第二章薄層色譜

1、第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 色譜分離法是目前有機(jī)分析中使用最多，最有效的分離方法，許多化學(xué)物理性質(zhì)相似的異構(gòu)體、同系物以及多組分混合物的樣品往往難以用簡(jiǎn)單的蒸餾、精餾、萃取、重結(jié)晶、升華等簡(jiǎn)單手段分開，而用色譜方法卻能得到快速、準(zhǔn)確的分離及測(cè)定。 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 什么是色譜方法什么是色譜方法(Chtomatography)? 最初，1903年，M.C.把干燥的葉子用石油醚萃取后，將小量的萃取液傾入充填有沉降碳酸鈣的玻璃柱子的頂端，然后用石油醚淋洗，結(jié)果葉中的色素在碳酸鈣柱上互相分離，形成不同顏色的色帶，分列在柱上；隨著淋洗液的流動(dòng)，色帶的分離越加明顯。他把這種方法叫做“色譜

2、法”，色譜的英文名稱是chromatograph，它是由希臘文chromos和grapho兩字并合而成，字面上意義是顏色的記錄。 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 什么是色譜方法什么是色譜方法(Chtomatography)?第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 可以說(shuō)茨維特在色譜方面做了開創(chuàng)性的工作，但以后的二十幾年并未引起很多人的注意，直到1931年有人用充填氧化鋁粉末的柱管將性質(zhì)非常相似的-胡蘿卜素和-胡蘿卜素分離成功（在此之前，人們一直以為胡蘿卜素是一種純物質(zhì)），并且得到的純物質(zhì)可做、元素定量分析用，這才引起了許多有機(jī)化學(xué)工作者的注意，認(rèn)識(shí)到色譜法在分離混合物方面有廣闊的前景，并且研究出許多新

3、技術(shù)，例如分配色譜法、紙上色譜法、薄層色譜法、離子交換色譜法等。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 現(xiàn)在，人們所說(shuō)的“色譜”一詞的含義已經(jīng)遠(yuǎn)不是茨維特所發(fā)現(xiàn)的那種色帶，而是根據(jù)混合物中各組分在互不相溶的兩相(固定相、流動(dòng)相)中的吸附能力、分配系數(shù)或其它親合能力的差異而設(shè)計(jì)的分離分析方法，它集分離與分析于一體，快速、簡(jiǎn)便、微量，成為分離分析復(fù)雜混合物的理想方法之一。 現(xiàn)在，色譜法所涉及到的領(lǐng)域不僅限于分析化學(xué)，而且涉及到許多其它領(lǐng)域如石油化工、精細(xì)化工、近代電子技術(shù)、生命科學(xué)、食品科學(xué)、臨床分析、考古學(xué)、甚至興奮劑檢測(cè)等。 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 雖然目前在各種色譜法中茨維特所發(fā)現(xiàn)的那種色帶

4、已經(jīng)沒(méi)有普遍性，但由于這種名稱在中外已沿用很久，眾所周知，不宜更改。因此國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中仍定名為色譜法。 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 色譜分離法的種類很多，根據(jù)流動(dòng)相和固定相的特點(diǎn)，可以分為：柱色譜（columu chro.）薄層色譜（ thin layer chro.）紙色譜（ paper chro.）氣相色譜（ gas chro.）高效液相色譜（ high performance liquid chro.）凝膠滲透色譜（ gel permeation chro.）離子交換色譜（ iron exchang chro.） 這里我們主要介紹、。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 一、簡(jiǎn)介一、簡(jiǎn)介在鋪成

5、薄層的固體上進(jìn)行色譜的方法。（簡(jiǎn)述的操作及儀器）第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 優(yōu)點(diǎn)：操作容易，設(shè)備簡(jiǎn)單，易于掌握。分離迅速（需幾個(gè)小時(shí)到幾十個(gè)小時(shí)，只需十幾分 鐘到幾十分鐘）。靈敏度高（可檢測(cè)10-5g物質(zhì)）。固定相（與相比）、流動(dòng)相（與相比）、顯色劑(與PC相比）均可靈活選用。 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 優(yōu)點(diǎn)： 樣品用量可?。◣孜⒖藥资⒖耍┛纱螅◣缀量藥装俸量耍?， 可用于備色譜。特別適用于熱不穩(wěn)定及難揮發(fā)樣品。技術(shù)多樣化（如雙向展開、多次展開等），可分離復(fù)雜樣品。不存在樣品堵塞柱子而使柱效下降或柱子報(bào)廢的問(wèn)題。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 缺點(diǎn)：不適合揮發(fā)性樣品、自動(dòng)化程度低于、

6、。分離效果不及、，不能分離過(guò)于復(fù)雜的樣品。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 二、基本原理二、基本原理1.TLC分類分類按照分離過(guò)程中樣品與固定相、流動(dòng)相之間相互作用的性質(zhì)，有三種TLC： 吸附色譜： 分配色譜： 離子交換色譜： 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 吸附色譜：利用樣品中各組分對(duì)吸附劑（固定相）的吸附能力不同，將其分離。 f值大溶質(zhì)對(duì)吸附劑的吸附能力小。f值小溶質(zhì)對(duì)吸附劑的吸附能力大。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 分配色譜：利用樣品中各組分對(duì)固定液與流動(dòng)相的分配系數(shù)不同，將其分離，原則上與液液連續(xù)萃取相似。f值大溶質(zhì)易溶于流動(dòng)相，不易溶于固定相。f值小溶質(zhì)易溶于固定相，不易溶于流動(dòng)相。

7、第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 離子交換色譜：樣品中某組分與離子交換劑進(jìn)行離子交換作用。這里主要介紹吸附色譜。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 2. 2. 吸附色譜原理吸附色譜原理二、基本原理二、基本原理 吸附色譜的原理是基于樣品溶液與固定相表面發(fā)生了吸附作用。吸附有物理吸附和化學(xué)吸附之分，物理吸附的特點(diǎn)是無(wú)選擇性、吸附速度快、可逆、吸附熱小，化學(xué)吸附的特點(diǎn)是有選擇性、吸附速度慢、不可逆、吸附熱大。在吸附色譜中主要發(fā)生物理吸附。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 在吸附劑固體表面，溶質(zhì)分子（）與溶劑分子（）以占據(jù)吸附劑表面的位置可以互相競(jìng)爭(zhēng)，可以頂出，也可以頂出，這種競(jìng)爭(zhēng)可用下式表示：溶吸吸n溶 溶

8、溶液中的溶質(zhì)分子； 吸被吸在吸附劑表面的溶質(zhì)分子；溶溶液中的溶劑分子； 吸被吸在吸附劑表面的溶劑分子；n競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程中，被溶質(zhì)分子頂出來(lái)的溶劑分子的個(gè)數(shù)（假定溶質(zhì)分子體 積比溶劑分子大）。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 溶質(zhì)分子頂替溶劑分子時(shí)，過(guò)程從左向右進(jìn)行；溶劑分子頂替溶質(zhì)分子時(shí)，過(guò)程從右向左進(jìn)行； 一定條件下（如、吸附劑、），這種競(jìng)爭(zhēng)達(dá)到平衡，即、的吸附或解吸速度相等。但條件改變時(shí)，平衡就會(huì)遭到破壞，如果向上述平衡體系中加入溶劑，平衡就會(huì)向左移動(dòng)，然后達(dá)到新的平衡。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 在吸附薄層色譜中，展開劑(溶劑)是不斷供給的。所以，原點(diǎn)上與（展開劑）之間的平衡不斷遭到破壞，吸

9、附在原點(diǎn)上的溶質(zhì)不斷解吸，解吸出來(lái)的溶于中并隨之向前移動(dòng)，遇到新的吸附劑表面，與又建立起新的平衡，但又立刻遭到不斷移動(dòng)上來(lái)的展開劑（）的破壞，又有一部分解吸并隨之向前移動(dòng)。如此吸附解吸附再吸附再解吸附再吸附的交替過(guò)程就構(gòu)成了色譜法的分離基礎(chǔ)。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 吸附力弱的組分容易解吸而溶于展開劑中，并隨之向前移動(dòng)，Rf值較大；吸附力強(qiáng)的組分不易解吸，也不易隨著展開劑向前移動(dòng)，f值較小；如果樣品溶液中有兩種溶質(zhì)1、2，其極性不同，因而其吸附能力、Rf值也就不同，從而達(dá)到分離。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 3. 吸附作用強(qiáng)弱順序吸附作用強(qiáng)弱順序二、基本原理二、基本原理如何判斷各種溶質(zhì)

10、分子在吸附劑表面吸附能力的大??？當(dāng)然是考慮吸附劑與溶質(zhì)分子間作用力的大小。吸附色譜常用的吸附劑為：氧化鋁、硅膠根據(jù)活性分為五個(gè)級(jí)，一級(jí)活性最高，五級(jí)最低。氧化鋁、硅膠根據(jù)活性分為五個(gè)級(jí)，一級(jí)活性最高，五級(jí)最低。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 O 聚酰胺： C - NH - (CH2)5 吸附劑的共同特點(diǎn)是：含有帶孤對(duì)電子的氧原子、氯原子。含有-NH-、-OH-等, 易形成氫鍵。 即極性大，易成氫鍵。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 吸附劑與非極性溶質(zhì)分子間的作用力主要是誘導(dǎo)力；吸附劑與極性溶質(zhì)分子間的作用力主要是靜電力。（靜電力誘導(dǎo)力）所以，溶質(zhì)的極性越大，與吸附劑的作用力越大，即極性大的樣品與

11、固定相的親合力大。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 所以，吸附劑與被吸附物質(zhì)間的親合作用遵循下列原則：被吸附物質(zhì)的極性越大，與極性吸附劑的作用越強(qiáng)，單官能團(tuán)化合物與硅膠或氧化鋁有下列親合順序： 羧酸醇、酰胺伯胺酯、醛、酮腈、叔胺、硝基化合物醚 烯鹵烷烷烴分子中雙鍵數(shù)目越多，親合力越大；分子中苯環(huán)數(shù)目越多，親合力越大；分子中官能團(tuán)數(shù)目越多，親合力越大；（有例外：鄰硝基苯酚與硅膠、氧化鋁的親合力苯酚或硝基苯）被吸附物質(zhì)的分子量越大，親合力越大（色散力大）。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 三、儀器裝置：三、儀器裝置： 用以涂布薄層用的載板有玻璃板、鋁箔及塑料板第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 四、實(shí)驗(yàn)技

12、術(shù)四、實(shí)驗(yàn)技術(shù) 實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括：吸附劑的選擇和制備；薄板的制備；薄板的活化；點(diǎn)樣技術(shù)；展開技術(shù)；顯色技術(shù)。 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 1.吸附劑的選擇和制備：吸附劑的選擇和制備： 硅膠硅膠(Silica gel): 無(wú)定形多孔物質(zhì)，適用于酸性和中性物質(zhì)的分離。 硅膠H不含粘合劑 硅膠G含煅石膏(gypsum)做粘合劑。有時(shí)淀粉、CMC等也可用做粘合劑。 硅膠HF254含無(wú)機(jī)螢光(fluoresent)物質(zhì)，在254nm下觀察螢光。 硅膠GF254含煅石膏和無(wú)機(jī)螢光物質(zhì)。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 1.吸附劑的選擇和制備：吸附劑的選擇和制備：氧化鋁氧化鋁: 無(wú)定形多孔物質(zhì)，也有氧化鋁H、

13、氧化鋁G、氧化鋁HF、氧化鋁GF等型號(hào)，還有酸性、中性、堿性氧化鋁之分。氧化鋁一般在100-150目。 酸性氧化鋁10%HCl浸泡過(guò)夜，水洗至pH值=4，適用于酸性物質(zhì)的分離。酸性氧化鋁酸性氧化鋁適用于pH44.5的酸性有機(jī)酸類的分離。 10min (pH=4指1g Al2O3+10ml水測(cè)濾液之pH值) 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 中性氧化鋁10HCl浸泡過(guò)夜，水洗至pH值=7，適用于分離中性物質(zhì)。中性氧化鋁適用于醛、酮、醌、酯等pH約為7.5的中性物質(zhì)的分離。堿性氧化鋁水中浸泡過(guò)夜，pH10,適用于分離堿性物質(zhì)。堿性氧化鋁，適用于碳?xì)浠衔?、生物堿及堿性化合物的分離，一般適用于pH為9

14、-10的環(huán)境。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 1.吸附劑的選擇和制備：吸附劑的選擇和制備：聚酰胺： 由酰胺聚合而成的高分子，其分子內(nèi)存在著許多酰胺基，可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成氫鍵而產(chǎn)生吸附作用，根據(jù)樣品中組分的結(jié)構(gòu)不同（如能形成氫鍵基團(tuán)的數(shù)目、位置以及雙鍵和苯環(huán)數(shù)目的多少等）與聚酰胺產(chǎn)生吸附作用的強(qiáng)弱不同，從而使樣品達(dá)到分離。 O 聚酰胺： C - NH - (CH2)5 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 1.吸附劑的選擇和制備：吸附劑的選擇和制備：聚酰胺：聚酰胺可由錦綸絲制備，也可直接購(gòu)買商品薄層色譜用聚酰胺薄膜。由錦綸絲制備聚酰胺固定相有兩種方法：第二章第二章 薄層色譜薄層色譜

15、 1.吸附劑的選擇和制備：吸附劑的選擇和制備：聚酰胺：a. 冰醋酸法： 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 1.吸附劑的選擇和制備：吸附劑的選擇和制備：聚酰胺：b. 濃鹽酸法:第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 1.吸附劑的選擇和制備：吸附劑的選擇和制備：葡聚糖凝膠： 凝膠可將分子大小和形狀不同的物質(zhì)分離，好象用過(guò)篩的方法把大分子與小分子分開一樣。因此凝膠又稱為凝膠分子篩。葡聚糖凝膠是一種廣泛應(yīng)用的凝膠，它是由一定分子量的葡聚糖懸浮于有機(jī)相中，再加入交聯(lián)劑表氯醇使葡聚糖交聯(lián)聚合而成（可直接購(gòu)買商品使用）。它適用于蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)的分離和提純。可分離的分子量范圍從幾百到幾十萬(wàn)不等。 第二章第二章

16、 薄層色譜薄層色譜 2.展開技術(shù)展開技術(shù): 展開劑的選擇（技術(shù)關(guān)鍵，對(duì)分離效果影響最大展開劑的選擇（技術(shù)關(guān)鍵，對(duì)分離效果影響最大）：根據(jù)樣品的極性，溶解度以及吸附的活性等因素來(lái)選擇展開劑。原則：原則：展開劑對(duì)被分離物質(zhì)有一定的解吸能力（否則，不能將解吸下來(lái)，會(huì)待在原點(diǎn)不動(dòng)），但又不能太大（否則，不被吸附，而是跟著一起跑，達(dá)不到分離的目的）；展開劑的極性應(yīng)略小于被分離物質(zhì)。原則：原則：展開劑對(duì)被分離物質(zhì)有一定的溶解度（否則，被頂出的不溶于，就不會(huì)隨著向前移動(dòng)）。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 2.展開技術(shù)展開技術(shù): 展開劑的選擇展開劑的選擇實(shí)際操作時(shí)，可參考下列溶劑的洗脫能力順序：硅膠板上：乙腈

17、二氧六環(huán)丙酮乙酸乙酯乙醚二氯甲烷氯仿苯四氯化碳戊烷氧化鋁板上：乙酸甲醇異丙醇吡啶乙腈二甲亞砜乙酸乙酯二氧六環(huán)，丙酮二氯乙烷四氫呋喃二氯甲烷氯仿乙醚苯甲苯四氯化碳環(huán)己烷石油醚戊烷第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 2.展開技術(shù)展開技術(shù): 展開劑的選擇展開劑的選擇說(shuō)明: 實(shí)際工作中，某些溶劑的順序會(huì)有顛倒出入，所以以上順序只作參考。 實(shí)際工作中, 更常用到二元、三元混合溶劑作展開劑，這時(shí)可參考有關(guān)資料。（例如，分離氨基酸時(shí)，可找有關(guān)氨基酸分離的資料）利用資料上報(bào)導(dǎo)的展開劑試驗(yàn)時(shí)，往往還要經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定合適的展開劑。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 2.展開技術(shù)展開技術(shù): 展開方式: a. 上升法上升法:

18、適用于硬板。b. 傾斜上升法傾斜上升法:適用于軟板。c. 下降法下降法:此法受重力影響，展開速度較快，但有時(shí)前沿不整齊。d. 雙向展開雙向展開:使用方形玻板，樣品點(diǎn)在角上，先用一種展開劑展開，將玻板轉(zhuǎn)動(dòng)90后,再用另一種展開劑展開。此法適用于較復(fù)雜的樣品。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 3. 顯色技術(shù)顯色技術(shù): 蒸汽顯色蒸汽顯色: 碘、溴、濃氨水等，放在干燥器中; 薄板揮去展開劑，放在上述干燥器中，顯色時(shí)間與靈敏度隨化合物而異。 碘遇有機(jī)物顯黃黃棕色斑點(diǎn)，拿出后迅速用鉛筆畫下斑點(diǎn)的形狀及位置。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 3. 顯色技術(shù)顯色技術(shù):多數(shù)有機(jī)化合物吸附碘碘蒸氣后顯示不同程度的黃褐

19、色斑點(diǎn)，這種反應(yīng)有可逆及不可逆兩種情況。前者在離開碘蒸氣后，黃褐色斑點(diǎn)逐漸消退，并且不會(huì)改變化合物的性質(zhì)，且靈敏度也很高，故是定位時(shí)常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸氣氧化、脫氫增強(qiáng)了共軛體系，因此在紫外光下可以發(fā)出強(qiáng)烈而穩(wěn)定的熒光，對(duì)定性及定量都非常有利。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 3. 顯色技術(shù)顯色技術(shù): 噴霧顯色噴霧顯色: 將顯色劑(與被分離物質(zhì)有顏色反應(yīng)的物質(zhì))配成溶液，裝入噴霧器中，噴灑在薄板上，必要時(shí)可用熱吹風(fēng)加熱。(見教材P267 表10-1 及陳耀祖書P47 附錄.顯色劑) 第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應(yīng)用五、應(yīng)用1. 定性：定性： 以Rf值為指標(biāo)。在一定條件下，各

20、種有機(jī)物的f 值是特定的常數(shù)，但“一定的條件”不易保證（如吸附劑的活性、取樣量的大小、展開槽的飽和程度、邊緣效應(yīng)、薄板的厚度、展開方式等），所以最好用標(biāo)準(zhǔn)樣品做對(duì)照。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應(yīng)用五、應(yīng)用1. 定性：定性：應(yīng)用實(shí)例：例用薄層色譜分離測(cè)定表面活性劑：第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應(yīng)用五、應(yīng)用1. 定性：定性：例例氨基酸的分離：試樣：天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、酪氨酸的混合物。吸附劑：硅膠(厚0.25mm).展開劑： 水：乙醇：乙酸(1 : 5 : 0.1); 苯酚:水(4 : 1) 展開距離：10厘米(約45min) 顯色：茚三酮正丁醇溶液，110加熱，天

21、冬氨酸顯紫色，其余均顯桃紅色。 根據(jù)此法可設(shè)計(jì)豬皮、羊皮、牛皮中各種氨基酸含量的分析方法。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應(yīng)用五、應(yīng)用1. 定性：定性：在定性方面的應(yīng)用，除了鑒定示知物以外，還有下列用途在定性方面的應(yīng)用，除了鑒定示知物以外，還有下列用途 檢驗(yàn)藥物的純度及其中的雜質(zhì)。檢驗(yàn)藥物的純度及其中的雜質(zhì)。將藥樣溶液點(diǎn)在薄板上，經(jīng)展開后，應(yīng)只出現(xiàn)一個(gè)與標(biāo)準(zhǔn)樣品位置一致的斑點(diǎn)，若試樣出現(xiàn)另外的斑點(diǎn)，即表明其中有雜質(zhì)存在。若事先測(cè)也顯色劑對(duì)雜質(zhì)的取小檢出量，則可用薄層色譜法做雜質(zhì)的限量檢查。例如，若最小檢出量為0.5g,在薄層上點(diǎn)樣100g后,不出現(xiàn)雜質(zhì)的斑點(diǎn)，即說(shuō)明試樣的純度不低于99.5%。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應(yīng)用五、應(yīng)用1. 定性：定性：控制反應(yīng)進(jìn)程：控制反應(yīng)進(jìn)程：檢查原料消耗、中間體生成、產(chǎn)物及副產(chǎn)物的生成等。柱色譜的先導(dǎo)。柱色譜的先導(dǎo)。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應(yīng)用五、應(yīng)用2. 定量定量 洗脫法:將斑點(diǎn)刮下來(lái),用溶劑洗脫。再以或分光光度法測(cè)定，也可用其它化學(xué)分析法如容量分析法來(lái)進(jìn)行測(cè)定。第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應(yīng)用五、應(yīng)用2. 定量直接定量法：a.測(cè)面積:第二章第二章 薄層色譜薄層色譜 五、應(yīng)用五、應(yīng)用2. 定量定量直接定量法：直接定量法：