基因表達(dá)和功能的研究

1、基因通過(guò)表達(dá)發(fā)揮功能： tRNA 表達(dá)第一步轉(zhuǎn)錄 DNARNA rRNA mRNA mRNA DNA？轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄物分析分析11.1 克隆基因轉(zhuǎn)錄物的研究克隆基因轉(zhuǎn)錄物的研究 1. 電鏡技術(shù)可觀察到內(nèi)含子；電鏡技術(shù)可觀察到內(nèi)含子； 1. 電鏡技術(shù)可觀察到內(nèi)含子電鏡技術(shù)可觀察到內(nèi)含子2. 核酸酶處理可精確定位核酸酶處理可精確定位轉(zhuǎn)錄起始終止位點(diǎn)及內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄起始終止位點(diǎn)及內(nèi)含子2. 核酸酶處理可精確定位核酸酶處理可精確定位轉(zhuǎn)錄起始終止位點(diǎn)及內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄起始終止位點(diǎn)及內(nèi)含子3. 引物延伸反應(yīng)能識(shí)別引物延伸反應(yīng)能識(shí)別RNA的的5末端末端4.4.NorthernNorthern雜交雜交檢測(cè)基因表達(dá)情況檢測(cè)基

2、因表達(dá)情況 5.RT-PCR5.RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)情況檢測(cè)基因表達(dá)情況（原理、操作流程）（原理、操作流程）6.6.cDNAcDNA末端快速擴(kuò)增末端快速擴(kuò)增可定位轉(zhuǎn)錄端點(diǎn)可定位轉(zhuǎn)錄端點(diǎn)7.RNA7.RNA測(cè)序檢測(cè)基因表達(dá)測(cè)序檢測(cè)基因表達(dá) 我們一般通過(guò)測(cè)定我們一般通過(guò)測(cè)定RTRT一一PCRPCR的產(chǎn)物的序列來(lái)的產(chǎn)物的序列來(lái)達(dá)到達(dá)到RNARNA測(cè)序的目的。人們?cè)?jīng)發(fā)明過(guò)接對(duì)測(cè)序的目的。人們?cè)?jīng)發(fā)明過(guò)接對(duì)RNARNA分子測(cè)序的方法，但是這些方法往往效率很低分子測(cè)序的方法，但是這些方法往往效率很低，而且關(guān)鍵的是在測(cè)序之前必須純化，而且關(guān)鍵的是在測(cè)序之前必須純化RNARNA分子。分子。得到病毒基因組

3、得到病毒基因組RNARNA的純化樣品是可能的，但對(duì)的純化樣品是可能的，但對(duì)于從眾多細(xì)胞于從眾多細(xì)胞RNARNA，例如線(xiàn)粒體，例如線(xiàn)粒體RNARNA、核糖體、核糖體RNARNA，等中純化單一的，等中純化單一的mRNAmRNA分子則非常困難。然而分子則非常困難。然而，如果，如果RTRT一一PCRPCR中的引物設(shè)計(jì)正確，只有專(zhuān)一的中的引物設(shè)計(jì)正確，只有專(zhuān)一的目的目的mRNAmRNA被復(fù)制，那么對(duì)被復(fù)制，那么對(duì)RTRT一一PCRPCR產(chǎn)物的測(cè)序分產(chǎn)物的測(cè)序分析就能夠提供析就能夠提供mRNAmRNA的序列了。的序列了。 11.2 11.2 基因表達(dá)調(diào)控的研究基因表達(dá)調(diào)控的研究 11.2.1.11.2.1

4、.識(shí)別識(shí)別DNADNA分子的蛋白結(jié)合區(qū)分子的蛋白結(jié)合區(qū)11.2.1.111.2.1.1凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)技術(shù)確定調(diào)控序列凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)技術(shù)確定調(diào)控序列g(shù)el retardation（凝膠阻滯）：根據(jù)結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA在凝膠電泳中行進(jìn)較慢的特點(diǎn)，來(lái)檢出它們的技術(shù)。P306 11.2.1.2 DNA足跡法確定調(diào)控序列的分子區(qū)域足跡法確定調(diào)控序列的分子區(qū)域 Footprinting（足跡法）：使用DNase I 降解DNA，通過(guò)檢測(cè)被保護(hù)的磷酸二酯鍵，來(lái)鑒定蛋白質(zhì)結(jié)合在DNA上的位點(diǎn)。P30511.2.1.2 DNA足跡法確定足跡法確定調(diào)控序列的分子區(qū)域調(diào)控序列的分子區(qū)域 11.2.1.3 修飾干擾實(shí)驗(yàn)確

5、定調(diào)控序列的堿基修飾干擾實(shí)驗(yàn)確定調(diào)控序列的堿基Mdification interference assay（修飾干擾實(shí)驗(yàn)）：通過(guò)化學(xué)修飾識(shí)別與DNA結(jié)合蛋白相結(jié)合的核苷酸。P30811.2.2.11.2.2.通過(guò)缺失分析來(lái)識(shí)別控制序列功能通過(guò)缺失分析來(lái)識(shí)別控制序列功能 Deletion analysis（缺失分析）：通過(guò)刪除某個(gè)基因的上游區(qū)域來(lái)阻礙該基因的表達(dá)，進(jìn)而推導(dǎo)出該基因調(diào)控序列的一種分析方法。P30411.2.2.11.2.2.通過(guò)缺失分析來(lái)識(shí)別控制序列功能通過(guò)缺失分析來(lái)識(shí)別控制序列功能 報(bào)告基因報(bào)告基因11.2.2.11.2.2.通過(guò)缺失分析來(lái)識(shí)別控制序列功能通過(guò)缺失分析來(lái)識(shí)別控制序

6、列功能缺失分析缺失分析 克隆基因定點(diǎn)突變克隆基因定點(diǎn)突變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能改變 如何分離克隆基因編碼的蛋白？如何分離克隆基因編碼的蛋白？11.3 鑒定和研究克隆基因翻譯產(chǎn)物的方法鑒定和研究克隆基因翻譯產(chǎn)物的方法11.3.1.HRT11.3.1.HRT和和HARTHART能夠識(shí)別克隆基因的翻譯產(chǎn)物能夠識(shí)別克隆基因的翻譯產(chǎn)物hybrid-release translation（HRT）( (雜交釋放翻譯雜交釋放翻譯) )hybrid-arrest translation（HART）（）（雜交俘獲翻譯）雜交俘獲翻譯） 一種識(shí)別由克隆基因編碼的翻譯產(chǎn)物的方法。一種識(shí)別由克隆基因編碼的翻譯

7、產(chǎn)物的方法。 mRNA mRNA 無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng) 蛋白蛋白11.3.1.HRT11.3.1.HRT和和HARTHART能夠識(shí)別能夠識(shí)別克隆基因的翻譯產(chǎn)物克隆基因的翻譯產(chǎn)物無(wú)細(xì)胞翻譯無(wú)細(xì)胞翻譯11.3.1.HRT11.3.1.HRT和和HARTHART能夠識(shí)別能夠識(shí)別克隆基因的翻譯產(chǎn)物克隆基因的翻譯產(chǎn)物雜交釋放翻譯雜交釋放翻譯11.3.1.HRT11.3.1.HRT和和HARTHART能夠識(shí)別能夠識(shí)別克隆基因的翻譯產(chǎn)物克隆基因的翻譯產(chǎn)物雜交俘獲雜交俘獲翻譯翻譯 盡管HRT或HART能夠識(shí)別出克隆基因的翻譯產(chǎn)物，但卻不能告訴我們關(guān)于蛋白質(zhì)本身的一些信息。而這些信息對(duì)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和其

8、活性狀態(tài)密切相關(guān)。11.3.2.11.3.2.通過(guò)體外突變研究蛋白質(zhì)通過(guò)體外突變研究蛋白質(zhì)1.1.利用核酸酶引入突變技術(shù)利用核酸酶引入突變技術(shù)產(chǎn)生新的產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域(螺旋螺旋)或使或使現(xiàn)存結(jié)構(gòu)現(xiàn)存結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定失去穩(wěn)定性性11.3.2.11.3.2.通過(guò)體外突變研究蛋白質(zhì)通過(guò)體外突變研究蛋白質(zhì)1.1.利用核酸酶引入突變技術(shù)利用核酸酶引入突變技術(shù)2.用寡核苷酸在克隆基因上導(dǎo)入點(diǎn)突變用寡核苷酸在克隆基因上導(dǎo)入點(diǎn)突變2.用寡核苷酸在克隆基因上導(dǎo)入點(diǎn)突變用寡核苷酸在克隆基因上導(dǎo)入點(diǎn)突變3.人工基因合成法引入點(diǎn)突變?nèi)斯せ蚝铣煞ㄒ朦c(diǎn)突變4.應(yīng)用應(yīng)用PCR技術(shù)構(gòu)建定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建定點(diǎn)突變11.3.3.11.3.3.蛋白與蛋白之間的相互作用的研究蛋白與蛋白之間的相互作用的研究噬菌體展示噬菌體展示11.3.3.11.3.3.蛋白與蛋白之間的相互作用的研究蛋白與蛋白之間的相互作用的研究噬菌體展示噬菌體展示酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng) 在酵母雙雜交系統(tǒng)中，存在一對(duì)相互作用并且決定基因是否表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子：DNA結(jié)合域(DBD)和轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。若這兩種因子轉(zhuǎn)到同一細(xì)胞中，由于沒(méi)有相關(guān)蛋白誘導(dǎo)，靶因子仍無(wú)