實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞的化學(xué)成分2

1、n 實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞主要化學(xué)成分的檢測(cè) n 細(xì)胞的化學(xué)成分n 細(xì)胞的組成：無機(jī)物和有機(jī)物，有機(jī)物主要是四細(xì)胞的組成：無機(jī)物和有機(jī)物，有機(jī)物主要是四類生物大分子：類生物大分子：n 多糖多糖n 脂肪（脂質(zhì)、膜）脂肪（脂質(zhì)、膜）n 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)n 核酸核酸實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、掌握生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的存在部位；、掌握生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的存在部位； 2、學(xué)習(xí)細(xì)胞內(nèi)主要化學(xué)成分的檢測(cè)方法；、學(xué)習(xí)細(xì)胞內(nèi)主要化學(xué)成分的檢測(cè)方法； 3、掌握徒手切片的制片方法，掌握細(xì)胞內(nèi)不同生物、掌握徒手切片的制片方法，掌握細(xì)胞內(nèi)不同生物大分子使用不同的染色劑。大分子使用不同的染色劑。 實(shí)驗(yàn)用品 1、器材：顯微鏡，恒溫水浴鍋，溫度計(jì)，刀片

2、，小燒杯，、器材：顯微鏡，恒溫水浴鍋，溫度計(jì)，刀片，小燒杯，剪刀，鑷子，吸管，玻片，染色缸，解剖器械，吸水紙剪刀，鑷子，吸管，玻片，染色缸，解剖器械，吸水紙2、試劑：濃鹽酸，堿性品紅，偏重亞硫酸鈉，活性炭，三、試劑：濃鹽酸，堿性品紅，偏重亞硫酸鈉，活性炭，三氯乙酸，氯化鈉，聯(lián)苯胺，雙氧水，硫酸銅，番紅，乙氯乙酸，氯化鈉，聯(lián)苯胺，雙氧水，硫酸銅，番紅，乙醇，甲基綠，派洛寧，高碘酸醇，甲基綠，派洛寧，高碘酸3、材料：馬鈴薯，洋蔥，小白鼠、材料：馬鈴薯，洋蔥，小白鼠細(xì)胞內(nèi)多糖的檢測(cè)n 1、細(xì)胞中多糖的測(cè)定（高碘酸（高碘酸-希夫反應(yīng)希夫反應(yīng) PAS）：）：n 糖類是生物有機(jī)體生命活動(dòng)能量的主要來源。高

3、碘酸糖類是生物有機(jī)體生命活動(dòng)能量的主要來源。高碘酸希夫試劑反應(yīng)，簡(jiǎn)稱希夫試劑反應(yīng)，簡(jiǎn)稱PAS反應(yīng)。反應(yīng)。PAS反應(yīng)是利用高碘酸作反應(yīng)是利用高碘酸作為強(qiáng)氧化劑，這種強(qiáng)氧化劑能把葡萄糖分子中為強(qiáng)氧化劑，這種強(qiáng)氧化劑能把葡萄糖分子中2-3碳原子碳原子之間連接的鍵打開，使多糖分子中的乙二醇變成乙二醛，之間連接的鍵打開，使多糖分子中的乙二醇變成乙二醛，氧化所得到的醛基與氧化所得到的醛基與Schiff試劑反應(yīng)形成試劑反應(yīng)形成紫紅色紫紅色化合物?；衔?。顏色的深淺與糖類的多少有關(guān)。顏色的深淺與糖類的多少有關(guān)。 n PAS 反應(yīng)的應(yīng)用：反應(yīng)的應(yīng)用：n 1、證明與鑒別細(xì)胞內(nèi)空泡變性，是脂肪變性還是糖原的、證明與

4、鑒別細(xì)胞內(nèi)空泡變性，是脂肪變性還是糖原的 脫失；脫失；n 2、心臟病變與其它心血管疾病的診斷與研究；、心臟病變與其它心血管疾病的診斷與研究；n 3、糖尿病是許多臟器有糖原沉積，在肝臟、腎臟內(nèi)均有、糖尿病是許多臟器有糖原沉積，在肝臟、腎臟內(nèi)均有大量糖原沉積；大量糖原沉積；n 4、某些腫瘤的鑒別診斷，如肝細(xì)胞癌糖原反應(yīng)陽(yáng)性。、某些腫瘤的鑒別診斷，如肝細(xì)胞癌糖原反應(yīng)陽(yáng)性。細(xì)胞內(nèi)多糖的檢測(cè)（1）切片：把馬鈴薯塊莖用單面單片徒手切成薄片，取一：把馬鈴薯塊莖用單面單片徒手切成薄片，取一薄片放在培養(yǎng)皿中；薄片放在培養(yǎng)皿中；（2）氧化：加高碘酸溶液將薄片浸沒氧化：加高碘酸溶液將薄片浸沒氧化5-15min；（3

5、）固定：染色完后將材料移入：染色完后將材料移入70%乙醇中浸乙醇中浸5min；（4）染色：用：用Schiff試劑染色試劑染色15-20min；（5）亞硫酸溶液洗：染色完后用新配制的亞硫酸溶液洗：染色完后用新配制的亞硫酸溶液洗3次，次，每次每次1min；（6）蒸餾水沖洗：用蒸餾水沖洗：用蒸餾水沖洗1-2次；次；（7）裝片鏡檢：將材料轉(zhuǎn)移到載玻片上，蓋上蓋玻片，置：將材料轉(zhuǎn)移到載玻片上，蓋上蓋玻片，置于低倍鏡下觀察，細(xì)胞壁、淀粉粒呈紫紅色。于低倍鏡下觀察，細(xì)胞壁、淀粉粒呈紫紅色。細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶的檢測(cè) 2.2. 細(xì)胞中過氧化物酶的顯示聯(lián)苯胺反應(yīng)n 在生物體內(nèi)，細(xì)胞代謝過程會(huì)產(chǎn)生對(duì)機(jī)體有害的過氧化在

6、生物體內(nèi)，細(xì)胞代謝過程會(huì)產(chǎn)生對(duì)機(jī)體有害的過氧化氫。存在于動(dòng)植物組織中的過氧化氫酶能使過氧化氫分解，氫。存在于動(dòng)植物組織中的過氧化氫酶能使過氧化氫分解，生成水放出氧氣，對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。過氧化氫酶系能生成水放出氧氣，對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。過氧化氫酶系能把許多胺類氧化為有色化合物。若用聯(lián)苯胺混合液處理標(biāo)把許多胺類氧化為有色化合物。若用聯(lián)苯胺混合液處理標(biāo)本，細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫酶能把聯(lián)苯胺氧化為本，細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色藍(lán)色或或棕色棕色產(chǎn)產(chǎn)物。物。n 臨床意義：定性研究、定位觀察急性白血病及其鑒別診斷。臨床意義：定性研究、定位觀察急性白血病及其鑒別診斷。細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶的檢測(cè)n （1）

7、用頸椎脫臼法處死小白鼠，剪開大腿上的皮膚和肌用頸椎脫臼法處死小白鼠，剪開大腿上的皮膚和肌肉，取出股骨；肉，取出股骨；n （2） 剪斷或者折斷股骨，用牙簽挑取骨髓（或注射器針剪斷或者折斷股骨，用牙簽挑取骨髓（或注射器針頭吹）頭吹） ，涂布于載玻片上制成涂片，晾干；，涂布于載玻片上制成涂片，晾干；n （3） 向涂片上滴加幾滴向涂片上滴加幾滴0.5%CuSO4，固定，固定1min；n （4） 傾去傾去CuSO4溶液，滴加溶液，滴加0.1%聯(lián)苯胺混合液，染色聯(lián)苯胺混合液，染色6min；n （5） 用自來水或蒸餾水沖洗材料，滴加用自來水或蒸餾水沖洗材料，滴加1%番紅染液，番紅染液，染色染色1min；n

8、（6）用自來水或蒸餾水沖洗材料，空氣中晾干，顯微鏡）用自來水或蒸餾水沖洗材料，空氣中晾干，顯微鏡下觀察。骨髓細(xì)胞內(nèi)可見到下觀察。骨髓細(xì)胞內(nèi)可見到藍(lán)色藍(lán)色或者或者棕色棕色的顆粒，即為的顆粒，即為過氧化物酶所在的部位。過氧化物酶所在的部位。細(xì)胞內(nèi)DNADNA的檢測(cè)n 3.DNA的細(xì)胞化學(xué)Feulgen反應(yīng)n DNADNA是由許多單核苷酸聚合成的多核苷酸，每個(gè)單核苷是由許多單核苷酸聚合成的多核苷酸，每個(gè)單核苷酸又由磷酸、脫氧核糖和堿基構(gòu)成。酸又由磷酸、脫氧核糖和堿基構(gòu)成。DNADNA經(jīng)經(jīng)1mol/L HCl1mol/L HCl水解，水解，除去除去RNARNA，其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的鍵打開，使脫

9、氧其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的鍵打開，使脫氧核糖的第一碳原子上形成游離的醛基，這些醛基與核糖的第一碳原子上形成游離的醛基，這些醛基與SchiffSchiff試劑反應(yīng)。試劑反應(yīng)。SchiffSchiff試劑是堿性品紅和偏重亞硫酸鈉作用，試劑是堿性品紅和偏重亞硫酸鈉作用，形成無色的品紅液，當(dāng)無色品紅與醛基結(jié)合則形成紫紅色形成無色的品紅液，當(dāng)無色品紅與醛基結(jié)合則形成紫紅色的化合物。因此凡是有的化合物。因此凡是有DNADNA的地方，都能顯示紫紅色。紫紅的地方，都能顯示紫紅色。紫紅色的產(chǎn)生，是由于反應(yīng)產(chǎn)物的分子內(nèi)含有醌基，醌基是一色的產(chǎn)生，是由于反應(yīng)產(chǎn)物的分子內(nèi)含有醌基，醌基是一個(gè)發(fā)色基團(tuán)，所以具有顏色

10、。材料不經(jīng)過水解或預(yù)熱的三個(gè)發(fā)色基團(tuán)，所以具有顏色。材料不經(jīng)過水解或預(yù)熱的三氯乙酸或氯乙酸或DNADNA酶處理，得到的反應(yīng)是陰性的，從而證明了酶處理，得到的反應(yīng)是陰性的，從而證明了FeulgenFeulgen反應(yīng)的專一性。反應(yīng)的專一性。 此反應(yīng)不僅可定性地觀察此反應(yīng)不僅可定性地觀察DNADNA存在存在的部位，還可以定量地進(jìn)行分析。的部位，還可以定量地進(jìn)行分析。細(xì)胞內(nèi)DNADNA的檢測(cè)n （1）將洋蔥根尖或鱗莖內(nèi)表皮放在盛有）將洋蔥根尖或鱗莖內(nèi)表皮放在盛有1mol/L HCl的小燒的小燒杯中，在杯中，在60中水解中水解8-10min；n （2）用蒸餾水水洗，洗去材料表面的酸液；）用蒸餾水水洗，洗

11、去材料表面的酸液；n （3）用）用Schiff試劑遮光染色試劑遮光染色30min；n （4）用新配制的亞硫酸水溶液將材料洗）用新配制的亞硫酸水溶液將材料洗3次，每次次，每次1min；n （5）用自來水或蒸餾水沖洗）用自來水或蒸餾水沖洗5次；次；n （6）將根尖放在載玻片上，用鑷子搗碎，蓋上蓋玻片，壓）將根尖放在載玻片上，用鑷子搗碎，蓋上蓋玻片，壓片（洋蔥表皮可省去壓片這一步）。片（洋蔥表皮可省去壓片這一步）。n （7）顯微鏡檢查，細(xì)胞中凡是有）顯微鏡檢查，細(xì)胞中凡是有DNA分布的部位應(yīng)呈現(xiàn)紫分布的部位應(yīng)呈現(xiàn)紫紅色的陽(yáng)性反應(yīng)。紅色的陽(yáng)性反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)DNADNA的檢測(cè)n 對(duì)照片n 方法一：先將材料

12、放在方法一：先將材料放在5%三氯乙酸中三氯乙酸中90水浴水浴15min，主要把主要把DNA抽提掉，然后按照步驟（抽提掉，然后按照步驟（1）（7）制片觀）制片觀察。察。n 方法二：材料不經(jīng)過方法二：材料不經(jīng)過1mol/L HCl水解，直接放在水解，直接放在Schiff試試劑遮光染色，然后按照步驟（劑遮光染色，然后按照步驟（4）（7）制片觀察。）制片觀察。細(xì)胞內(nèi)RNARNA的檢測(cè)n 4. RNA的細(xì)胞化學(xué)Brachet反應(yīng)的觀察n 根據(jù)根據(jù)DNA、RNA聚合程度對(duì)堿性染料的親和力不同，聚合程度對(duì)堿性染料的親和力不同，甲基綠分子有兩個(gè)相對(duì)的正電荷，與聚合程度較高的甲基綠分子有兩個(gè)相對(duì)的正電荷，與聚合

13、程度較高的DNA分子有較強(qiáng)的親和力，可使分子有較強(qiáng)的親和力，可使DNA分子染成藍(lán)綠色，分子染成藍(lán)綠色，而派洛寧分子中僅一個(gè)正電荷，可與低聚分子而派洛寧分子中僅一個(gè)正電荷，可與低聚分子RNA結(jié)合結(jié)合使其染成紅色。用甲基綠使其染成紅色。用甲基綠派洛寧對(duì)被觀察細(xì)胞進(jìn)行染色，派洛寧對(duì)被觀察細(xì)胞進(jìn)行染色，細(xì)胞質(zhì)和核仁被染成紅色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色。細(xì)胞質(zhì)和核仁被染成紅色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色。細(xì)胞內(nèi)RNARNA的檢測(cè)n 洋蔥表皮細(xì)胞洋蔥表皮細(xì)胞RNA的顯示：撕取洋蔥表皮一小的顯示：撕取洋蔥表皮一小片，置于載玻片上，滴一滴甲基綠片，置于載玻片上，滴一滴甲基綠派洛寧染液，派洛寧染液，染色時(shí)間染色時(shí)間30-40分鐘

14、，用吸管吸一滴蒸餾水沖洗，分鐘，用吸管吸一滴蒸餾水沖洗，立即用吸水紙吸干（因派洛寧易脫色）。蓋上蓋立即用吸水紙吸干（因派洛寧易脫色）。蓋上蓋玻片，鏡檢觀察結(jié)果：細(xì)胞質(zhì)和核仁呈玻片，鏡檢觀察結(jié)果：細(xì)胞質(zhì)和核仁呈淡紅色淡紅色或或紅色紅色，表示含，表示含RNA。n小結(jié)：小結(jié)：n PAS反應(yīng)用于確定多糖的存在；反應(yīng)用于確定多糖的存在；n 米倫反應(yīng)是蛋白質(zhì)成分的檢測(cè)方法（雙縮脲試米倫反應(yīng)是蛋白質(zhì)成分的檢測(cè)方法（雙縮脲試劑）；劑）；n 脂肪用蘇丹脂肪用蘇丹染色呈橘黃色（斐林試劑），四染色呈橘黃色（斐林試劑），四氧化鋨與不飽和脂肪酸反應(yīng)呈黑色，用來證明脂氧化鋨與不飽和脂肪酸反應(yīng)呈黑色，用來證明脂肪滴的存在；肪滴的存在；n Feulgen反應(yīng)可以特意地顯示反應(yīng)可以特意地顯示DNA的分布，的分布，聯(lián)苯胺反應(yīng)可以檢測(cè)過氧化物酶的存在；聯(lián)苯胺反應(yīng)可以檢測(cè)過氧化物酶的存在；n Brachet反應(yīng)可以顯示反應(yīng)可以顯示DNA、RN