【課件】3.2基因工程的基本操作程序（一）課件2021-2022學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

1、稀釋涂布平板稀釋涂布平板法法基因工程的誕生與發(fā)展基因工程的誕生與發(fā)展第第3 3章章 基因工程基因工程基因工程的理論基礎(chǔ)：基因工程的理論基礎(chǔ)：1. DNA1. DNA是遺傳物質(zhì)的證明；是遺傳物質(zhì)的證明；2. DNA2. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的證明；雙螺旋結(jié)構(gòu)的證明；4.4.密碼子的破譯。密碼子的破譯。3. 3. 中心法則的確立；中心法則的確立；第第2 2節(jié)節(jié) 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序DNA合成儀合成儀轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉非轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉非轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉 棉鈴蟲(chóng)是一種嚴(yán)重危害棉花的害蟲(chóng)。棉鈴蟲(chóng)是一種嚴(yán)重危害棉花的害蟲(chóng)。我國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)一種生活在棉鈴蟲(chóng)消化道我國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)一種生活在棉鈴

2、蟲(chóng)消化道內(nèi)的蘇云金芽孢桿菌能分泌一種毒蛋白使內(nèi)的蘇云金芽孢桿菌能分泌一種毒蛋白使棉鈴蟲(chóng)致死，而此毒蛋白對(duì)人畜無(wú)害。請(qǐng)棉鈴蟲(chóng)致死，而此毒蛋白對(duì)人畜無(wú)害。請(qǐng)思考如何利用蘇云金芽孢桿菌的毒蛋白生思考如何利用蘇云金芽孢桿菌的毒蛋白生產(chǎn)抗蟲(chóng)棉？產(chǎn)抗蟲(chóng)棉？轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉與普通棉花轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉與普通棉花 19971997年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉。到化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉。到20152015年，我年，我國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉新品種國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉新品種100100多個(gè)，多個(gè)，減少農(nóng)藥用量減少農(nóng)藥用量4040萬(wàn)噸，增收節(jié)支社會(huì)萬(wàn)噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益經(jīng)濟(jì)效益450450億

3、元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉抗蟲(chóng)的機(jī)制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因棉抗蟲(chóng)的機(jī)制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉一般需要哪些步驟？抗蟲(chóng)棉一般需要哪些步驟？ 科學(xué)家科學(xué)家將蘇云金桿菌的將蘇云金桿菌的“殺蟲(chóng)基殺蟲(chóng)基因因”BtBt抗蟲(chóng)蛋白基因轉(zhuǎn)到棉花里，讓抗蟲(chóng)蛋白基因轉(zhuǎn)到棉花里，讓棉花也能產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白棉花也能產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（BtBt抗蟲(chóng)蛋白），破壞鱗翅目昆蟲(chóng)的消化抗蟲(chóng)蛋白），破壞鱗翅目昆蟲(chóng)的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲(chóng)系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲(chóng)。 培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉主要需要四個(gè)步驟：培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉主要需要四個(gè)步驟：目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

4、、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。目的基因的篩選與獲取目的基因的篩選與獲取( (前提前提）、）、 基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因表達(dá)載體的構(gòu)建（）、）、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（關(guān)鍵關(guān)鍵）、目的基因的檢測(cè)與鑒定（）、目的基因的檢測(cè)與鑒定（保證保證）。）。蘇云金芽蘇云金芽孢桿菌孢桿菌抗蟲(chóng)基因抗蟲(chóng)基因普通棉花普通棉花( (無(wú)抗蟲(chóng)特性無(wú)抗蟲(chóng)特性) )（1 1）提提 取取普通大腸桿菌普通大腸桿菌( (不能分泌胰島素不能分泌胰島素) )人體組織細(xì)胞人體組織細(xì)胞胰島素基因胰島素基因（2 2）與運(yùn)載體與運(yùn)載體DNADNA拼接拼接（

5、3 3）導(dǎo)入導(dǎo)入大腸桿菌大腸桿菌( (含含胰島素基因胰島素基因) )（4 4）轉(zhuǎn)基因大腸）轉(zhuǎn)基因大腸桿菌桿菌( (能分泌胰島素能分泌胰島素) )第一步：目的基因的篩選與獲取第一步：目的基因的篩選與獲?。ㄒ唬┗蚪Y(jié)構(gòu)（一）基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成非編碼區(qū)非編碼區(qū)組成：編碼區(qū)組成：編碼區(qū)上游上游與編碼區(qū)與編碼區(qū)下游下游功能：功能：不能編碼不能編碼蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)，遺遺傳信息的表達(dá)傳信息的表達(dá)啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子：RNARNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄起始的信號(hào)錄起始的信號(hào)終止子：終止子：終止終止RNARNA的合成的合成非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)

6、子：RNARNA聚合聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn) 開(kāi)始轉(zhuǎn)錄開(kāi)始轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)編碼區(qū)原核生物基因原核生物基因終止子：終止子：終止轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)與與RNARNA聚合聚合酶結(jié)合位點(diǎn)酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子1 12 23 34 45 5啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子編碼區(qū)編碼區(qū)：非編碼區(qū)：非編碼區(qū)：外顯子：外顯子： 內(nèi)含子：內(nèi)含子： 能編碼蛋白質(zhì)的序列能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列不編碼蛋白質(zhì)不編碼蛋白質(zhì), ,能調(diào)控遺傳信息表達(dá)能調(diào)控遺傳信息表達(dá)不同點(diǎn)不同點(diǎn)編碼區(qū)是編碼區(qū)是連續(xù)連續(xù)的的編碼區(qū)是間隔的、編碼區(qū)是間隔的、不連

7、續(xù)不連續(xù)的。的。相同點(diǎn)相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的都由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)編碼區(qū)和具有調(diào)控作和具有調(diào)控作用的用的非編碼非編碼區(qū)組成的。區(qū)組成的。1 1、非編碼序列：、非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子2 2、編碼相同數(shù)目氨、編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？3 3、PCRPCR擴(kuò)增人胰島素基因后直接導(dǎo)擴(kuò)增人胰島素基因后直接導(dǎo)入大腸桿菌中入大腸桿菌中能否正確表達(dá)能否正確表達(dá)? ?為為什么？什么？不能；大腸桿菌體內(nèi)沒(méi)有剪切內(nèi)含子的酶。不能；大腸桿菌體內(nèi)沒(méi)有剪切內(nèi)含子的酶。（二）目的基因（二）目的基因

8、在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀改變受體細(xì)胞性狀或或獲獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等等相關(guān)相關(guān)的基因。的基因。 根據(jù)不同的需要，目的基因不同，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基根據(jù)不同的需要，目的基因不同，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。如：因。如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。用酶等相關(guān)的基因。 蘇云金桿菌通過(guò)產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（蘇云金桿菌通過(guò)產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt Bt 抗蟲(chóng)蛋抗蟲(chóng)蛋白），破壞鱗翅目昆蟲(chóng)的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲(chóng)。白），破壞鱗翅目昆蟲(chóng)的消化系統(tǒng)來(lái)殺死

9、棉鈴蟲(chóng)。 科學(xué)家將科學(xué)家將“”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt Bt 抗蟲(chóng)蛋白抗蟲(chóng)蛋白抵抗蟲(chóng)害。抵抗蟲(chóng)害。 蘇云金桿菌抗蟲(chóng)基因、植物抗病基因（抗病蘇云金桿菌抗蟲(chóng)基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌毒、抗細(xì)菌) )、人胰島素基因、人干擾素基因、人胰島素基因、人干擾素基因等。等。 從相關(guān)的從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因基因中篩選，是中篩選，是較為有效的方法之一。較為有效的方法之一。（三）目的基因的篩選與獲?。ㄈ┠康幕虻暮Y選與獲取目的基因獲取方法目的基因獲取方法（1 1）從基因文庫(kù)中獲?。簭幕蛭膸?kù)中獲?。海? 2）人工合成：人工合成： （3 3）利用利用PCRP

10、CR技術(shù)獲取和擴(kuò)增技術(shù)獲取和擴(kuò)增 測(cè)序技術(shù)、遺傳學(xué)序列數(shù)據(jù)庫(kù)、序列比對(duì)工具等技術(shù)支持，測(cè)序技術(shù)、遺傳學(xué)序列數(shù)據(jù)庫(kù)、序列比對(duì)工具等技術(shù)支持，為科學(xué)家找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)和可能。為科學(xué)家找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)和可能。某生物體內(nèi)全部某生物體內(nèi)全部DNADNA 許多許多DNADNA片段片段受體菌群體受體菌群體限制酶限制酶與運(yùn)載體與運(yùn)載體 連接導(dǎo)入連接導(dǎo)入基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)某種生物某個(gè)時(shí)期的某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNAmRNAcDNAcDNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄受體菌群體受體菌群體與運(yùn)載體與運(yùn)載體 連接導(dǎo)連接導(dǎo)入入部分基因文庫(kù)（部分基因文庫(kù)（cDNAcDNA文庫(kù)）文庫(kù)）包含一種生物的全

11、部基因包含一種生物的全部基因（cDNAcDNA文庫(kù)）文庫(kù)）基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程（1 1）從基因文庫(kù)中獲?。簭幕蛭膸?kù)中獲?。喊环N生物的部分基因包含一種生物的部分基因 將含有某種生物不同基因的許多將含有某種生物不同基因的許多DNADNA片段，導(dǎo)入到受體菌的片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。因文庫(kù)。小小大大無(wú)無(wú)有有無(wú)無(wú)有有某種生物的某種生物的部分基因部分基因某種生物的全部基因某種生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以DNADNA合成儀合成儀通過(guò)通過(guò)DNADNA合成儀

12、用化學(xué)方法人工合成合成儀用化學(xué)方法人工合成 非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)與與RNARNA聚合酶結(jié)合聚合酶結(jié)合位點(diǎn)位點(diǎn)外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子1 12 23 34 45 5加 工mRNAmRNA前體前體成熟成熟mRNAmRNA不能編碼蛋白質(zhì)不能編碼蛋白質(zhì)的序列的序列= =內(nèi)含子內(nèi)含子+ +非編碼區(qū)序列非編碼區(qū)序列編碼序列編碼序列= =外顯子外顯子12345啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄錄如何獲取不含內(nèi)含子的人胰島素基因？如何獲取不含內(nèi)含子的人胰島素基因？RT-PCRRT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄PCR）技術(shù)）技術(shù)胰島胰島B B細(xì)胞細(xì)胞獲取獲取cDNA逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄大量人胰大量人胰島素基因島

13、素基因擴(kuò)增擴(kuò)增mRNA（3 3）利用利用PCRPCR獲取和擴(kuò)增目的基因獲取和擴(kuò)增目的基因PCR擴(kuò)增儀瓊脂糖凝膠電泳裝置瓊脂糖凝膠電泳裝置三半保留復(fù)制半保留復(fù)制DNADNA復(fù)制的過(guò)程復(fù)制的過(guò)程解旋解旋在能量驅(qū)動(dòng)下，解旋酶將在能量驅(qū)動(dòng)下，解旋酶將DNADNA雙螺旋解開(kāi)雙螺旋解開(kāi)合成子鏈合成子鏈DNADNA聚合酶聚合酶以解開(kāi)的每一條母鏈為以解開(kāi)的每一條母鏈為模板，以游離的模板，以游離的4 4種脫氧種脫氧核苷酸為原料，按照堿核苷酸為原料，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，各自基互補(bǔ)配對(duì)原則，各自合成與母鏈互補(bǔ)的一條合成與母鏈互補(bǔ)的一條子鏈子鏈復(fù)旋，形成兩個(gè)新的復(fù)旋，形成兩個(gè)新的DNADNA分子分子隨著解旋進(jìn)行，隨

14、著解旋進(jìn)行，子鏈不斷延伸，每條新子鏈與其對(duì)應(yīng)的模板鏈子鏈不斷延伸，每條新子鏈與其對(duì)應(yīng)的模板鏈盤(pán)繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)盤(pán)繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)DNADNA復(fù)制的過(guò)程復(fù)制的過(guò)程15N14N14N14N15N14N親親 代代子一代子一代子二代子二代細(xì)胞再分裂一次15N15N轉(zhuǎn)移到含14NH4Cl的培養(yǎng)液中細(xì)胞分裂一次提出DNA離心提出DNA離心提出DNA離心原則原則堿基互補(bǔ)配對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)時(shí)間時(shí)間有絲分裂和減數(shù)第一次分裂前的間期有絲分裂和減數(shù)第一次分裂前的間期場(chǎng)所場(chǎng)所細(xì)胞核、線(xiàn)粒體、葉綠體細(xì)胞核、線(xiàn)粒體、葉綠體條件條件模板模板親代親代DNADNA的兩條鏈的兩條鏈原料原料4 4種游離的脫氧核苷酸種游離的脫氧核苷酸能量

15、能量ATPATP酶酶解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶等聚合酶等方向方向從子鏈的從子鏈的5 5 端向端向 3 3 端延伸端延伸特點(diǎn)特點(diǎn)半保留復(fù)制；半保留復(fù)制；邊解旋邊復(fù)制；邊解旋邊復(fù)制；意義意義遺傳信息的傳遞遺傳信息的傳遞DNADNA復(fù)制的過(guò)程復(fù)制的過(guò)程DNADNA復(fù)制所需的基本條件復(fù)制所需的基本條件參與的組分參與的組分在在DNADNA復(fù)制中的作用復(fù)制中的作用解旋酶（體外用解旋酶（體外用高溫高溫代替）代替）打開(kāi)打開(kāi)DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA兩條兩條母鏈母鏈提供提供DNADNA復(fù)制的復(fù)制的模板模板4 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸合成合成DNADNA子鏈的子鏈的原料原料DNADNA聚合酶聚合酶

16、催化合成催化合成DNADNA子鏈子鏈與兩條母鏈結(jié)合的與兩條母鏈結(jié)合的2 2種種引物引物使使DNADNA聚合酶能夠從引物聚合酶能夠從引物端開(kāi)始連接端開(kāi)始連接脫氧核苷酸脫氧核苷酸 DNADNA復(fù)制是一個(gè)復(fù)制是一個(gè)邊解旋邊復(fù)制邊解旋邊復(fù)制的過(guò)程，需要的過(guò)程，需要模板模板、原料原料、能量能量和和酶酶等基本條件。等基本條件。DNADNA獨(dú)特的雙螺旋結(jié)構(gòu)，為復(fù)制提供了精確的模獨(dú)特的雙螺旋結(jié)構(gòu)，為復(fù)制提供了精確的模板，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，保證了復(fù)制能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行。板，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，保證了復(fù)制能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行。DNADNA通過(guò)復(fù)通過(guò)復(fù)制，將遺傳信息從親代細(xì)胞傳遞給子代細(xì)胞，從而保持了遺傳信制，將遺傳信息從親代

17、細(xì)胞傳遞給子代細(xì)胞，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性。息的連續(xù)性。DNADNA復(fù)制共有以下特點(diǎn)：復(fù)制共有以下特點(diǎn)： 邊解旋邊復(fù)制；邊解旋邊復(fù)制；半保留復(fù)制；半保留復(fù)制；多起點(diǎn)復(fù)制；多起點(diǎn)復(fù)制；雙向復(fù)制。雙向復(fù)制。PCRPCR獲取和擴(kuò)增目的基因獲取和擴(kuò)增目的基因a a 概念概念 PCR,PCR,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫(xiě)，它聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫(xiě)，它是一項(xiàng)是一項(xiàng)根據(jù)根據(jù)DNADNA半保留復(fù)制的原理半保留復(fù)制的原理，在，在體外提供參與體外提供參與DNADNA復(fù)制的各種組分與反復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件、對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行應(yīng)條件、對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。大量復(fù)制的技術(shù)。PCRPCR擴(kuò)增目的

18、基因擴(kuò)增目的基因所需要的基本條件所需要的基本條件參與的組分參與的組分在在DNADNA復(fù)制中的作用復(fù)制中的作用解旋酶（體外用解旋酶（體外用高溫高溫代替）代替）打開(kāi)打開(kāi)DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA兩條兩條母鏈母鏈（目的基因）（目的基因）提供提供DNADNA復(fù)制的復(fù)制的模板模板4 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸（含高能磷酸鍵）（含高能磷酸鍵）合成合成DNADNA子鏈的子鏈的原料、供能原料、供能4 4種耐高溫種耐高溫DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）酶）催化合成催化合成DNADNA子鏈子鏈與兩條母鏈結(jié)合的與兩條母鏈結(jié)合的2 2種種引物引物使使DNADNA聚合酶能夠從引物聚合酶能夠從引物端開(kāi)始連

19、接端開(kāi)始連接脫氧核苷酸脫氧核苷酸穩(wěn)定的穩(wěn)定的緩沖溶液緩沖溶液（一般添加一般添加MgMg2+2+）提供擴(kuò)增場(chǎng)所，調(diào)節(jié)提供擴(kuò)增場(chǎng)所，調(diào)節(jié)PHPH、激活激活DNADNA聚合酶聚合酶的活性的活性b PCRb PCR擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增目的基因所需要的所需要的基本條件基本條件 PCR PCR由由穆里斯穆里斯等人于等人于19851985年發(fā)明，為年發(fā)明，為此，穆里斯于此，穆里斯于19931993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。dNTPdNTP既能為既能為PCRPCR提供原料提供原料, ,也能為形成磷酸二酯鍵提供能量。也能為形成磷酸二酯鍵提供能量。c PCRc PCR擴(kuò)增目的基因的過(guò)程擴(kuò)增目的基因的過(guò)程

20、 當(dāng)溫度超過(guò)當(dāng)溫度超過(guò)90 90 時(shí)，目時(shí)，目的基因的基因DNADNA雙鏈?zhǔn)軣峤饩蹫閱坞p鏈?zhǔn)軣峤饩蹫閱捂?。鏈?當(dāng)溫度下降到當(dāng)溫度下降到50 50 左右左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈對(duì)與兩條單鏈DNADNA互補(bǔ)序列互補(bǔ)序列結(jié)結(jié)合。合。待擴(kuò)增的待擴(kuò)增的DNADNA片段片段GCGC含量越高，需要的溫度越高含量越高，需要的溫度越高高溫使氫鍵打開(kāi)，不需要解旋酶高溫使氫鍵打開(kāi)，不需要解旋酶。（1 1）若開(kāi)始只有一個(gè)）若開(kāi)始只有一個(gè)DNADNA提供模板，則循環(huán)提供模板，則循環(huán)n n次后獲得的子代次后獲得的子代DNADNA數(shù)目為數(shù)目為2 2n n個(gè)。個(gè)。（2 2）若開(kāi)始

21、有）若開(kāi)始有N N0 0個(gè)個(gè)DNADNA提供模板，則循環(huán)提供模板，則循環(huán)n n次后獲得的子代次后獲得的子代DNADNA數(shù)數(shù)目為目為 N N0 02 2n n個(gè)。個(gè)。 當(dāng)溫度上升到當(dāng)溫度上升到72 72 左右左右時(shí)，以單鏈時(shí)，以單鏈DNADNA為模板，為模板，在耐在耐高溫高溫DNADNA聚合酶的作用下，溶聚合酶的作用下，溶液中的液中的4 4種脫氧核苷酸根據(jù)堿種脫氧核苷酸根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則將基互補(bǔ)配對(duì)原則將4 4種脫氧核種脫氧核苷酸加到引物的苷酸加到引物的3 3端，進(jìn)行延端，進(jìn)行延伸、伸、合成新的合成新的DNADNA鏈。鏈。 如此重復(fù)循環(huán)多次，由于延伸后得到的產(chǎn)物又可以作為下如此重復(fù)循環(huán)多次，由

22、于延伸后得到的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍，即成倍，即成指數(shù)形式擴(kuò)增指數(shù)形式擴(kuò)增（約為（約為2 2n n，其中，其中n n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。）。PCRPCR擴(kuò)增目的基因的過(guò)程圖解擴(kuò)增目的基因的過(guò)程圖解e PCRe PCR擴(kuò)增目的基因的過(guò)程圖解擴(kuò)增目的基因的過(guò)程圖解 變性、復(fù)性和延伸變性、復(fù)性和延伸三步反應(yīng)完成后，一個(gè)三步反應(yīng)完成后，一個(gè)DNADNA分子就復(fù)制成了分子就復(fù)制成了2 2個(gè)個(gè)DNADNA分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNADNA分子就以分子就以2

23、2n n的形式的形式增加。增加。DNADNA片段電泳鑒定的原理片段電泳鑒定的原理 DNADNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的的PHPH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是這個(gè)過(guò)程就是電泳電泳。 PCR PCR 的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。來(lái)鑒定。 在凝膠中在凝膠中DNADNA分子的遷移速率與凝分子的遷移速率與凝膠的濃度、膠的濃度、DNADNA分子的大小和構(gòu)像等有

24、分子的大小和構(gòu)像等有關(guān)。凝膠中的關(guān)。凝膠中的DNADNA分子通過(guò)染色，可以分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為在波長(zhǎng)為300nm300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。 上述過(guò)程可以在上述過(guò)程可以在PCRPCR擴(kuò)增儀（擴(kuò)增儀（PCRPCR儀）中自動(dòng)完成，完成儀）中自動(dòng)完成，完成之后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定之后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定PCRPCR的產(chǎn)物。的產(chǎn)物。 PCR PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠通過(guò)通過(guò)自動(dòng)調(diào)自動(dòng)調(diào)控溫度控溫度來(lái)控制來(lái)控制DNADNA雙鏈的解聚與結(jié)合雙鏈的解聚與結(jié)合的儀器，的儀器，一次一次PCRPCR一般要經(jīng)歷一般要經(jīng)歷3030次次循環(huán)。循環(huán)。DNA復(fù)制復(fù)制PCR技術(shù)技術(shù)場(chǎng)所場(chǎng)所解旋方式解旋方式酶酶PCR技術(shù)擴(kuò)增與技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較高溫高溫解旋酶解旋酶體外復(fù)制