植物細(xì)胞制藥三ppt課件

1、 20世紀(jì)90年代以來(lái)，對(duì)于植物細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物的研討進(jìn)入了新的開展時(shí)期，并出現(xiàn)了很多新技術(shù)和新方法，比如誘導(dǎo)子、前體豢養(yǎng)、兩相培育法、質(zhì)體轉(zhuǎn)化、毛狀根和冠癭瘤組織培育等，顯示了植物細(xì)胞培育工程制藥的寬廣開展前景。第七節(jié) 進(jìn)展與展望一、誘導(dǎo)子在植物細(xì)胞工程研討中的運(yùn)用利用誘導(dǎo)子進(jìn)展有目的的次生代謝產(chǎn)物調(diào)控及生物合成，成為大幅度提高培育物中代謝產(chǎn)物含量的重要方法之一。誘導(dǎo)子elicitor，是植物抗病生理過(guò)程中誘發(fā)植物產(chǎn)生植物抗毒素和引起植物過(guò)敏反響hypersensitive reaction, HR, 亦稱抗性反響或本身防御反響的因子，包括侵染植物的微生物及植物細(xì)胞內(nèi)的分子。 誘導(dǎo)子在植物與

2、微生物的相互作用中，能快速、高度專注性地誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)。 誘導(dǎo)子可作為研討植物次生代謝信號(hào)識(shí)別及其細(xì)胞內(nèi)信息傳送的良好實(shí)驗(yàn)體系。懸浮培育的西洋參細(xì)胞經(jīng)刺盤孢菌絲狀誘導(dǎo)子處置后，懸浮培育的西洋參細(xì)胞經(jīng)刺盤孢菌絲狀誘導(dǎo)子處置后，總皂甙產(chǎn)率由對(duì)照的總皂甙產(chǎn)率由對(duì)照的296mg/L296mg/L增長(zhǎng)到了增長(zhǎng)到了679mg/L679mg/L，并且，并且有有85%85%排放到了培育基中。排放到了培育基中。將果膠酶將果膠酶0.2%0.2%添加到青蒿素合成培育基中，處置黃添加到青蒿素合成培育基中，處置黃花蒿培育細(xì)胞花蒿培育細(xì)胞2 2天，青蒿素合成量比未加刺激的細(xì)胞提天，青蒿素合成量比未加刺激的細(xì)胞提高了高

3、了3.083.08倍。倍。真菌寡聚糖誘導(dǎo)子作為信號(hào)分子在南方紅豆杉細(xì)胞懸浮真菌寡聚糖誘導(dǎo)子作為信號(hào)分子在南方紅豆杉細(xì)胞懸浮培育體系中培育體系中 培育基中添加適量、適濃度培育基中添加適量、適濃度CuCl2CuCl2可以誘導(dǎo)紫杉醇的合可以誘導(dǎo)紫杉醇的合成，成，0.5-30vmol/L0.5-30vmol/L范圍內(nèi)，紫杉醇范圍內(nèi)，紫杉醇 含量隨含量隨CuCl2CuCl2濃度添濃度添加而添加，而低于加而添加，而低于0.5vmol/L0.5vmol/L時(shí)紫杉醇合成為零時(shí)紫杉醇合成為零1.誘導(dǎo)子的分類1定義植物抗毒素是指在植物防御系統(tǒng)內(nèi)能對(duì)抗微生物進(jìn)攻的某些次級(jí)代謝產(chǎn)物，根據(jù)其功能又可稱為后感染防御物質(zhì)。

4、觸發(fā)構(gòu)成植物抗毒素信號(hào)的物質(zhì)稱為誘導(dǎo)子，可以誘導(dǎo)植物細(xì)胞中的一個(gè)或幾個(gè)反響，并能構(gòu)成特征性本身防御反響的分子。 誘導(dǎo)子可分為內(nèi)源性誘導(dǎo)子和外源性誘導(dǎo)子根據(jù)細(xì)胞內(nèi)或外構(gòu)成，或分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子。生物誘導(dǎo)子是指植物在防御過(guò)程中為對(duì)抗微生物感染而產(chǎn)生的物質(zhì)。一切不是植物細(xì)胞中天然成分但又能觸發(fā)形植物抗毒素信號(hào)的因子稱為非生物誘導(dǎo)子。2內(nèi)源性誘導(dǎo)子內(nèi)源性誘導(dǎo)子主要指來(lái)自植物細(xì)胞的分子，多為植物細(xì)胞壁在微生物作用下的降解產(chǎn)物如復(fù)雜多糖、糖蛋白及堆積在細(xì)胞壁上的木質(zhì)素。多糖類又分為纖維素、半纖維素及果膠類。3外源性誘導(dǎo)子外源性誘導(dǎo)子亦稱真誘導(dǎo)子genuine elicitor，是指病源微生物在入

5、侵植物時(shí)本身被降解的產(chǎn)物及其代謝產(chǎn)物。目前運(yùn)用最多的是真菌誘導(dǎo)子，根據(jù)其構(gòu)造可分為4類。多糖類脫乙酰幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁被幾丁質(zhì)酶酶解的產(chǎn)物，是廣泛運(yùn)用的多糖類誘導(dǎo)子，它可誘導(dǎo)植保素的產(chǎn)生。木質(zhì)素類及蛋白酶抑制劑，如大雄疫霉Phytophthora megasperma是由大雄疫霉細(xì)胞壁分別得到的多糖類誘導(dǎo)子，也是最常用的誘導(dǎo)子之一。 糖蛋白類作為微生物細(xì)胞壁組成成分之一的糖蛋白類，可誘導(dǎo)引發(fā)防御反響。如在Lucene懸浮培育細(xì)胞中參與來(lái)源于植物病原性真菌的和-糖蛋白可產(chǎn)生具抗菌作用的次生代謝產(chǎn)物。 蛋白質(zhì)類包括一些酶類及具蛋白性質(zhì)的物質(zhì)如綠色木霉中的纖維素酶作為誘導(dǎo)子在Grapnine真誘導(dǎo)子

6、的懸浮培育中可引起HR反響，另一來(lái)源于隱地疫霉的具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的誘導(dǎo)子亦能誘導(dǎo)HR反響并大量積累植保素cryptogeion。 不飽和脂肪酸類不飽和脂肪酸類作為一種誘導(dǎo)抗性反響的誘導(dǎo)子，對(duì)其研討不是很充分，但已發(fā)現(xiàn)多聚不飽和脂肪酸花生四烯酸及其部分酯類可誘導(dǎo)馬鈴薯植保素risnitin和lubimin的產(chǎn)生。2.誘導(dǎo)子的作用機(jī)制 誘導(dǎo)子在植物中的詳細(xì)作用機(jī)制尚未構(gòu)成一套詳盡的實(shí)際體系。 非生物誘導(dǎo)子外部培育條件協(xié)同誘導(dǎo)可添加特征酶群活性。 生物誘導(dǎo)子除引起植物在其部分浸染部位做出迅速的過(guò)敏反響外，還誘導(dǎo)植物產(chǎn)生植保素，使植物得以免遭病原微生物的侵染和破壞。在此激活過(guò)程中，誘導(dǎo)子與細(xì)胞膜上受體的

7、結(jié)合，改動(dòng)了膜離子通道，促使誘導(dǎo)過(guò)程迅速完成。 不同的誘導(dǎo)子可經(jīng)過(guò)植物外表的不同部位而起作用，也是激活反響中有關(guān)基因的表現(xiàn)。3.誘導(dǎo)子在組織和細(xì)胞培育及其次生代謝產(chǎn)物生合成研討中的運(yùn)用 將誘導(dǎo)子運(yùn)用于植物細(xì)胞培育中以提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量，這些誘導(dǎo)子包括： 1糖蛋白類誘導(dǎo)子：如在培育基中參與糖基化的氧化牛血潔白蛋白BSA和氧化溶菌酶可使煙草葉產(chǎn)生抗原性尼克堿次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量添加10倍。 2蛋白質(zhì)類誘導(dǎo)子：運(yùn)用果膠酶及鏈狀蛋白酶作為誘導(dǎo)子來(lái)調(diào)理煙草細(xì)胞培育中酪胺代途徑中某些的酶的活性。 3多糖類誘導(dǎo)子：用不同的誘導(dǎo)子，如鐮刀霉菌絲體、乙烯、水楊酸、幾丁質(zhì)和脫乙酰幾丁質(zhì)及其低聚糖，分別作用于多種模型植

8、物上，結(jié)果闡明用植物病原體鐮刀酶感染植株可誘導(dǎo)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶及其同工酶，并表達(dá)了強(qiáng)效抗病原體的細(xì)胞溶解活性，闡明植物可識(shí)別病原體并可被誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病原體的幾丁質(zhì)酶。天然多糖如幾丁質(zhì)、脫乙酰幾丁質(zhì)及其低聚糖也具有強(qiáng)效細(xì)胞溶解活性的幾丁質(zhì)酶及其同工酶的各種功能。另外，多糖類誘導(dǎo)子除誘導(dǎo)改善植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量外，還可經(jīng)過(guò)多糖的膠化性質(zhì)改動(dòng)植物細(xì)胞膜的通透性及流動(dòng)性。4微生物類誘導(dǎo)子：通常是真菌誘導(dǎo)子，方法是將其懸浮培育的菌球勻漿處置，再將漿液高壓滅菌處置，棄去殘?jiān)锰崛∥锘驘o(wú)菌真菌菌絲體粗提物.在無(wú)菌條件下將勻化產(chǎn)物參與到來(lái)源于不同組織、器官的細(xì)胞懸浮培育物中，同時(shí)作出作用時(shí)間曲線。 在紫杉屬植物

9、細(xì)胞培育物中為提高紫杉醇、紫杉?jí)A的產(chǎn)量而向培育基中添加的誘導(dǎo)子為灰黃霉素、灰葡萄孢、大麗輪枝孢和融黏帶酶的混合培育濾液，還有人用葡萄孢屬的無(wú)菌菌絲體勻化產(chǎn)物誘導(dǎo)處置罌粟細(xì)胞培育物來(lái)積累血根堿。 不同誘導(dǎo)子作用于不同植物可以產(chǎn)生多種多樣的次生代謝產(chǎn)物，可見從植物抗病生理角度來(lái)看，這些次生代謝產(chǎn)物多為植保素(植物抗病物質(zhì))，而在人類生活中，這些代謝產(chǎn)物也多為有益于人類安康的活性成分. 另一方面，誘導(dǎo)子運(yùn)用于植物組織培育中亦存在一些問(wèn)題。如內(nèi)源性誘導(dǎo)子及酵母提取物是無(wú)毒的，而來(lái)源于真菌的誘導(dǎo)子多有很強(qiáng)的毒性.隨著植保素的誘導(dǎo)合成，植物病原性真菌也誘導(dǎo)了一個(gè)過(guò)敏反響，就是病毒與宿主細(xì)胞相互作用部位細(xì)胞

10、的壞死，從而使細(xì)胞生長(zhǎng)率下降，并能夠影響次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。 降低誘導(dǎo)子濃度可以減少生長(zhǎng)的停頓形狀，然而在誘導(dǎo)子作用下構(gòu)成次生代謝產(chǎn)物的過(guò)程中，低濃度的誘導(dǎo)子只能引起部分誘導(dǎo)，所以誘導(dǎo)的劑量不同，引起的效應(yīng)也不同。誘導(dǎo)子在不同的作用時(shí)間都將在一定程度上影響次生代謝產(chǎn)物的含量，如桔青霉誘導(dǎo)子對(duì)紅豆杉培育細(xì)胞中紫杉醇生合成的影響實(shí)驗(yàn)顯示，在紅豆杉細(xì)胞中指數(shù)生長(zhǎng)期末期時(shí)參與誘導(dǎo)子，對(duì)紫杉醇合成的促進(jìn)作用最大。 對(duì)于影響植物細(xì)胞培育物的生物量的增長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的積累要素的變化，可因某一要素的調(diào)整而影響其他要素，所以在培育過(guò)程中要不斷的加以平衡和研討。 植物具有其本身的特殊性，因此對(duì)一種植物細(xì)胞或一種

11、次生代謝產(chǎn)物適宜的條件不一定適宜于其它的次生代謝產(chǎn)物和細(xì)胞。 誘導(dǎo)子在植物細(xì)胞培育物中對(duì)次生代謝產(chǎn)物的作用還有待于更進(jìn)一步的系統(tǒng)研討。二、前體飼喂 前體飼喂是添加次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)率的重要方法。 次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成依賴于三種主要原資料的供應(yīng)：莽草酸是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前體；氨基酸，構(gòu)成生物堿及肽類抗生素；乙酸是聚乙炔類、前列腺素類、大環(huán)抗生素、多酚類、類異戊二烯等的前體。 根本出發(fā)點(diǎn)是在細(xì)胞外發(fā)明一個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物的儲(chǔ)存單元。在培育時(shí)可入固相或疏水液相，構(gòu)成相培育系統(tǒng)，從而到達(dá)搜集分泌物的目的。 該法可以減輕產(chǎn)物本身對(duì)細(xì)胞代謝的抑制造用，并可維護(hù)產(chǎn)物免受培育基中催化酶或酸的影響?？?/p>

12、簡(jiǎn)化下游處置過(guò)程，降低消費(fèi)本錢。 兩相培育系統(tǒng)需滿足以下條件：添加的固相或液相對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用，不影響細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成；產(chǎn)物易被固相吸附或被有機(jī)相溶解；兩相易分別；如為固相不吸附培育基中的添加成分 (植物生長(zhǎng)調(diào)理劑或有機(jī)成分)。三、兩相法培育two-phase culture 四、轉(zhuǎn)根本技術(shù)在次級(jí)代謝產(chǎn)物消費(fèi)中的運(yùn)用v冠癭組織和毛狀根培育技術(shù)冠癭組織是植物受發(fā)根農(nóng)桿菌和根癭農(nóng)桿菌感染后，農(nóng)桿菌將質(zhì)粒中的一段轉(zhuǎn)移DNA片段整合到植物細(xì)胞核的DNA編碼基因上，從而作為表現(xiàn)型在感染處長(zhǎng)出的冠癭瘤/毛狀根。將冠癭瘤/毛狀根作為培育系統(tǒng)，可進(jìn)展有用化合物的消費(fèi)。速度快。速度快。五、植物生物轉(zhuǎn)化技術(shù)與生

13、物制藥 利用植物細(xì)胞培育以及植物酶對(duì)外源底物進(jìn)展生物轉(zhuǎn)化，從而得到人們想要的目的化合物，稱為植物生物轉(zhuǎn)化技術(shù)。 許多利用植物細(xì)胞和酶系統(tǒng)進(jìn)展的生物轉(zhuǎn)化具有部位以及立體特異性，其反響類型包括氧化反響、復(fù)原反響、羥化反響、甲基化反響、乙酰化反響、異構(gòu)反響、糖基化反響以及酯化反響等。 生物轉(zhuǎn)化biotransformation,bioconversion，也稱生物催化biocatalysis，是指利用生物離體培育細(xì)胞或器官及細(xì)胞器等對(duì)外源化合物進(jìn)展構(gòu)造修飾而獲得有價(jià)值產(chǎn)物的生理生化反響，其本質(zhì)是利用生物體系本身所產(chǎn)生的酶對(duì)外源化合物進(jìn)展酶催化反響。 具有反響選擇性強(qiáng)立體選擇性、位置選擇性、反響條件溫

14、暖、副產(chǎn)物少、不呵斥環(huán)境污染和后處置簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，并且可以進(jìn)展傳統(tǒng)有機(jī)合成不能或很難進(jìn)展的化學(xué)反響。1.概述作為生物催化劑，植物細(xì)胞培育具有以下優(yōu)點(diǎn)：可以在實(shí)驗(yàn)室中生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好細(xì)胞可以無(wú)限制的生長(zhǎng)，培育物可以大量累積生長(zhǎng)循環(huán)周期短利用催生物及其產(chǎn)生的酶進(jìn)展生物轉(zhuǎn)化，所具有的的優(yōu)點(diǎn)是生物量倍增時(shí)間短，微生物的基因操作方法已廣泛建立。而植物生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)與之相比，生物量倍增時(shí)間較長(zhǎng)，產(chǎn)生酶的種類較少且酶量低微。但植物生物轉(zhuǎn)化還是有它獨(dú)特之處：植物中具有許多微生物中不存在的獨(dú)特的酶。 利用植物進(jìn)展生物轉(zhuǎn)化的化合物可以是植物在其代謝過(guò)程中產(chǎn)生的中間體，也可以是人工合成的化合物。 植物生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以

15、與有機(jī)合成結(jié)合運(yùn)用，相得益彰。 植物細(xì)胞培育具有宏大的產(chǎn)生特定次生代謝產(chǎn)物的潛力，在某些細(xì)胞培育物中，雖然不能完成一些重要的次生代謝產(chǎn)物的構(gòu)成和累積，但保管了將外源底物轉(zhuǎn)化為有用產(chǎn)物的才干。 生物轉(zhuǎn)化既可產(chǎn)生新的化合物，又可改造已有的化合物、添加目的產(chǎn)物的產(chǎn)量以及抑制化學(xué)合成的缺陷，而且可經(jīng)過(guò)中間代謝產(chǎn)物的研討闡明化合物的生物合成途徑。 許多要素都能影響植物細(xì)胞和器官培育物進(jìn)展的生物轉(zhuǎn)化，例如，前體物的溶解性、細(xì)胞的通透性、有活性的酶量、酶的存在位置、副反響的存在、參與降解目的產(chǎn)物的酶量、誘導(dǎo)作用、pH變化以及浸透作用等。 經(jīng)過(guò)引入環(huán)糊精可以使某些難溶或不溶于水的物質(zhì)改良水溶性，使之更容易進(jìn)展

16、生物轉(zhuǎn)化。 運(yùn)用有機(jī)溶劑如異丙醇、二甲亞砜和多糖都能夠增大細(xì)胞的通透性，從而促進(jìn)底物攝取及產(chǎn)物釋放，此外還有超聲波降解法、電極法和電泳釋放以及高電場(chǎng)脈沖和超高壓等。2.植物細(xì)胞和器官培育物的生物轉(zhuǎn)化 植物細(xì)胞培育和毛狀根培育所進(jìn)展的生物轉(zhuǎn)化為具有治療活性的化合物的構(gòu)造改造提供了一個(gè)重要工具。 但是懸浮培育的最大缺陷就是體細(xì)胞克隆不穩(wěn)定，利用組織進(jìn)展培育時(shí)也存在這一問(wèn)題。 而毛狀根培育那么屬于器官培育，具有分化性，其遺傳穩(wěn)定性培育，因此代謝產(chǎn)量也非常穩(wěn)定。 許多要素會(huì)影響毛狀根的藥用次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，例如營(yíng)養(yǎng)成分、誘導(dǎo)子、產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化的前體以及對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的遺傳改造等。經(jīng)過(guò)植物細(xì)胞培育

17、物進(jìn)展生物轉(zhuǎn)化，是一種可以對(duì)分子進(jìn)展構(gòu)造修飾而使其成為活性化合物的工具。一些比較重要的生物轉(zhuǎn)化類型有：羥基化；糖基化；醇和酮的氧化復(fù)原反響；水解反響；環(huán)氧化作用；羰基復(fù)原反響；碳-碳雙鍵的復(fù)原反響；硝基復(fù)原反響等。 細(xì)胞培育產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的方法的改良通常與植物細(xì)胞的器官化和分化有關(guān)，而器官化和分化的實(shí)際那么是固定化技術(shù)運(yùn)用的根底。 利用固定化細(xì)胞培育進(jìn)展生物轉(zhuǎn)化外源底物，具有突出優(yōu)勢(shì)：細(xì)胞抗剪切才干加強(qiáng)；可以長(zhǎng)期反復(fù)運(yùn)用；能夠產(chǎn)生較多的生物資料，從而轉(zhuǎn)化更多底物；細(xì)胞的恢復(fù)更容易；產(chǎn)品后期化學(xué)處置更容易。3.利用固定化細(xì)胞培育進(jìn)展生物轉(zhuǎn)化 固定酶系統(tǒng)具有一定的局限制：被分別的酶在極限pH、加

18、熱和參與特定有機(jī)溶劑時(shí)很容易引起變性，在分別酶的過(guò)程中酶的活性會(huì)有損失，經(jīng)常運(yùn)用于單步反響中。 而固定化植物細(xì)胞培育與固定酶系統(tǒng)相比，比起固定酶系統(tǒng)而言，作為生物催化劑更具獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)?？蓪?shí)行多步酶反響；選擇高效生物合成細(xì)胞，其催化活性也可添加；不需提供輔因子；更容易操作。全細(xì)胞固定化培育還可以發(fā)明一種類似全植物的有機(jī)組織的微環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞分化并且產(chǎn)生較多的次生代謝產(chǎn)物。4.基因工程方法在生物轉(zhuǎn)化中的運(yùn)用 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)運(yùn)用于生物轉(zhuǎn)化的方法：將編碼催化生物合成反響的關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)入到真菌或細(xì)菌細(xì)胞中去增殖，然后再把這個(gè)克隆的基因轉(zhuǎn)入到植物當(dāng)中，并在其中表達(dá)。 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以有效地產(chǎn)生和改造現(xiàn)有

19、的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，而且有利于研討基因功能和生理性調(diào)理及其開展過(guò)程。5.利用植物酶進(jìn)展生物轉(zhuǎn)化利用從植物中分別出來(lái)的以自在或固定形狀存在的酶，也可以催化一些重要的反響，進(jìn)展生物轉(zhuǎn)化。木瓜蛋白酶氧腈酶環(huán)化酶酚氧化酶鹵化過(guò)氧化酶脂氧酶細(xì)胞色素P450單氧化酶。1. Callus culture - creation of genetic variants via somaclonal variation and/or in vitro selection - elimination of pathogens esp. viruses - gene transfer (eg via Agrobacter

20、ium, microprojectiles2. Meristem culture- clonal propagation- elimination of pathogens- germplasm collection and long-term storage (eg cryopreservation)Vi rus el i m i nat i onw hy does t he m eri st em have l ow / no vi rus t i t re? vi rus spreads pri m ari l y t hrough vascul ar syst em -t hi s i

21、 s not devel oped i n t he m eri st em m i t osi s and chrom osom e repl i cat i on com pet e w i t h vi rus repl i cat i on hi gh auxi n i n m eri st em i nhi bi t s vi rus repl i cat i on a vi rus “ i nact i vat i ng” syst em has great est act i vi t y i n m eri st emTobacco m eri st emvi rus-f reet i ssuevi rus part i cl esf ound hereVirus elimination5. Protoplast culture- gene transfer- creating wide hybrids via somatic hybridization Plant protoplasts植物細(xì)胞制藥實(shí)例植物細(xì)胞制藥實(shí)例西洋參細(xì)胞培育西洋參細(xì)胞培育 西洋參屬于五加科人參屬植物，為名貴中藥材之一，西洋參屬于五加科人參屬植物，為名貴中藥材之一，具有降血脂、鎮(zhèn)靜、造血及健胃作用