第二章薄層色譜

1、第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 色譜分離法是目前有機分析中使用最多，最有效的分離方法，許多化學物理性質相似的異構體、同系物以及多組分混合物的樣品往往難以用簡單的蒸餾、精餾、萃取、重結晶、升華等簡單手段分開，而用色譜方法卻能得到快速、準確的分離及測定。 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 什么是色譜方法什么是色譜方法(Chtomatography)? 最初，1903年，M.C.把干燥的葉子用石油醚萃取后，將小量的萃取液傾入充填有沉降碳酸鈣的玻璃柱子的頂端，然后用石油醚淋洗，結果葉中的色素在碳酸鈣柱上互相分離，形成不同顏色的色帶，分列在柱上；隨著淋洗液的流動，色帶的分離越加明顯。他把這種方法叫做“色譜

2、法”，色譜的英文名稱是chromatograph，它是由希臘文chromos和grapho兩字并合而成，字面上意義是顏色的記錄。 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 什么是色譜方法什么是色譜方法(Chtomatography)?第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 可以說茨維特在色譜方面做了開創(chuàng)性的工作，但以后的二十幾年并未引起很多人的注意，直到1931年有人用充填氧化鋁粉末的柱管將性質非常相似的-胡蘿卜素和-胡蘿卜素分離成功（在此之前，人們一直以為胡蘿卜素是一種純物質），并且得到的純物質可做、元素定量分析用，這才引起了許多有機化學工作者的注意，認識到色譜法在分離混合物方面有廣闊的前景，并且研究出許多新

3、技術，例如分配色譜法、紙上色譜法、薄層色譜法、離子交換色譜法等。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 現(xiàn)在，人們所說的“色譜”一詞的含義已經(jīng)遠不是茨維特所發(fā)現(xiàn)的那種色帶，而是根據(jù)混合物中各組分在互不相溶的兩相(固定相、流動相)中的吸附能力、分配系數(shù)或其它親合能力的差異而設計的分離分析方法，它集分離與分析于一體，快速、簡便、微量，成為分離分析復雜混合物的理想方法之一。 現(xiàn)在，色譜法所涉及到的領域不僅限于分析化學，而且涉及到許多其它領域如石油化工、精細化工、近代電子技術、生命科學、食品科學、臨床分析、考古學、甚至興奮劑檢測等。 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 雖然目前在各種色譜法中茨維特所發(fā)現(xiàn)的那種色帶

4、已經(jīng)沒有普遍性，但由于這種名稱在中外已沿用很久，眾所周知，不宜更改。因此國家標準中仍定名為色譜法。 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 色譜分離法的種類很多，根據(jù)流動相和固定相的特點，可以分為：柱色譜（columu chro.）薄層色譜（ thin layer chro.）紙色譜（ paper chro.）氣相色譜（ gas chro.）高效液相色譜（ high performance liquid chro.）凝膠滲透色譜（ gel permeation chro.）離子交換色譜（ iron exchang chro.） 這里我們主要介紹、。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 一、簡介一、簡介在鋪成

5、薄層的固體上進行色譜的方法。（簡述的操作及儀器）第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 優(yōu)點：操作容易，設備簡單，易于掌握。分離迅速（需幾個小時到幾十個小時，只需十幾分 鐘到幾十分鐘）。靈敏度高（可檢測10-5g物質）。固定相（與相比）、流動相（與相比）、顯色劑(與PC相比）均可靈活選用。 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 優(yōu)點： 樣品用量可小（幾微克幾十微克）可大（幾毫克幾百毫克）， 可用于備色譜。特別適用于熱不穩(wěn)定及難揮發(fā)樣品。技術多樣化（如雙向展開、多次展開等），可分離復雜樣品。不存在樣品堵塞柱子而使柱效下降或柱子報廢的問題。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 缺點：不適合揮發(fā)性樣品、自動化程度低于、

6、。分離效果不及、，不能分離過于復雜的樣品。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 二、基本原理二、基本原理1.TLC分類分類按照分離過程中樣品與固定相、流動相之間相互作用的性質，有三種TLC： 吸附色譜： 分配色譜： 離子交換色譜： 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 吸附色譜：利用樣品中各組分對吸附劑（固定相）的吸附能力不同，將其分離。 f值大溶質對吸附劑的吸附能力小。f值小溶質對吸附劑的吸附能力大。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 分配色譜：利用樣品中各組分對固定液與流動相的分配系數(shù)不同，將其分離，原則上與液液連續(xù)萃取相似。f值大溶質易溶于流動相，不易溶于固定相。f值小溶質易溶于固定相，不易溶于流動相。

7、第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 離子交換色譜：樣品中某組分與離子交換劑進行離子交換作用。這里主要介紹吸附色譜。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 2. 2. 吸附色譜原理吸附色譜原理二、基本原理二、基本原理 吸附色譜的原理是基于樣品溶液與固定相表面發(fā)生了吸附作用。吸附有物理吸附和化學吸附之分，物理吸附的特點是無選擇性、吸附速度快、可逆、吸附熱小，化學吸附的特點是有選擇性、吸附速度慢、不可逆、吸附熱大。在吸附色譜中主要發(fā)生物理吸附。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 在吸附劑固體表面，溶質分子（）與溶劑分子（）以占據(jù)吸附劑表面的位置可以互相競爭，可以頂出，也可以頂出，這種競爭可用下式表示：溶吸吸n溶 溶

8、溶液中的溶質分子； 吸被吸在吸附劑表面的溶質分子；溶溶液中的溶劑分子； 吸被吸在吸附劑表面的溶劑分子；n競爭過程中，被溶質分子頂出來的溶劑分子的個數(shù)（假定溶質分子體 積比溶劑分子大）。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 溶質分子頂替溶劑分子時，過程從左向右進行；溶劑分子頂替溶質分子時，過程從右向左進行； 一定條件下（如、吸附劑、），這種競爭達到平衡，即、的吸附或解吸速度相等。但條件改變時，平衡就會遭到破壞，如果向上述平衡體系中加入溶劑，平衡就會向左移動，然后達到新的平衡。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 在吸附薄層色譜中，展開劑(溶劑)是不斷供給的。所以，原點上與（展開劑）之間的平衡不斷遭到破壞，吸

9、附在原點上的溶質不斷解吸，解吸出來的溶于中并隨之向前移動，遇到新的吸附劑表面，與又建立起新的平衡，但又立刻遭到不斷移動上來的展開劑（）的破壞，又有一部分解吸并隨之向前移動。如此吸附解吸附再吸附再解吸附再吸附的交替過程就構成了色譜法的分離基礎。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 吸附力弱的組分容易解吸而溶于展開劑中，并隨之向前移動，Rf值較大；吸附力強的組分不易解吸，也不易隨著展開劑向前移動，f值較小；如果樣品溶液中有兩種溶質1、2，其極性不同，因而其吸附能力、Rf值也就不同，從而達到分離。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 3. 吸附作用強弱順序吸附作用強弱順序二、基本原理二、基本原理如何判斷各種溶質

10、分子在吸附劑表面吸附能力的大?。慨斎皇强紤]吸附劑與溶質分子間作用力的大小。吸附色譜常用的吸附劑為：氧化鋁、硅膠根據(jù)活性分為五個級，一級活性最高，五級最低。氧化鋁、硅膠根據(jù)活性分為五個級，一級活性最高，五級最低。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 O 聚酰胺： C - NH - (CH2)5 吸附劑的共同特點是：含有帶孤對電子的氧原子、氯原子。含有-NH-、-OH-等, 易形成氫鍵。 即極性大，易成氫鍵。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 吸附劑與非極性溶質分子間的作用力主要是誘導力；吸附劑與極性溶質分子間的作用力主要是靜電力。（靜電力誘導力）所以，溶質的極性越大，與吸附劑的作用力越大，即極性大的樣品與

11、固定相的親合力大。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 所以，吸附劑與被吸附物質間的親合作用遵循下列原則：被吸附物質的極性越大，與極性吸附劑的作用越強，單官能團化合物與硅膠或氧化鋁有下列親合順序： 羧酸醇、酰胺伯胺酯、醛、酮腈、叔胺、硝基化合物醚 烯鹵烷烷烴分子中雙鍵數(shù)目越多，親合力越大；分子中苯環(huán)數(shù)目越多，親合力越大；分子中官能團數(shù)目越多，親合力越大；（有例外：鄰硝基苯酚與硅膠、氧化鋁的親合力苯酚或硝基苯）被吸附物質的分子量越大，親合力越大（色散力大）。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 三、儀器裝置：三、儀器裝置： 用以涂布薄層用的載板有玻璃板、鋁箔及塑料板第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 四、實驗技

12、術四、實驗技術 實驗技術包括：吸附劑的選擇和制備；薄板的制備；薄板的活化；點樣技術；展開技術；顯色技術。 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 1.吸附劑的選擇和制備：吸附劑的選擇和制備： 硅膠硅膠(Silica gel): 無定形多孔物質，適用于酸性和中性物質的分離。 硅膠H不含粘合劑 硅膠G含煅石膏(gypsum)做粘合劑。有時淀粉、CMC等也可用做粘合劑。 硅膠HF254含無機螢光(fluoresent)物質，在254nm下觀察螢光。 硅膠GF254含煅石膏和無機螢光物質。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 1.吸附劑的選擇和制備：吸附劑的選擇和制備：氧化鋁氧化鋁: 無定形多孔物質，也有氧化鋁H、

13、氧化鋁G、氧化鋁HF、氧化鋁GF等型號，還有酸性、中性、堿性氧化鋁之分。氧化鋁一般在100-150目。 酸性氧化鋁10%HCl浸泡過夜，水洗至pH值=4，適用于酸性物質的分離。酸性氧化鋁酸性氧化鋁適用于pH44.5的酸性有機酸類的分離。 10min (pH=4指1g Al2O3+10ml水測濾液之pH值) 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 中性氧化鋁10HCl浸泡過夜，水洗至pH值=7，適用于分離中性物質。中性氧化鋁適用于醛、酮、醌、酯等pH約為7.5的中性物質的分離。堿性氧化鋁水中浸泡過夜，pH10,適用于分離堿性物質。堿性氧化鋁，適用于碳氫化合物、生物堿及堿性化合物的分離，一般適用于pH為9

14、-10的環(huán)境。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 1.吸附劑的選擇和制備：吸附劑的選擇和制備：聚酰胺： 由酰胺聚合而成的高分子，其分子內(nèi)存在著許多酰胺基，可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成氫鍵而產(chǎn)生吸附作用，根據(jù)樣品中組分的結構不同（如能形成氫鍵基團的數(shù)目、位置以及雙鍵和苯環(huán)數(shù)目的多少等）與聚酰胺產(chǎn)生吸附作用的強弱不同，從而使樣品達到分離。 O 聚酰胺： C - NH - (CH2)5 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 1.吸附劑的選擇和制備：吸附劑的選擇和制備：聚酰胺：聚酰胺可由錦綸絲制備，也可直接購買商品薄層色譜用聚酰胺薄膜。由錦綸絲制備聚酰胺固定相有兩種方法：第二章第二章 薄層色譜薄層色譜

15、 1.吸附劑的選擇和制備：吸附劑的選擇和制備：聚酰胺：a. 冰醋酸法： 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 1.吸附劑的選擇和制備：吸附劑的選擇和制備：聚酰胺：b. 濃鹽酸法:第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 1.吸附劑的選擇和制備：吸附劑的選擇和制備：葡聚糖凝膠： 凝膠可將分子大小和形狀不同的物質分離，好象用過篩的方法把大分子與小分子分開一樣。因此凝膠又稱為凝膠分子篩。葡聚糖凝膠是一種廣泛應用的凝膠，它是由一定分子量的葡聚糖懸浮于有機相中，再加入交聯(lián)劑表氯醇使葡聚糖交聯(lián)聚合而成（可直接購買商品使用）。它適用于蛋白質、多糖等大分子物質的分離和提純?？煞蛛x的分子量范圍從幾百到幾十萬不等。 第二章第二章

16、 薄層色譜薄層色譜 2.展開技術展開技術: 展開劑的選擇（技術關鍵，對分離效果影響最大展開劑的選擇（技術關鍵，對分離效果影響最大）：根據(jù)樣品的極性，溶解度以及吸附的活性等因素來選擇展開劑。原則：原則：展開劑對被分離物質有一定的解吸能力（否則，不能將解吸下來，會待在原點不動），但又不能太大（否則，不被吸附，而是跟著一起跑，達不到分離的目的）；展開劑的極性應略小于被分離物質。原則：原則：展開劑對被分離物質有一定的溶解度（否則，被頂出的不溶于，就不會隨著向前移動）。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 2.展開技術展開技術: 展開劑的選擇展開劑的選擇實際操作時，可參考下列溶劑的洗脫能力順序：硅膠板上：乙腈

17、二氧六環(huán)丙酮乙酸乙酯乙醚二氯甲烷氯仿苯四氯化碳戊烷氧化鋁板上：乙酸甲醇異丙醇吡啶乙腈二甲亞砜乙酸乙酯二氧六環(huán)，丙酮二氯乙烷四氫呋喃二氯甲烷氯仿乙醚苯甲苯四氯化碳環(huán)己烷石油醚戊烷第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 2.展開技術展開技術: 展開劑的選擇展開劑的選擇說明: 實際工作中，某些溶劑的順序會有顛倒出入，所以以上順序只作參考。 實際工作中, 更常用到二元、三元混合溶劑作展開劑，這時可參考有關資料。（例如，分離氨基酸時，可找有關氨基酸分離的資料）利用資料上報導的展開劑試驗時，往往還要經(jīng)過實驗來確定合適的展開劑。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 2.展開技術展開技術: 展開方式: a. 上升法上升法:

18、適用于硬板。b. 傾斜上升法傾斜上升法:適用于軟板。c. 下降法下降法:此法受重力影響，展開速度較快，但有時前沿不整齊。d. 雙向展開雙向展開:使用方形玻板，樣品點在角上，先用一種展開劑展開，將玻板轉動90后,再用另一種展開劑展開。此法適用于較復雜的樣品。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 3. 顯色技術顯色技術: 蒸汽顯色蒸汽顯色: 碘、溴、濃氨水等，放在干燥器中; 薄板揮去展開劑，放在上述干燥器中，顯色時間與靈敏度隨化合物而異。 碘遇有機物顯黃黃棕色斑點，拿出后迅速用鉛筆畫下斑點的形狀及位置。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 3. 顯色技術顯色技術:多數(shù)有機化合物吸附碘碘蒸氣后顯示不同程度的黃褐

19、色斑點，這種反應有可逆及不可逆兩種情況。前者在離開碘蒸氣后，黃褐色斑點逐漸消退，并且不會改變化合物的性質，且靈敏度也很高，故是定位時常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸氣氧化、脫氫增強了共軛體系，因此在紫外光下可以發(fā)出強烈而穩(wěn)定的熒光，對定性及定量都非常有利。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 3. 顯色技術顯色技術: 噴霧顯色噴霧顯色: 將顯色劑(與被分離物質有顏色反應的物質)配成溶液，裝入噴霧器中，噴灑在薄板上，必要時可用熱吹風加熱。(見教材P267 表10-1 及陳耀祖書P47 附錄.顯色劑) 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應用五、應用1. 定性：定性： 以Rf值為指標。在一定條件下，各

20、種有機物的f 值是特定的常數(shù)，但“一定的條件”不易保證（如吸附劑的活性、取樣量的大小、展開槽的飽和程度、邊緣效應、薄板的厚度、展開方式等），所以最好用標準樣品做對照。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應用五、應用1. 定性：定性：應用實例：例用薄層色譜分離測定表面活性劑：第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應用五、應用1. 定性：定性：例例氨基酸的分離：試樣：天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、酪氨酸的混合物。吸附劑：硅膠(厚0.25mm).展開劑： 水：乙醇：乙酸(1 : 5 : 0.1); 苯酚:水(4 : 1) 展開距離：10厘米(約45min) 顯色：茚三酮正丁醇溶液，110加熱，天

21、冬氨酸顯紫色，其余均顯桃紅色。 根據(jù)此法可設計豬皮、羊皮、牛皮中各種氨基酸含量的分析方法。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應用五、應用1. 定性：定性：在定性方面的應用，除了鑒定示知物以外，還有下列用途在定性方面的應用，除了鑒定示知物以外，還有下列用途 檢驗藥物的純度及其中的雜質。檢驗藥物的純度及其中的雜質。將藥樣溶液點在薄板上，經(jīng)展開后，應只出現(xiàn)一個與標準樣品位置一致的斑點，若試樣出現(xiàn)另外的斑點，即表明其中有雜質存在。若事先測也顯色劑對雜質的取小檢出量，則可用薄層色譜法做雜質的限量檢查。例如，若最小檢出量為0.5g,在薄層上點樣100g后,不出現(xiàn)雜質的斑點，即說明試樣的純度不低于99.5%。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應用五、應用1. 定性：定性：控制反應進程：控制反應進程：檢查原料消耗、中間體生成、產(chǎn)物及副產(chǎn)物的生成等。柱色譜的先導。柱色譜的先導。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應用五、應用2. 定量定量 洗脫法:將斑點刮下來,用溶劑洗脫。再以或分光光度法測定，也可用其它化學分析法如容量分析法來進行測定。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應用五、應用2. 定量直接定量法：a.測面積:第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應用五、應用2. 定量定量直接定量法：直接定量法：