免疫磁性微球技術(shù)專題

1、免疫磁性微球技術(shù)專題技術(shù)簡(jiǎn)介：免疫磁性微球（Immunomagnetic Microspheres，IMMS），或稱免疫磁珠（Immunomagnetic Beads，IMB）是免疫學(xué)和超順磁性磁珠結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一類新型材料。免疫磁珠是包被有抗體或具有抗體結(jié)合功能的超順磁性微球，當(dāng)它與含有靶物質(zhì)的樣品混合孵育時(shí)，可與靶物質(zhì)特異性地結(jié)合而形成具有磁響應(yīng)性的復(fù)合物，此復(fù)合物可被磁場(chǎng)滯留，從而與樣品中其他雜質(zhì)分離。免疫磁性分離簡(jiǎn)便易行，分離純度高，保留靶物質(zhì)活性，且高效、快速、低毒，可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分離和提純、免疫檢測(cè)、免疫純化、免疫沉淀等領(lǐng)域。 核心原理：磁性材料在高溫條件下，或是磁性顆粒的粒度

2、很小時(shí)，其磁性很容易隨周圍的磁場(chǎng)改變而改變，磁體的極性也呈現(xiàn)出隨意性，難以保持穩(wěn)定的磁性能，這種現(xiàn)象就是超順磁效應(yīng)。超順磁性磁珠能在外部磁場(chǎng)的作用下迅速聚集，當(dāng)磁場(chǎng)撤離后即可重新分散而不帶有剩磁，這種特性使其作為一種新型的分離純化基質(zhì)被廣泛用于生物活性物質(zhì)的分離純化技術(shù)上。理想的磁珠具有均勻的球形、由具有超順磁性的鐵質(zhì)核心及高分子保護(hù)外殼，大小從5010000nm不等。表面常帶有化學(xué)功能的基團(tuán)，如-OH、-NH2、 -COOH和-CONO2等，使得磁珠幾乎可以偶聯(lián)任何具有生物活性的蛋白。磁珠與多數(shù)生物高分子如多聚糖、蛋白質(zhì)等具有良好的生物相容性。在生物工程，特別是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用，具有良好的

3、生物相容性是非常重要的。 免疫磁珠用于細(xì)胞分離和提純 ：在臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，經(jīng)常需要對(duì)各種需要的特定種類的細(xì)胞進(jìn)行分離，流式細(xì)胞分選技術(shù)是一種目前使用較多的細(xì)胞分選方法，其原理是用熒光標(biāo)記抗體的細(xì)胞受光激發(fā)后在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)方向會(huì)發(fā)生改變，藉此來(lái)將抗體陰性細(xì)胞分開，但該方法存在費(fèi)用高、分離時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞處理量小等缺陷。 應(yīng)用免疫磁珠分離細(xì)胞是細(xì)胞分選的一大突破，該方法方便、快速、分離細(xì)胞的純度高，具有較好的生物活性。使用免疫磁珠進(jìn)行分離細(xì)胞有兩種方式；直接從細(xì)胞混合液中分離出靶細(xì)胞的方法，稱為陽(yáng)性分離；用免疫磁珠去除無(wú)關(guān)細(xì)胞，使靶細(xì)胞得以純化的方法稱為陰性分離。免疫磁珠技術(shù)可用來(lái)分離人類各

4、種細(xì)胞如紅細(xì)胞、外周血嗜酸/堿性粒細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞、造血細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、人類關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、及多種腫瘤細(xì)胞等。 免疫磁珠用于免疫檢測(cè) ：免疫磁珠的超順磁性使固/液相分離更加簡(jiǎn)便，可省去過(guò)濾等繁雜的傳統(tǒng)操作，磁珠微小，比表面積大，與生物分子等物質(zhì)偶聯(lián)時(shí)容量大，懸浮穩(wěn)定性好，有利于抗原抗體反應(yīng)順利進(jìn)行，因此，免疫磁珠在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)及食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前景。 在免疫檢測(cè)中，免疫磁珠替代傳統(tǒng)酶標(biāo)板作為固相載體，包被在磁珠表面的抗體（或抗原）可與環(huán)境中特異性抗原（或抗體）結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，在外加磁場(chǎng)作用下，使特異性抗原（或抗體）與其它物質(zhì)分離，

5、這種分離方法使整個(gè)反應(yīng)在液相中進(jìn)行，克服了放射免疫測(cè)定和傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫測(cè)定方法中抗原抗體反應(yīng)發(fā)生在固/液相之間等的缺點(diǎn)，具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、特異性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，因而磁性粒子可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)，如檢測(cè)體內(nèi)各種抗原或抗體，癌細(xì)胞、環(huán)境、生物樣品及食品中的微生物。更重要的是，該方法能夠?qū)⒋龣z測(cè)物質(zhì)分離出來(lái)，可用于微生物的富集培養(yǎng)及細(xì)胞（如癌細(xì)胞，巨核細(xì)胞及T細(xì)胞等）分選等的研究。 免疫磁珠還可與化學(xué)發(fā)光、熒光免疫等技術(shù)相結(jié)合，從而極大地提高檢測(cè)靈敏度，對(duì)于極微量物質(zhì)的檢出及定量測(cè)定等都是一項(xiàng)具有很好應(yīng)用前景的檢測(cè)方法。 免疫磁珠用于單抗免疫純化： 單克隆抗體是B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞雜

6、交形成的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的，其重鏈和輕鏈所形成的結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別和結(jié)合特異抗原。至2007 年，F(xiàn)DA 已批準(zhǔn)了20 多種治療性單克隆抗體藥物，約一半用于治療癌癥，多個(gè)已成為年銷售額超十億美元的“重磅炸彈”藥物。全球單克隆抗體藥物的市場(chǎng)增長(zhǎng)十分迅猛，有約200 多種單抗在臨床實(shí)驗(yàn)，占整個(gè)臨床生物技術(shù)藥品總數(shù)的三分之一多，其中四分之一在臨床三期或等候批準(zhǔn)。 單抗藥物的迅猛發(fā)展對(duì)抗體純化工業(yè)提出了新的挑戰(zhàn)。目前，主流的抗體純化生產(chǎn)主要包括以下步驟：1、 發(fā)酵液澄清； 2 、抗體捕獲；3 、抗體精細(xì)純化；4 、抗體濃縮洗濾；5 、抗體過(guò)濾除菌/制劑。在抗體捕獲階段，主要應(yīng)用蛋白A親和層析技術(shù)從發(fā)酵上清液

7、中提取抗體。蛋白A是一種從金黃葡萄球菌細(xì)胞膜上提取的蛋白，具有5個(gè)IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能特異性地與抗體Fc端結(jié)合。傳統(tǒng)的層析技術(shù)存在其固有的缺點(diǎn)，包括：發(fā)酵溶液需進(jìn)行澄清操作；層析操作耗時(shí)長(zhǎng)，儀器昂貴；配體脫落等問(wèn)題。 應(yīng)用蛋白A包被的免疫磁珠純化技術(shù)無(wú)需復(fù)雜的層析設(shè)備，對(duì)樣品的澄清度沒(méi)有限制，只需要簡(jiǎn)單的磁性吸附步驟即可很方便快捷地從單抗表達(dá)產(chǎn)物中分離單抗，有效解決了傳統(tǒng)層析技術(shù)的不足之處。 免疫磁珠用于抗原純化： 高質(zhì)量的抗原制品在臨床檢驗(yàn)中成為高靈敏度免疫檢測(cè)試劑必不可少的組成成分?？乖雌鋪?lái)源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動(dòng)物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提

8、取純化才能被使用。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細(xì)菌和病毒抗原可以從其培養(yǎng)物中提取，蛋白成份抗原可從富含此抗原的材料中提取等（例如AFP從臍帶血或胎肝中提取）。 重組抗原是抗原基因在質(zhì)粒體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的優(yōu)點(diǎn)是除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無(wú)傳染性，但純化技術(shù)難度較大。以大腸桿菌為質(zhì)粒體的重組抗原如不能充分除大腸桿菌成份，用于ELISA，在反應(yīng)中可出現(xiàn)假陽(yáng)性，因不少受檢者受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點(diǎn)是能用基因工程制備某些無(wú)法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培養(yǎng)成功，而且丙肝

9、病人血清中HCV抗原含量極微。 目前檢測(cè)抗HCV ELISA中所用包被抗原大多為根據(jù)HCV的基因克隆表達(dá)而制備的重組抗原。在傳染病診斷中，不少重組抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應(yīng)用。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。 應(yīng)用抗體與目標(biāo)抗原之間的特異性親和吸附作用，表面包被抗體的免疫磁珠可用于高純度抗原蛋白的純化。與傳統(tǒng)的金屬離子螯合親和層析、離子交換、疏水層析相結(jié)合的蛋白多步層析純化步驟相比，由于抗體對(duì)特定抗原的結(jié)合具有極

10、高的特異性，因此一步純化即可得到純度大于95%的抗原蛋白產(chǎn)品，大大簡(jiǎn)化了純化周期，可為臨床免疫檢測(cè)提供高品質(zhì)的抗原標(biāo)準(zhǔn)品。 用作靶向釋藥系統(tǒng)的載體 ：腫瘤靶向治療是利用特定的載體將藥物或治療因素選擇性地定向于腫瘤組織，提高腫瘤組織局部的藥物濃度，達(dá)到提高療效，降低毒副反應(yīng)。免疫磁性納米藥物微球具有磁靶向和抗體特異性雙重靶向功能，可提高藥物在腫瘤部位的濃度和減少對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用，成為在臨床上使用的一種特異靶向藥物載體。 免疫磁珠作為靶向釋藥系統(tǒng)的載體可使免疫磁性微球上的抗癌藥物更易與癌細(xì)胞接觸，服用這種制劑后，在體外適當(dāng)部位用一適宜強(qiáng)度的磁鐵，將磁性微球引導(dǎo)到體內(nèi)特定靶區(qū)，提高了殺傷癌細(xì)胞的

11、效果。很多研究者使用不同的方法制成了針對(duì)不同癌細(xì)胞的免疫磁珠，作為靶向釋藥系統(tǒng)的載體并在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)這種釋藥載體具有良好的功效。 常見問(wèn)題與解答 如何提高磁珠在免疫沉淀反應(yīng)中的特異性? 答：可以先將抗體與樣品進(jìn)行孵育，形成抗體-抗原復(fù)合物，再用Protein A磁珠捕獲復(fù)合物。這種方法可以提高抗體與抗原的結(jié)合效率，并降低磁珠與樣品接觸的時(shí)間，從而提高沉淀產(chǎn)物的特異性。對(duì)于蛋白質(zhì)/核酸共沉淀或染色質(zhì)免疫共沉淀也推薦使用此法。 如何提高抗體洗脫效率？ 答：抗體與Protein A配基親和度太高導(dǎo)致抗體洗脫效率低，可以通過(guò)降低洗脫緩沖液的pH值（2.51.9）、增大洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度（可選用23M

12、MgCl2）或延長(zhǎng)洗脫時(shí)間，提高抗體的洗脫效率。但應(yīng)注意抗體在低pH條件下容易形成聚集物，抗體洗脫產(chǎn)物應(yīng)馬上用堿性緩沖劑（如Tris、HEPES等）調(diào)節(jié)pH至中性。 如何解決磁珠易粘附耗材的現(xiàn)象？ 答：建議使用低吸附率的耗材進(jìn)行磁珠操作。另外，磁珠反應(yīng)體積應(yīng)占反應(yīng)容器體積的1/2或以上，反應(yīng)容器體積過(guò)大會(huì)導(dǎo)致粘附在容器壁上的磁珠增多。在緩沖液中添加0.01% 0.1% 的非離子型去垢劑（如NP-40、Tween-20或Triton X-100）可以有效降低磁珠對(duì)耗材的粘附。 磁珠在使用過(guò)程中出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象？ 答：磁珠在使用時(shí)出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象使得一般振蕩不能打散磁珠使其均勻分布，出現(xiàn)該問(wèn)題的原因是磁珠

13、在磁場(chǎng)中放置太久而使磁珠牢固的結(jié)合在一起。用超聲波水浴處理2min即可打散磁珠使其重新分散，但應(yīng)注意超聲處理也會(huì)使磁珠在樣品溶液中捕獲的抗體脫落，所以磁珠在加樣后洗脫前不宜使用該方法。 磁珠如何再生? 答：經(jīng)過(guò)多次使用后的磁珠可以用1% TritonX-100或0.1% SDS洗滌再生，具體步驟如下：（1）使用后的磁珠10mg，加入5ml 1% TritonX-100或0.1% SDS，振蕩均勻，室溫混合10min；（2） 于磁性分離器上分離固液，吸去上清液，馬上加入5ml 含0.01% Tween-20、50mM Tris buffer（pH7.5）溶液洗滌磁珠3次；（3）洗滌后磁珠加入1ml 含50mM Tris 、0.1% Tween-20、0.01% NaN3溶液，混合均勻后4保存。 技術(shù)支持本專題資料由海貍納米科技（蘇州）有限公司