凝聚胺法交叉配血試驗

1、凝聚胺法交叉配血試驗操作規(guī)程目的 保證交叉配血試驗準(zhǔn)確，確保臨床輸血安全。適用范圍XXX醫(yī)院輸血科職責(zé)具有專業(yè)技術(shù)的工作人員主要負(fù)責(zé)XXX醫(yī)院輸血標(biāo)本的交叉配血試驗，但只對該單份標(biāo)本負(fù)責(zé)。相關(guān)文件 試劑采購、保存和使用管理程序 設(shè)備采購、使用管理程序 消毒與清潔管理程序 標(biāo)本采集、運輸、保存和報廢管理程序 緊急用血管理程序相關(guān)記錄 儀器設(shè)備的采購、使用和維護記錄 儀器的溫度記錄 恒溫水溫箱的換水和消毒記錄 消毒液的配置記錄 清潔消毒記錄 試劑采購、使用記錄 標(biāo)本交接和報廢記錄 交叉配血記錄 緊急用血記錄 實驗原理 紅細(xì)胞表面帶有大量的負(fù)電荷，以避免產(chǎn)生自發(fā)性聚集，當(dāng)紅細(xì)胞懸浮在電解質(zhì)中時，陽離

2、子會被紅細(xì)胞的負(fù)電荷所吸引，此時紅細(xì)胞則被擴散的雙層離子云所圍繞而形成Zeta電位，Zeta電位決定紅細(xì)胞之間的排斥作用。凝聚胺技術(shù)首先利用低離子溶液（LIM）降低介質(zhì)的離子強度，減少紅細(xì)胞周圍的陽離子云，以促進紅細(xì)胞與血清（血漿）中的抗體結(jié)合。其次加入的凝聚胺（Polybrene）溶液是一種高價陽離子多聚物、肝素中和劑，溶解后能產(chǎn)生很多正電荷，可以中和紅細(xì)胞表面帶有的負(fù)電荷，使紅細(xì)胞的Zeta電位降低，縮短紅細(xì)胞之間的距離，使紅細(xì)胞產(chǎn)生非特異性的凝集。最后加入的懸浮液（Resuspending）具有中和凝聚胺（Polybrene）陽離子的作用，使正常的紅細(xì)胞非特異性凝集散開，試驗結(jié)果為陰性；

3、但如果紅細(xì)胞被相應(yīng)的抗體致敏，則會被凝聚胺凝集而不會散開，試驗結(jié)果為陽性。儀器器械 玻璃試管、玻片、記號筆、一次性塑料滴管、顯微鏡、交叉配血專用離心機、試管架、恒溫水溫箱、試劑保存冰箱、標(biāo)本保存冰箱。試劑生理鹽水、凝聚胺試劑、Anti-human IgG血清，均為有合格證件的正品。試劑保存和穩(wěn)定性1 凝聚胺試劑須保存在2-25（其中陰、陽對照血清應(yīng)儲存在28）。在適當(dāng)儲存條件下有效期24個月。2 抗人IgG血清低溫冰箱保存。復(fù)溶后放24冰箱保存。3 凝聚胺試劑低離子介質(zhì)溶液（LIM）：含葡萄糖，乙二胺四醋酸-2鈉及穩(wěn)定劑。凝聚胺溶液（Polybrene）：含凝聚胺，氯化鈉及穩(wěn)定劑。復(fù)懸液（Re

4、suspending）：含檸檬酸鈉，葡萄糖及穩(wěn)定劑。陽性對照血清：含抗D血清、氯化鈉及穩(wěn)定劑。陰性對照血清：含AB血漿、氯化鈉及穩(wěn)定劑，不含紅細(xì)胞血型抗體。標(biāo)本收集與處理1、受檢者血清：采集受檢者靜脈血23ml，經(jīng)1000r/min離心1分鐘或室溫靜置1小時后取上清。2、25%的受檢者紅細(xì)胞：采集受檢者靜脈血或末梢血，先用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，再根據(jù)下表進行紅細(xì)胞懸液的配制。懸液濃度（%）壓積紅細(xì)胞（滴）鹽水（滴）2140(2ml)51 16 (0.8ml)3、以上標(biāo)本有效期為三天；若受血者抽取標(biāo)本后，輸用過血液或血液制品，且輸用時間超過12 小時的，必須重新采集標(biāo)本。4、標(biāo)本出現(xiàn)中度以上溶

5、血者，為不合格標(biāo)本，不能用于檢測。實驗方法與步驟 1、分別制備受血者和獻血者35%的紅細(xì)胞懸液（取2支使管分別標(biāo)注為受血者管和獻血者管，再分別加入2ml生理鹽水，在受血者管加入1滴受血者紅細(xì)胞，在獻血者管加入1滴獻血者紅細(xì)胞，混勻后備用）。2、取4支使管，分別標(biāo)注主側(cè)、次側(cè)、陰性對照和陽性對照：主側(cè)管：先加入2滴受血者血清（血漿），再加入1滴獻血者25%紅細(xì)胞懸液；次側(cè)管：先加入2滴獻血者血清（血漿），再加入1滴受血者25%紅細(xì)胞懸液；陰性對照管：先加入2滴陰性對照血清，再加入1滴獻血者25%紅細(xì)胞懸液；陽性對照管：先加入2滴陽性對照血清，再加入1滴獻血者25%紅細(xì)胞懸液。3、混勻后各加入LI

6、M溶液0.65ml，輕輕混勻，于室溫下靜置1分鐘。4、再各加入2滴Polybrene溶液，輕輕混勻，于室溫下靜置15秒。5、用交叉配血專用離心機3400 r/min（相當(dāng)于1000g離心力）離心10秒，然后倒掉上清液（不要瀝干），讓管底殘留約0.1 ml液體。6、輕輕搖動試管，目測紅細(xì)胞有無凝集，如無凝集，則必須重做。重做后仍然沒有凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，可能試劑失效。7、最后各加入2滴Resuspending溶液，輕輕搖動試管并同時目測凝集是否散開，再進一步倒在玻片上用顯微鏡觀察凝集是否散開。如果在60秒內(nèi)凝集散開，表明是由Polybrene引起的非特異性凝集，配血結(jié)果相合；如果凝集不散開，則為紅細(xì)胞

7、抗原抗體結(jié)合的特異性反應(yīng)，配血結(jié)果不相合。如果想進一步檢測Anti-K抗體，則必須繼續(xù)做輔助性的抗球蛋白試驗，步驟如下：8、再滴入1滴Resuspending溶液。9、用生理鹽水洗紅細(xì)胞35次，并把最后一次上清液完全倒干。10、滴入2滴Anti-human IgG血清，并混勻。11、用交叉配血專用離心機3400rpm離心15s.12、觀察有無凝集反應(yīng)，如果有凝集反應(yīng)，表示有Anti-K抗體，則必須進一步做抗體沖出試驗，供血者的血液不適合病人使用。如果沒有凝集反應(yīng)，為了確保輸血的安全性，須再各添加1滴已知致敏性紅細(xì)胞至所有沒有凝集的試管中，混勻，3400rpm離心1分鐘。正常應(yīng)有2+反應(yīng)。如果沒

8、有凝集反應(yīng)，可能是假陰性，輔助性抗球蛋白試驗必須重做。結(jié)果判斷1、ABO同型配血，主側(cè)和次側(cè)均無溶血及凝集表示無輸血禁忌，可以輸血。2、如急需輸血但一時無同型血液，作異型配血時（指O型血輸給A，B或AB型，或A，B型血輸給AB型時），主側(cè)無溶血及凝集，但次側(cè)必然有凝集或溶血。質(zhì)量控制與注意事項1、在進行交叉配血試驗時，一定要嚴(yán)格按操作規(guī)程進行，每進行一步操作，必須進行一次核對，防止操作錯誤，尤其防止主側(cè)和次側(cè)加樣加錯。操作方法應(yīng)按規(guī)定先加血清，然后再加紅細(xì)胞懸液，以便核實是否漏加血清。同時，注意區(qū)別凝聚胺所引起的凝集反應(yīng)。2、受血者標(biāo)本有效期為三天；若受血者抽取標(biāo)本后，輸用過血液或血液制品，且

9、輸用時間超過12 小時的，必須重新采集標(biāo)本。25%紅細(xì)胞懸液要求準(zhǔn)確，必要時用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞后重新配制。3、如果主側(cè)發(fā)生凝集反應(yīng)，說明配血不合，不論次側(cè)配血如何都不能輸血。如果僅次側(cè)配血發(fā)生凝集反應(yīng)，只有在緊急情況下才有可能考慮是否輸血。4、可以用EDTA抗凝血漿代替血清使用，不能使用溶血標(biāo)本及含有枸櫞酸鈉、肝素的抗凝血漿標(biāo)本。5、加Polybrene溶液離心去上清后不凝集，可能是標(biāo)本中含有肝素或其它干擾因子。若病人血清(血漿)含有肝素或其它干擾因子，如洗腎患者，需多加46滴Polybrene溶液以中和肝素或其它干擾因子。6、紅細(xì)胞懸液以35為宜，過濃或過淡可使抗原抗體比例不適當(dāng)，反應(yīng)不明

10、顯而易誤判。7、未開封的試劑應(yīng)儲存于溫度在225、相對濕度不大于80%、無腐蝕性氣體的環(huán)境中；已開封的試劑應(yīng)儲存于相對濕度不大于80%、無腐蝕性氣體和通風(fēng)良好的室溫環(huán)境中；試劑用后應(yīng)及時擰緊瓶蓋保存；未開封試劑的有效期為兩年，在有效期內(nèi)已開封的試劑應(yīng)在開封后的6個月內(nèi)使用完。8、試管，滴管吸頭和玻片必須清潔干燥，防止溶血。9、離心時間不宜過長或過短，速度不宜過快或過慢，以防假陽性或假陰性結(jié)果。10、各種原因引起的紅細(xì)胞溶解，易誤判為不凝集，部分溶血時，可溶性血型物質(zhì)中和了相應(yīng)的抗體。11、中國人極少有Anti-K抗體，但其他人種比例較高，尤其是白種人，所以，當(dāng)病人是其他人種時，為求安全起見，應(yīng)

11、加做輔助性抗球蛋白試驗。加做輔助性抗球蛋白試驗是為了增加檢測Anti-K抗體的敏感度，對檢測其他的抗體無幫助。所以，除非想進一步檢測Anti-K抗體，否則不須做到輔助性抗球蛋白試驗。12、進行交叉配血前逐項核對輸血申請單、受血者和供血者血樣，復(fù)查受血者和供血者ABO血型（正、反定型），并常規(guī)檢查患者Rh（D）血型，正確無誤時可進行交叉配血。13、結(jié)果判斷必須先肉眼觀察，再進行顯微鏡觀察。注意觀察弱凝集和排除非特異性凝集。14、交叉配血試驗中發(fā)現(xiàn)有不配合時，首先應(yīng)考慮受血者和供血者的ABO血型和Rh(D)血型定型是否錯誤，必要時進行抗體篩檢。其次，應(yīng)注意有無特異性同種抗體，特異性未知的同種抗體存

12、在，或者患者的血清在室溫37或抗球蛋白血清中凝集所有的其他紅細(xì)胞，造成交叉配血的困難，應(yīng)進一步作有關(guān)試驗進行鑒定。15、兩人值班時，交叉配血試驗由兩人互相核對；一人值班時，操作完畢后自己復(fù)核，并填寫配血試驗結(jié)果。（按“交叉配血核對制度”進行）。16、各供血者間需進行交叉配血；已經(jīng)輸注的血液不足24 小時的，供血者間也需進行交叉配血。17、凝聚胺試劑還可用于輔助抗體篩檢試驗、輔助性抗人球蛋白試驗和輔助性血型鑒定。具體操作方法詳見凝聚胺試劑盒使用說明書。18、判斷結(jié)果后應(yīng)仔細(xì)核對、記錄，避免筆誤。交叉配血的影響因素及解決方法準(zhǔn)確的交叉配血是臨床安全有效輸血的最后一條重要保證。輸血配合是選擇適合受血

13、者輸注的血液，使輸血的成分能在受血者體內(nèi)有效存活，并且無不良反應(yīng)，即輸入的紅細(xì)胞在受者體內(nèi)必須不凝集和不溶血，輸入的血漿成分不導(dǎo)致受者自身紅細(xì)胞顯著破壞，使受血者恢復(fù)健康。影響交叉配血的因素很多，主要如下： 1、標(biāo)本血標(biāo)本的采集錯誤、稀釋和溶血。另從受檢者采集l份新鮮血液標(biāo)本，這樣可以糾正因污染或搞錯樣本造成的不合。標(biāo)本一般要求離體后盡快實驗，最長不能超過3天，每次輸血后受血者和供血者的血標(biāo)本應(yīng)在28保存7天?；颊叩乃幬锸褂糜袝r也對實驗有一定影響，當(dāng)受血者使用肝素治療時，應(yīng)使用硫酸魚精蛋白對抗使標(biāo)本凝集；如果受血者使用右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等治療，應(yīng)注意將紅細(xì)胞洗滌。受檢者紅細(xì)胞上

14、抗原位點過少(如亞型)或抗原性減弱(見于白血病或惡性腫瘤)，以及類B或cisAB等。如疑為A抗原或B抗原減弱，則可將受檢紅細(xì)胞與抗A或抗B血清做吸收及放散試驗，以及用受檢者唾液作A、B、H血型物質(zhì)測定（只對80HAB分泌型的人有用）。如受檢者為A型血而疑為有類B抗原時，可用下列方法進行鑒別：(1) 觀察細(xì)胞與抗A及抗B的凝集強度，與抗A的反應(yīng)要比與抗B的反應(yīng)強，這種區(qū)別用玻片法作試驗更為明顯；(2) 用受檢者紅細(xì)胞與自身血清作試驗，血清中的抗B不凝集自身紅細(xì)胞上的類B抗原；(3) 檢查唾液中是否有A、B物質(zhì)，如果是分泌型，可檢出A物質(zhì)而無B物質(zhì)；(4) 核對患者的診斷，類B抗原的形成與結(jié)腸癌、

15、直腸癌、革蘭陰性桿菌感染有關(guān)。受檢者血清中蛋白紊亂(高球蛋白血癥)，或?qū)嶒灂r溫度過高，常引起紅胞呈緡錢狀排列。如試驗結(jié)果紅細(xì)胞呈緡錢狀排列，加等滲鹽水l滴?；旌停墒咕囧X現(xiàn)象消失。注意不應(yīng)先加鹽水l滴于受檢者血清中而后和紅細(xì)胞做試驗，以免使血清中抗體被稀釋。細(xì)菌污染或遺傳因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因。如發(fā)現(xiàn)多凝集現(xiàn)象，應(yīng)考慮由遺傳產(chǎn)生的Cad抗原活性；被細(xì)菌酶激活的T或TK受體；或產(chǎn)生機制不太明了的Tn受體所引起。多凝集紅細(xì)胞具有以下特點：(1)能被人和許多家兔的血清凝集；(2)能與大多數(shù)成年人的血清凝集，不管有無相應(yīng)的同種抗體。(3)不被臍帶血清凝集。(4)通常不與自身

16、的血清凝集。(5)如有條件可用外源凝集素加以鑒別。 檢者血清中缺乏應(yīng)有的抗-A及或抗B抗體，如丙種球蛋白缺乏癥，老年人血清中抗體水平大幅度下降等。如果試驗結(jié)果未見凝集，應(yīng)將細(xì)胞及血清試驗至少在室溫和4放置30min，用顯微鏡檢查核實。血清中有意外抗體，如自身抗I，常引起干擾。用A1、A2、B、O紅細(xì)胞及自身紅細(xì)胞檢查受檢者血清。如果懷疑是抗I，用O型(或ABO相合的)臍血紅細(xì)胞檢查。各種原因引起的紅細(xì)胞溶解，誤判為不凝集。部分溶血時，可溶性血型物質(zhì)中和了相應(yīng)的抗體。將紅細(xì)胞洗滌數(shù)次，配成25%生理鹽水細(xì)胞懸液，用抗A、抗B、抗Al，抗A十B及抗H做試驗可以得到其它有用的信息。對受檢紅細(xì)胞作直接

17、抗球蛋白試驗，如結(jié)果呈陽性，表示紅細(xì)胞已被抗體致敏。2、試劑運輸、貯存等條件不適可導(dǎo)致試劑變質(zhì)失效，造成配血錯誤。實驗前進行試劑外觀、效價等項目質(zhì)量控制。不同抗凝劑制備的標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞質(zhì)量也不同；另外，紅細(xì)胞懸液過濃或過淡，抗原抗體比例不適當(dāng)，使反應(yīng)不明顯，易誤判為陰性反應(yīng)。應(yīng)依據(jù)要求正確配制紅細(xì)胞濃度。啟用生理鹽水時，應(yīng)及時貼上啟用時間；超期的試劑要及時更換。使用過程中，懷疑試劑污染時或配血結(jié)果可疑時，必須更換試劑。 3、冷凝集素在ABO血型鑒定和交叉配血的過程中，冷凝集素是影響ABO血型正反不符和交叉配血不合的常見原因，尤其是在冬天氣溫較低時，某些病人血清中含有冷凝集素而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性。正常人

18、血清中冷凝集素效價一般不高，且在4以下時才有活性。但由于人免疫系統(tǒng)的差異，在惡性腫瘤或病原體感染后有時冷反應(yīng)性自身抗體可異常增高，造成溶血性貧血。這種冷凝集素效價在4可高于1000，用37生理鹽水洗滌紅細(xì)胞，操作時再置于37水浴中輕輕搖動可以排除冷凝集素的干擾。 4、自身免疫性溶血性貧血 紅細(xì)胞被自身抗體強烈致敏后將干擾ABO定型，且自身抗體的存在會導(dǎo)致交叉配血不合，選擇合適的試驗方法對紅細(xì)胞上結(jié)合的抗體做放散處理，確定抗體的特異性。如果抗體屬于同種抗體，則交叉配血時應(yīng)選取該抗原陰性的獻血者的血液。如果該抗體無法確定特異性，則交叉配血時要根據(jù)患者自身紅細(xì)胞與自身血清的對照反應(yīng)選取較弱反應(yīng)的獻血

19、者血液，因為自身抗體的干擾而發(fā)生ABO正反定型不相符時，可用3745生理鹽水洗滌紅細(xì)胞三次，或者用放散后的紅細(xì)胞（放散方法需不破壞紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)），血清定型則可用洗滌或放散后的紅細(xì)胞將血清中的自身抗體吸收后再進行。 5、弱凝集 血型試驗是抗原抗體反應(yīng)，當(dāng)患者紅細(xì)胞上抗原異常或血清中存在ABO血型以外的不規(guī)則抗體時，可能會導(dǎo)致減弱的或缺少的凝集反應(yīng)?？乖惓０ǎ簛喰?，這種亞型紅細(xì)胞抗原性較弱，可以通過亞型定型試劑來具體定型。紅細(xì)胞抗原形成不足或敏感性降低，如新生兒、老年人及少數(shù)惡病質(zhì)患者。鑒定血型時要注意正反定型的結(jié)合，加用抗H和抗A，B型標(biāo)準(zhǔn)血清、A2紅細(xì)胞等檢查唾液中的血型物質(zhì)，必要時作吸收放散試驗以確定。若血清中存在不規(guī)則抗體可在反定型用O細(xì)胞加以鑒定，有些亞型因為抗原的某些位點缺失，也會產(chǎn)生相對于缺失抗原位點的抗體，這些抗體的產(chǎn)生有助于亞型的判定。 6、細(xì)菌性凝集 常見有類B凝集，A型或O型病人因大腸桿菌O86感染，從而使紅細(xì)胞上獲得類B抗原，能與抗B抗體發(fā)生凝集，表現(xiàn)為B 或AB型。其不受溫度影響，病情好轉(zhuǎn)類B凝集即消失。另外紅細(xì)胞被細(xì)菌或細(xì)菌酶污染，紅細(xì)胞上的T抗原被激活，與供血者中抗T抗體發(fā)生凝集。此種凝集在4和37之間隨著溫度的升高凝集程度逐漸減弱，在37時最弱或消失。 7、混合外觀凝集現(xiàn)象 出現(xiàn)混合外觀