原理：經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大

2、成經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大成像。像。（一）普通光學(xué)顯微鏡（一）普通光學(xué)顯微鏡 3. 分辨力分辨力：指分辨物體最小間隔的能力。 R = 0.61 / NA 其中其中為入射光線波長；為入射光線波長；NA為鏡口率為鏡口率 sin/2，n=介質(zhì)折射率；=鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角） 。 如何提高顯微鏡的分辨能力？表一、幾種介質(zhì)的折射率 顯微鏡的幾個光學(xué)特點：顯微鏡的幾個光學(xué)特點： 制作光學(xué)鏡頭所用的玻璃折射率為1.651.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的越好。 sin /2的最大值必然小于1；介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.050.95；油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。 普通光線

3、的波長為400700nm，分辨力數(shù)值不會小于0.2m，人眼的分辨力為0.2mm,因此顯微鏡的最大設(shè)計倍數(shù)為1000X。（二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope特點：光源為紫外線紫外線，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；有兩個特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。Fluorescence image of epithelial cell(上皮細胞上皮細胞), DNA in blue and Microtubules in green 用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構(gòu)。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。微管呈綠色、微絲紅色、核藍色（三）激光共聚焦掃描顯微境（三）激光共聚焦掃描顯

4、微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM 用激光激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描。 能顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)立體結(jié)構(gòu)。 分辨力是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。LCSM microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue)（四）暗視野顯微鏡（四）暗視野顯微鏡 dark field microscope 聚光鏡中央有擋光片擋光片，照明光線不直接進人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進入物鏡。因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。 可觀察 420

5、0nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡兩個特殊之處。1.環(huán)形光闌環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間，使透過聚光器的光線形成空心光錐空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。2.相位板相位板（annular phaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。（五）相差顯微鏡（五）相差顯微鏡原理原理用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本用途：觀察未經(jīng)染色的玻片標(biāo)本（六）偏光顯微鏡（六）偏光顯微鏡po

6、larizing microscope 用于檢測具有雙折射性雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。 光源前有偏振片偏振片（起偏器），使進入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器檢偏器 （與起偏器方向垂直的偏振片）。 載物臺是可以旋轉(zhuǎn)。淀粉（七）微分干涉差顯微鏡（七）微分干涉差顯微鏡 Differential interference contrast microscope （DIC） 1952年，Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明暗效果加強影像的明暗效果，能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影。標(biāo)本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。（八

7、）倒置顯微鏡）倒置顯微鏡 inverse microscope 物鏡與照明系統(tǒng)顛倒物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前，前者在載物臺之下，后者在者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，通常具有相養(yǎng)的活細胞，通常具有相差物鏡，有的還具有熒光差物鏡，有的還具有熒光裝置。裝置。 （九）比較顯微鏡比較顯微鏡 屬特種顯微鏡：用一組目鏡同時觀察到左右兩個光學(xué)系統(tǒng)物方物體的像。并通過對接、切割、重疊、旋轉(zhuǎn)等手段，對兩個或兩個以上物體進行宏觀或微觀上的比較，以檢查、分析和鑒別它們的微小差別：形式、組織、結(jié)構(gòu)、色彩或材料。 簡單的比較顯微鏡簡單的比較顯微鏡可由兩臺普通顯微鏡加一個可共享兩

8、臺顯微鏡物鏡的目鏡系統(tǒng)（比較橋）組成。 專業(yè)的比較顯微鏡專業(yè)的比較顯微鏡采用一體化結(jié)構(gòu)，光學(xué)系統(tǒng)、載物臺等依照特殊需求進行專門設(shè)計，功能十分強大。 比較顯微鏡比較顯微鏡是刑偵技術(shù)、檢察技術(shù)和法醫(yī)鑒定的主要科學(xué)技術(shù)手段之一，在比較顯微鏡里，一顆子彈的兩截可以在同樣的鏡頭下連成一體，使得觀察者可以借兩者的異?？拷鼇肀容^分析每顆子彈上的痕跡。近年來在化學(xué)、物理、冶金、醫(yī)藥、材料、環(huán)境、微電子研究等方面也有廣泛應(yīng)用。（十）當(dāng)代顯微鏡的發(fā)展趨勢 組合模式組合模式：集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體。 自動化與電子化自動化與電子化。 明明暗暗偏偏二、電子顯微鏡二、電子顯微鏡（一）透射電

9、子顯微鏡一）透射電子顯微鏡transmission electron microscope, TEM 以電子束作光源，電磁場作透鏡以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束的波長短，并且波長與加速電壓(通常50120KV)的平方根成反比。 由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。 分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達百萬倍放大倍數(shù)可達百萬倍。 用于觀察超微結(jié)構(gòu)觀察超微結(jié)構(gòu)（ultrastructure），即小于0.2m、光學(xué)顯 微 鏡 下 無 法 看 清 的 結(jié) 構(gòu) ， 又 稱 亞 顯 微 結(jié) 構(gòu)亞 顯 微 結(jié) 構(gòu)（submicroscopic structures）。

10、1. 原理原理透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM表二、不同光線的波長表二、不同光線的波長2、制樣技術(shù)1）超薄切片）超薄切片 電子束穿透力很弱電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成，用于電鏡觀察的標(biāo)本須制成厚度僅厚度僅50nm的超薄切片的超薄切片，用超薄切片機（，用超薄切片機（ultramicrotome）制）制作。作。 通常以鋨酸和戊二醛通常以鋨酸和戊二醛固定固定樣品，丙酮逐級樣品，丙酮逐級脫水脫水，環(huán)氧樹脂，環(huán)氧樹脂包埋包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金屬（鈾、鉛），以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽鹽

11、染色染色。2）負染技術(shù)）負染技術(shù) 用重金屬鹽用重金屬鹽( (如磷鎢如磷鎢酸酸) )對鋪展在載網(wǎng)上對鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去的樣品染色；吸去染料，干燥后，染料，干燥后，樣樣品凹陷處鋪了一層品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的重金屬鹽，而凸的出地方?jīng)]有染料沉出地方?jīng)]有染料沉積，從而出現(xiàn)負染積，從而出現(xiàn)負染效果，效果，分辨力可達分辨力可達1.5nm1.5nm左右。左右。Negative Stained Actin肌動蛋白纖維的肌動蛋白纖維的負染電鏡照片負染電鏡照片3）冰凍蝕刻）冰凍蝕刻 freeze-etching 亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于亦稱冰凍斷裂。標(biāo)本置于干冰或干冰或液氮中冰凍液氮中冰凍。然后。

12、然后斷開，升溫后，冰升華，斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷裂面上裂面上噴涂一層蒸汽碳和噴涂一層蒸汽碳和鉑。鉑。然后將組織溶掉，把然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，即為碳和鉑的膜剝下來，即為復(fù)膜復(fù)膜（replica）。）。A Yeast Cell 20世紀60年代問世，用來觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)觀察標(biāo)本表面結(jié)構(gòu)。 分辨力為分辨力為610nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。（二）掃描電子顯微鏡（二）掃描電子顯微鏡Scanning electron microscope（

13、SEM） 工作原理工作原理：用一束極細的電子束掃描樣品電子束掃描樣品，在樣品表面激表面激發(fā)出次級電子，發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測器收集，信號經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。掃描電子顯微鏡原理掃描電子顯微鏡原理酵母細胞酵母細胞（三）掃描隧道顯微鏡（三）掃描隧道顯微鏡scanning tunneling microscope，STM 原理：根據(jù)隧道效應(yīng)隧道效應(yīng)而設(shè)計，當(dāng)原子尺度的針尖在不到一個納米的

14、高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。 分辨率分辨率：橫向為0.10.2nm，縱向可達0.001nm。 用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進行觀察。掃描隧道顯微鏡原理掃描隧道顯微鏡原理STM image, Benzene molecules accumulate at step edges on Cu三、顯微操作技術(shù)三、顯微操作技術(shù)micromanipulation technique 在倒置顯微鏡下利用顯微操作器

15、顯微操作器進行細胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動的機械裝置。 顯微操作技術(shù)包括細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植胚胎移植以及顯微切割顯微切割等。 細胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史，細胞核移植技術(shù)已有幾十年的歷史，Gurdon等人（等人（1962）對非）對非洲爪蟾進行核移植獲得成功。我國著名學(xué)者洲爪蟾進行核移植獲得成功。我國著名學(xué)者童第周童第周等上個世紀等上個世紀70年代在魚類細胞核移植方面進行了許多工作，并取得了豐碩成果。年代在魚類細胞核移植方面進行了許多工作，并取得了豐碩成果。顯微操作儀顯微操作儀第二節(jié)第二節(jié)

16、 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)一、細胞化學(xué)技術(shù)一、細胞化學(xué)技術(shù)組織化學(xué)和細胞化學(xué)染色方法化學(xué)染色方法（histochemical and cytochemical staining method）用于對某些細胞成分進行定性和定位定性和定位研究。（一）固定（一）固定1. 物理固定物理固定：血膜空氣快速干燥、冷凍干燥。2. 化學(xué)固定化學(xué)固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。（二）顯示方法（二）顯示方法1.金屬沉淀法金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應(yīng)產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。2.

17、Schiff反應(yīng)反應(yīng)：細胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應(yīng)）。3.聯(lián)苯胺反應(yīng)聯(lián)苯胺反應(yīng)：過氧化酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物。4.脂溶染色法脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。5.茚三酮反應(yīng)茚三酮反應(yīng)：顯示蛋白質(zhì)。二、免疫細胞化學(xué)二、免疫細胞化學(xué) 根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對抗原進行定位測定的技術(shù)。常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。 免疫熒光法免疫熒光法（immunofluorescent technique）：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。 酶標(biāo)免疫法酶

18、標(biāo)免疫法（enzyme-labeled antibody method）：常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應(yīng)后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。三、顯微光譜分析技術(shù)三、顯微光譜分析技術(shù) 細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。 可利用顯微分光光度計對某些成分進行定位、定性和定量測定。四、放射自顯影術(shù)四、放射自顯影術(shù) 用于研究標(biāo)記化合物研究標(biāo)記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。 原理：將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過將放射性同位素標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一

19、段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。使乳膠感光。 一般用14C和3H標(biāo)記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。14C半衰期為5730年，3H為12.5年。五、分子雜交技術(shù)五、分子雜交技術(shù) 具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合和堿基配對，形成氫鍵結(jié)合和堿基配對，形成DNA-DNA，DNA-RNA或或RNA-RNA雜交的雙鏈分子雜交的雙鏈分子。可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關(guān)系。 （一）原位雜交（一

20、）原位雜交（in situ hybridization）。 用于檢測染色體上的特殊DNA序列。最初是使用帶放射性的DNA探針，后來發(fā)明了免疫探針法。（二）Southern雜交 是體外分析特異DNA序列的方法，操作時先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認出與探針互補的特殊核苷序列。 將RNA轉(zhuǎn)移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交。 Edwin Southern1975年發(fā)明核酸雜交技術(shù)（Southern blot）。 隨后，人們將RNA和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上的技術(shù)分別

21、命名為Northern blot和Western blot。 90年代初，Southern和他的科研團隊在DNA芯片芯片方面的工作：開發(fā)了在固相的玻璃表面合成特定核苷酸短序列的方法，為DNA及RNA雜交的熒光檢測鋪平了道路。這項技術(shù)和先進的工藝相結(jié)合，最終產(chǎn)生了DNA芯片。 六、六、PCR 技術(shù)技術(shù) PCR即：polymerase chain reaction。 反應(yīng)體系反應(yīng)體系：樣品DNA；引物（primer），約15-20個核苷酸；4種dNTP；Tag DNA聚合酶，來自于嗜熱水生菌Thermus aquaticus，最適作用溫度7580，短時間在95下不失活。緩沖體系和Mg2+。 反應(yīng)過

22、程反應(yīng)過程：變性：約變性：約90-95；復(fù)性：約復(fù)性：約60左右；左右；延伸：延伸：70-75；重復(fù)重復(fù) “變性變性復(fù)性復(fù)性延伸延伸” 過程過程20-30次循環(huán)。次循環(huán)。PCR原理原理第三節(jié)第三節(jié) 細胞分離技術(shù)細胞分離技術(shù)一、離心技術(shù) 離心是分離細胞器（如細胞核、線粒體、高爾基體）分離細胞器（如細胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子及各種大分子基本手段。 高速離心機：高速離心機：轉(zhuǎn)速為1025kr/min。 超速離心機：超速離心機：轉(zhuǎn)速25kr/min，離心力89K者。 目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100000r/min，離心力超過500Kg。 （一）差速離心（一）差速離心 Different

23、ial centrifugation 特點： 介質(zhì)密度均一；介質(zhì)密度均一； 速度由低向高，逐級離心。速度由低向高，逐級離心。 用途：分離大小相差懸殊大小相差懸殊的細胞和細胞器。 沉降順序：核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體。 可將細胞器初步分離初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。 Low speedHigh speedDifferential centrifugation（二）密度梯度離心（二）密度梯度離心 用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細胞分層、分離。

24、類型類型：速度沉降、等密度沉降。 常用介質(zhì)常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分離活細胞的介質(zhì)要求： 1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高； 2）PH中性或易調(diào)為中性； 3）濃度大時滲透壓不大； 4）對細胞無毒。1、速度沉降 velocity sedimentation 用途：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。 特點：介質(zhì)密度較低介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。 原理：介質(zhì)密度梯度平緩介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。2. 等密度沉降等密度沉降 isopycnic sedimentation 用途：分離密度不等的顆粒。 特點

25、： 介質(zhì)密度較高，陡度大，介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最介質(zhì)密度較高，陡度大，介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度。大密度。 所需的力場通常比速率沉降法大所需的力場通常比速率沉降法大10100倍，往往需要高速或超速倍，往往需要高速或超速離心。離心。 原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的成分分離。Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation二、流式細胞術(shù)二、流式細胞術(shù) 用途：對單個細胞單個細胞進行快速定量分析與分選快速定量分析與分選。 原理：包在鞘液中的細

26、胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光散射光和熒光，這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度， 經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%。 流式細胞儀作為一種先進的細胞定量分析檢測儀器，設(shè)計上采用了許多獨特的技術(shù)，其中涉及到液流系統(tǒng)、光路系液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、信號測量和細胞分選統(tǒng)、信號測量和細胞分選等4個方面。 細胞的分選細胞的分選 通過分離含有單細胞的液滴而實現(xiàn)的。在流動室的噴口上配有一個超高

27、頻電晶體，充電后振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴液流斷裂為均勻的液滴，待測定細胞就分散在這些液滴之中。 將這些液滴充以正負不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板時，在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現(xiàn)細胞的分離。 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍用于白血病的分型、腫瘤細胞染色體的異倍用于白血病的分型、腫瘤細胞染色體的異倍性測定，以及免疫學(xué)研究，并已開始用于細菌鑒性測定，以及免疫學(xué)研究，并已開始用于細菌鑒定，病毒感染細胞的識別和愛滋病感染者定，病毒感染細胞的識別和愛滋病感染者T4、T8細胞的記數(shù)。細胞的記數(shù)。70年代以來，隨著流式細胞技術(shù)水平的不斷年

28、代以來，隨著流式細胞技術(shù)水平的不斷提高，其應(yīng)用范圍也日益廣泛。流式細胞術(shù)已普提高，其應(yīng)用范圍也日益廣泛。流式細胞術(shù)已普遍應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細胞生物學(xué)、遍應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細胞生物學(xué)、細胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)等臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研細胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)等臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。究領(lǐng)域。三、細胞電泳三、細胞電泳 原理：在一定pH值下細胞表面帶有凈的正或負電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動。 各種細胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細胞荷電量有所不同電量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同泳動速度不同 。 用途：檢測細胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)、分離不同種類的細檢測細胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)

29、、分離不同種類的細胞，胞，如分離哺乳動物的X和和Y精子精子。第四節(jié)第四節(jié) 細胞培養(yǎng)與細胞雜交細胞培養(yǎng)與細胞雜交一、細胞培養(yǎng)一、細胞培養(yǎng)（一）動物細胞培養(yǎng)（一）動物細胞培養(yǎng) 群體培養(yǎng)群體培養(yǎng)（mass culture）：將含有一定數(shù)量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細胞層均勻的單細胞層； 克隆培養(yǎng)克隆培養(yǎng)（clonal culture）：培養(yǎng)高度稀釋的細胞懸液，細胞貼壁生長，每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆。 轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)法：轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)法：為制取細胞產(chǎn)品而設(shè)計，大容量旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，使培養(yǎng)為制取細胞產(chǎn)品而設(shè)計，大容量旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，使培養(yǎng)的細胞始終處于懸浮狀態(tài)

30、之中。的細胞始終處于懸浮狀態(tài)之中。 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) （primary culture）：培養(yǎng)直接來自動物機體的直接來自動物機體的細胞群。細胞群。將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培養(yǎng)瓶稱為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage）。細胞株細胞株（cell strain）：從原代培養(yǎng)細胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細胞群。細胞系細胞系（cell line）：從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細胞，可無限繁殖。 克隆克?。╟lone）：亦稱無性系。指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細胞群。表三、實驗室中常用的幾種細胞系表三、實驗室中常用的幾種細胞系細胞系名稱細胞類型來

31、源3T3成纖維細胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細胞Henrietta Lacks BHK21成纖維細胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細胞袋鼠L6成肌細胞大鼠PCI2嗜鉻細胞大鼠SP2漿細胞小鼠SP20骨髓瘤漿細胞小鼠CHO卵巢細胞中國地鼠*Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 （二）植物細胞培養(yǎng)（二）植物細胞培養(yǎng)1.外植體培養(yǎng)外植體培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織。用于研究植物的生長發(fā)育、分化和變異；進行無性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。2.懸浮細胞培養(yǎng)懸浮細胞培養(yǎng)：適合于進行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。3

32、.原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細胞，特點：比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)，如DNA；便于進行細胞融合，形成雜交細胞；適宜條件下可產(chǎn)生細胞壁，經(jīng)誘導(dǎo)分化成完整植株。4.單倍體培養(yǎng)單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。Plant Cell CultureAnimal Cell Culture二、細胞融合 通過培養(yǎng)和介導(dǎo)，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核一個雙核或多核細胞的過程細胞的過程稱為細胞融合（cell fusion）或細胞雜交。 同核體同核體：相同基因型的細胞融合而成。 異核體：異核體：不同基因型的細胞融合而成。 自發(fā)融合：自發(fā)融合：同種細胞在培養(yǎng)過程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。 誘

33、發(fā)融合：誘發(fā)融合：異種間的細胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合。 誘導(dǎo)細胞融合的方法：生物方法生物方法（仙臺病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒 ）、化學(xué)方法化學(xué)方法（聚乙二醇PEG）、物理物理方法方法（電擊和激光）。單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù)：正常淋巴細胞正常淋巴細胞（如小鼠脾細胞）具有分泌抗體的能力，但不能長期培養(yǎng)，瘤細胞瘤細胞（如骨髓瘤）可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。英人Kohler和Milstein 1975將兩種細胞雜交而創(chuàng)立單克隆抗體技術(shù)，獲1984年諾貝爾獎。第五節(jié)第五節(jié) 模模 式式 生生 物物1. 酵母細胞酵母細胞 屬簡單的單細胞屬簡單的單細胞真真核生物，核生物，易于培養(yǎng)，易于培養(yǎng)，且

34、生長迅速，被廣且生長迅速，被廣泛用于現(xiàn)代生物學(xué)泛用于現(xiàn)代生物學(xué)研究中研究中2. 秀麗線蟲秀麗線蟲： 在秀麗線蟲的全部在秀麗線蟲的全部1090個細胞中，有個細胞中，有131個細胞個細胞以一種不變的方式，在固定的發(fā)育時間和固定位以一種不變的方式，在固定的發(fā)育時間和固定位置消失。秀麗線蟲數(shù)目一定的細胞個數(shù)以及固定置消失。秀麗線蟲數(shù)目一定的細胞個數(shù)以及固定的細胞凋亡，是決定秀麗線蟲在的細胞凋亡，是決定秀麗線蟲在研究細胞凋亡研究細胞凋亡方方面地位的主要原因面地位的主要原因。 3. 果蠅果蠅： 在生物學(xué)方面，長期的研究積累了很多關(guān)于果蠅的知識和在生物學(xué)方面，長期的研究積累了很多關(guān)于果蠅的知識和信息，制備了

35、大量的分布于數(shù)以千計的基因中的信息，制備了大量的分布于數(shù)以千計的基因中的突變體突變體。 果蠅還有很多攜帶便于遺傳操作的表形標(biāo)記、分子標(biāo)記或果蠅還有很多攜帶便于遺傳操作的表形標(biāo)記、分子標(biāo)記或其它標(biāo)記的其它標(biāo)記的特征染色體特征染色體，這些工具使得進行大規(guī)?；蚪M，這些工具使得進行大規(guī)?；蚪M篩選分離一系列可見或致死表型，甚至可以分離那些只在篩選分離一系列可見或致死表型，甚至可以分離那些只在突變個體的第二或第三代才表現(xiàn)的表型。突變個體的第二或第三代才表現(xiàn)的表型。 在技術(shù)上，在果蠅研究過程中發(fā)展的在技術(shù)上，在果蠅研究過程中發(fā)展的一些有效技術(shù)，現(xiàn)在一些有效技術(shù)，現(xiàn)在還是只能應(yīng)用于果蠅，還是只能應(yīng)用于果蠅

36、，如：增強子陷阱技術(shù)、定點同源重如：增強子陷阱技術(shù)、定點同源重組技術(shù)、雙組分異位基因表達系統(tǒng)、嵌合體分析技術(shù)及基組技術(shù)、雙組分異位基因表達系統(tǒng)、嵌合體分析技術(shù)及基因定點敲除技術(shù)等因定點敲除技術(shù)等 4. 斑馬魚斑馬魚： 在生物學(xué)上，斑馬魚體外受精，胚胎在體外發(fā)育在生物學(xué)上，斑馬魚體外受精，胚胎在體外發(fā)育并且透明，易于觀察和操作，受精卵直徑約并且透明，易于觀察和操作，受精卵直徑約1mm，便于進行顯微注射和細胞移植便于進行顯微注射和細胞移植。 在技術(shù)上，斑馬魚可以像線蟲和果蠅一樣，進行在技術(shù)上，斑馬魚可以像線蟲和果蠅一樣，進行細胞標(biāo)記和細胞譜系跟蹤，也可以像爪蟾一樣進細胞標(biāo)記和細胞譜系跟蹤，也可以像爪蟾一樣進行胚胎的細胞移植。在基因水平，已經(jīng)發(fā)展了轉(zhuǎn)行胚胎的細胞移植。在基因水平，已經(jīng)發(fā)展了轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因過量表達技術(shù)、隨即及靶基因定基因技術(shù)、基因過量表達技術(shù)、隨即及靶基