逆境生理指標(biāo)的測定

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上逆境生理指標(biāo)的測定要求：選三個指標(biāo)一、植物組織中超氧物歧化酶活性的測定催化下列反應(yīng)： 2 +2H+ H2O2 + O2反應(yīng)產(chǎn)物H2O2可被過氧化氫酶進一步分解或被過氧化物酶利用。因此SOD有保護生物體免受活性氧傷害的能力。已知此酶活力與植物抗逆性及衰老有密切關(guān)系，故成為植物逆境生理學(xué)的重要研究對象。原理本實驗依據(jù)超氧化物歧化酶抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有可被氧化物質(zhì)存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產(chǎn)生 ， 可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的化合物，藍(lán)色化合物在560nm處有最大吸收，而SOD可清除 從而抑制了藍(lán)色化

2、合物的形成。因此光還原反應(yīng)后，反應(yīng)液藍(lán)色愈深說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據(jù)此可以計算出酶活性大小。試劑0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）；130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱1.9399g Met用磷酸緩沖液定容至100ml；750mol/L氮藍(lán)四唑溶液：稱取0.06133g NBT用磷酸緩沖液定容至100ml避光保存；100mol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至100ml；20mol/L核黃素溶液：取0.00753g核黃素用磷酸緩沖液定容至1000ml避光保存(當(dāng)天配制)。方法1、酶液提取 取一定部位的植物葉片（視需要定，

3、去葉脈）0.5g于預(yù)冷的研缽中，加1ml磷酸緩沖液在冰浴下研磨成漿，加緩沖液使終體積為5ml。取23ml于10000rpm下離心10分鐘，上清液即為SOD粗提液。2、顯色反應(yīng) 取5ml試管（或指形管，要求透明度好）7支，3支試管為測定管，另4支為對照管，按表1加入各溶液?；靹蚝髮?支對照管置暗處，其他各管置于4000lx日光燈下反應(yīng)20min（要求各管受光情況一致，反應(yīng)室的溫度高時反應(yīng)時間可以縮短，溫度低時反應(yīng)時間可適當(dāng)延長(溫度范圍3037)。表1 各溶液加入量試 劑（酶）用量(ml)終濃度（比色時）0.05mol/L磷酸緩沖液130mmol/L Met溶液750mol/L NBT溶液100

4、mol/L EDTA-Na2液20mol/L核黃素酶液蒸餾水1.50.30.30.30.30.10.213mmol75mol10mol2.0mol對照管加緩沖液代替酶液總體積3.03、蛋白濃度的計算 蛋白濃度 單位：mg蛋白/g樣重 c通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的每管中蛋白含量（mg） v樣液總體積（ml） a測定時提取液體積用量（ml） W樣重（g）4、SOD活性測定與計算 至反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的對照管作空白，在560nm下分別測定其它各管的光密度值，SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位表示。按下式計算SOD活性。 SOD總活性 = 單位：酶單位/g鮮重表示；Ack照光對照管的

5、光密度值； AE樣品管的光密度值；V樣液總體積（ml）； a測定時樣品用量（ml）； W樣重（g）；二、氧自由基的測定原理：與羥胺反應(yīng)生成NO2- ，NO2-在對氨基苯磺酸和-萘胺作用下，生成粉紅色的偶氮染料，染料在530nm有顯著吸收，根據(jù)OD530可以算出樣品中的 含量。步驟：1、酶液提取 取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于預(yù)冷的研缽中，加1ml磷酸緩沖液在冰浴下研磨成漿，加緩沖液使終體積為5ml。取23ml于10000rpm下離心10分鐘，上清液即為SOD粗提液。2亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：1ml系列濃度的NaNO2(0、5、10、15、20、30、40和50mmol

6、60;/L)分別加入l m1對氨基苯磺酸和lml-萘胺，于25中保溫20min，然后測定OD550，以NO2-和測得的OD530值互為函數(shù)作圖，制得亞硝酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線。3 O2-含量測定：0.5m1樣品提取液中加入0.5m150mmo1/L磷酸緩沖液(pH7.8)，1m1的1mmo1L鹽酸羥胺，搖勻，于25中保溫l h，然后再加人l m117mmo1/L對氨基苯磺酸(以冰醋酸：水3：1配制)和1m17mmol/L-萘胺(以冰醋酸：水3：1配制)，混合，于25中保溫20min，取出以分光光度計測定波長530nm的OD值。    根據(jù)測得的OD530，查NO2標(biāo)準(zhǔn)曲線，

7、將OD530換算成NO2-，然后依照羥胺與的反應(yīng)式：NH2OH十2O2十H+   NO2-十H2O2十H2O從NO2-對O2進行化學(xué)計量，即將  NO2-乘以2，得到O2根據(jù)記錄樣品與羥胺反應(yīng)的時間和樣品中的蛋白質(zhì)含量，可求得產(chǎn)生速率(nmo1min-1mg-1蛋白)。三、植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測定植物在正常條件下，游離脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低溫、鹽堿等逆境時，游離脯氨酸便會大量積累，并且積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。因此，脯氨酸可作為植物抗逆性的一項生化指標(biāo)。原理采用磺基水楊酸提取植物體內(nèi)的游離脯氨酸，不僅大大減小了其他氨基酸的干擾，快速簡便，而且不受樣品

8、狀態(tài)（干或鮮樣）限制。在酸性條件下，脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色縮合物，用甲苯萃取后，此縮合物在波長520nm處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度的高低在一定范圍內(nèi)與其光密度成正比。試劑3%磺基水楊酸水溶液；甲苯；2.5%酸性茚三酮顯色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3:2混合，作為溶劑進行配制，此液在4下23d有效；脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取25mg脯氨酸，蒸餾水溶解后定容至250ml，其濃度為100g/ml。再取此液10ml用蒸餾水稀釋至100ml，即成10g/ml的脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。方法1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 （1）取7支具塞刻度試管按表1加入各試劑?；靹蚝蠹硬Ａ蛉诜兴屑訜?0min。（2）取出、冷卻后

9、向各管加入5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層以“0”管為對照在波長520nm下比色。表1 各試管中試劑加入量管 號0123456標(biāo)準(zhǔn)脯氨酸量(ml)00.20.40.81.21.62.0H2O(ml)2.01.81.61.20.80.40冰乙酸(ml)2.02.02.02.02.02.02.0顯色液(ml)3.03.03.03.03.03.03.0脯氨酸含量(g)0248121620（3）以光密度值為縱坐標(biāo)，脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性回歸方程。2樣品測定 （1）脯氨酸提取 取不同處理的剪碎混勻葉片0.20.5g（干樣根據(jù)水分含量酌減），分別置于大試管中，加

10、入5ml 3%磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球塞，于沸水浴中浸提10min。（2）取出試管，待冷卻至室溫后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml顯色液，于沸水浴中加熱40min。（3）取出冷卻后向各管加入5ml甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層，以空白管為對照，在波長520nm下比色測定。（4）結(jié)果計算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出測定液中脯氨酸濃度，按下式計算樣品中脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)： 脯氨酸（g/g FW或DW）=(C×V/a)/W 式中 C提取液中脯氨酸含量（g），由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得； V提取液總體積（ml）； a測定時所吸取提取液的體積（ml）； W樣品重（g）。注意事項

11、: 樣品測定時若氣溫較低,萃取物分層不清晰,可將試管置于40左右的水浴中快速測定?；蜻^夜靜置。四、植物組織中丙二醛含量的測定植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反應(yīng)植物遭受逆境傷害的程度。原理丙二醛（MDA）是常用的膜脂過氧化指標(biāo)，在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成紅棕色的三甲川（3,5,5-三甲基惡唑-2,4-二酮），其最大吸收波長在532nm。但是測定植物組織中MDA時受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長在450nm，532nm處也有吸收。植物遭受干旱

12、、高溫、低溫等逆境脅迫時可溶性糖增加，因此測定植物組織中MDA-TBA反應(yīng)物質(zhì)含量時一定要排除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能夠顯著增加TBA與蔗糖或MDA顯色反應(yīng)物在532、450nm處的光密度值，所以在蔗糖、MDA與TBA顯色反應(yīng)中需一定量的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為100300g/g DW，根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3的終濃度為0.5mol/L。雙組分分光光度計法 根據(jù)朗伯-比爾定律：DkCL，當(dāng)液層厚度為1cm時，k=D/C，k稱為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。當(dāng)某一溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)時，某一波長下的光密度值等于此混合液在該波長下各顯色物質(zhì)的光密度之和。 已知蔗糖與TBA

13、顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm和532nm波長下的比吸收系數(shù)分別為85.40，7.40。MDA在450nm波長下無吸收，故該波長的比吸收系數(shù)為0，532nm波長下的比吸收系數(shù)為155，根據(jù)雙組分分光度計法建立方程組，求解方程得計算公式：C1(mmol/L)=11.71D450 C2(mol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 式中：C1為可溶性糖的濃度，C2為MDA的濃度，D450、D532、D600分別代表450nm、532nm和600nm波長下的光密度值。試劑10%三氯乙酸（TCA）；0.6%硫代巴比妥酸，先加少量的氫氧化鈉（1 mol/L）溶解，再用10的三氯乙酸定容；石英

14、砂。方法1. 實驗材料 受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片或衰老的植物器官。2. MDA的提取 稱取剪碎的試材1g，加入2ml 10TCA和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8ml TCA進一步研磨，勻漿在4000rpm離心10min，上清液為樣品提取液。3. 顯色反應(yīng)和測定 吸取離心的上清液2ml（空白加2ml蒸餾水），加入2ml 0.6%TBA溶液，混勻物于沸水浴上反應(yīng)15min，迅速冷卻后再離心。取上清液測定532nm、600nm和450nm波長下的光密度。4. 計算含量 雙組分分光光度法 按公式可直接求得植物樣品提取液中MDA的濃度。 用上述任一方法求得MDA的濃度，根據(jù)植物組織的重量計

15、算測定樣品中MDA的含量：MDA(mol/g FW)五、植物組織中過氧化物酶活性測定原理在過氧化物酶 (peroxidase) 催化下 ,H2O2 將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物。此產(chǎn)物在 470nm 處有最大光吸收, 故可通過測 470nm 下的吸光度變化測定過氧化物酶的活性。步驟：1. 酶液的制備：取 1.0-5.0g 材料，切碎，放入研缽中，加適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中，于 3000g 離心 l0min，上清液轉(zhuǎn)入25ml 容量瓶中。沉淀用 5ml 磷酸緩沖液再提取兩次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低溫下保存?zhèn)溆谩?. 過氧化物酶活性測定：酶活性測定的反應(yīng)體系包括：2.9ml0.05mol.L-l 磷酸緩沖液；1.0m1 2%H2O2；1.0ml 0.05mol.L-l 愈創(chuàng)木酚和 0.1ml 酶液。用加熱煮沸 5min 的酶液為對照，反應(yīng)體系加入酶液后，立即于37水浴中保溫15min，然后迅速轉(zhuǎn)入冰浴中，并加入 2.0ml 20% 三氯乙酸終止反應(yīng)，然后，過濾