基因工程的基本操作程序

1、1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)RNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)外顯子外顯子內(nèi)含子內(nèi)含子終止子終止子啟動(dòng)子啟動(dòng)子原原核核真真核核補(bǔ)充知識(shí)補(bǔ)充知識(shí): : 基因的結(jié)構(gòu)基因的結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)不同點(diǎn)編碼區(qū)是編碼區(qū)是_ _的的編碼區(qū)是間隔的、編碼區(qū)是間隔的、_的的相同點(diǎn)相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的都由能夠編碼蛋白質(zhì)的_和具和具有調(diào)控作用的有調(diào)控作用的_區(qū)組成的區(qū)組成的 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 1 1、 目的基因主要是指目的基因主要是指_編碼蛋白質(zhì)的基因編碼蛋白質(zhì)的基因 2 2、 目的基因的來源

2、目的基因的來源目前被廣泛提取使用的目的基因有：目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因人胰島素基因等。人胰島素基因等。也可以是一些具有調(diào)控作用的因子也可以是一些具有調(diào)控作用的因子 從已有的物種中分離從已有的物種中分離 人工的方法合成人工的方法合成(1)(1)從基因文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因基因文庫的概念及種類基因文庫的概念及種類從基因文庫中得到目的基因的方法從基因文庫中得到目的基因的方法（2 2）利用）利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因（3 3）人工合成）人工合成 3、目前獲取目的基因的常用方法、目前獲取目的

3、基因的常用方法：構(gòu)建基因文庫構(gòu)建基因文庫基因文庫中不是直接保管相應(yīng)基因，而是保存受體菌，菌中含基因。基因組文庫基因組文庫: 基因文庫中包含了一種生物所有的基因基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這這種基因文庫叫做基因組文庫種基因文庫叫做基因組文庫.部分基因文庫部分基因文庫: 基因文庫中包含了一種生物的一部分基因基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫這種基因文庫叫做部分基因文庫.(如如cDNA文庫文庫)種類種類關(guān)系關(guān)系供體細(xì)胞中的供體細(xì)胞中的DNADNA許多許多DNADNA片段片段重組重組DNADNA多種限制酶多種限制酶分別與運(yùn)載體連接分別與運(yùn)載體連接受體菌群細(xì)胞受體

4、菌群細(xì)胞分別分別 導(dǎo)入導(dǎo)入（供體生物的基因組文庫）（供體生物的基因組文庫）基因組文庫基因組文庫構(gòu)建構(gòu)建(鳥槍法鳥槍法)mRNA 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補(bǔ)互補(bǔ)DNA） DNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNA反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法：部分基因文庫部分基因文庫（如如cDNAcDNA文庫）文庫）的構(gòu)建的構(gòu)建限制酶處理限制酶處理分別與運(yùn)載體連接分別與運(yùn)載體連接重組重組DNADNA分別分別 導(dǎo)入導(dǎo)入受體菌群細(xì)胞受體菌群細(xì)胞（cDNAcDNA文庫）文庫） 如果用某種生物發(fā)育的如果用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的某個(gè)時(shí)期的mRNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補(bǔ)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補(bǔ)DNA（也叫（也叫cDNA）片）片段，與載體連接后儲(chǔ)存

5、在一個(gè)受體菌群中，段，與載體連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中，那么，這個(gè)受體菌群體就構(gòu)成了這種生物的那么，這個(gè)受體菌群體就構(gòu)成了這種生物的cDNA文庫文庫。這種方法稱。這種方法稱反轉(zhuǎn)錄法反轉(zhuǎn)錄法文庫類型文庫類型cDNAcDNA文庫文庫基因組文庫基因組文庫文庫大小文庫大小小小大大基因種類基因種類某種生物的部分基因某種生物的部分基因某種生物的全部基因某種生物的全部基因基因中基因中啟動(dòng)子啟動(dòng)子無無有有基因中基因中內(nèi)含子內(nèi)含子無無有有說明說明基因文庫的組建過程就包含基因工程的基本操基因文庫的組建過程就包含基因工程的基本操作步驟作步驟。從基因文庫中獲取目的基因的優(yōu)點(diǎn)是。從基因文庫中獲取目的基因的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便

6、，缺點(diǎn)是工作量大，具有一定的盲目操作簡便，缺點(diǎn)是工作量大，具有一定的盲目性性. .依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的功能、基因在染色體上的位置基因的功能、基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。如何從基因文庫中得到所需要的基因？如何從基因文庫中得到所需要的基因？質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA分子分子限制酶處理限制酶處理一個(gè)切口一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口兩個(gè)切口獲得目的基因獲得目的基因DNADNA連接酶連接酶重組重組DNADNA分子（重組質(zhì)粒

7、）分子（重組質(zhì)粒） 核心核心同一種同一種二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1 1、過程、過程: :2、目的：、目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。表達(dá)和發(fā)揮作用。 科學(xué)家在培育抗蟲棉時(shí)，經(jīng)過了許多復(fù)雜的科學(xué)家在培育抗蟲棉時(shí)，經(jīng)過了許多復(fù)雜的過程和不懈的努力，才獲得成功。過程和不懈的努力，才獲得成功。 起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲

8、基因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。因在棉花體內(nèi)沒有表達(dá)。 然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子( (抗抗蟲基因首端蟲基因首端) )，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株，導(dǎo)入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲還是沒有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子基因的質(zhì)粒中插入終止子( (抗蟲基因末端抗蟲基因末端) )，導(dǎo)入，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。 位于基因的首端位于基因的首端,是是RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)聚合酶結(jié)合位點(diǎn)位于基因的末端位于基因的末端,終終止轉(zhuǎn)錄止轉(zhuǎn)錄檢測(cè)

9、目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞a、目的基因、目的基因b、啟動(dòng)子、啟動(dòng)子c、終止子、終止子d、標(biāo)記基因、標(biāo)記基因e、復(fù)制原點(diǎn)、復(fù)制原點(diǎn)它們有什么作用？它們有什么作用？DNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)聚合酶結(jié)合位點(diǎn)表達(dá)特定性狀表達(dá)特定性狀（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 是一項(xiàng)生物是一項(xiàng)生物體外復(fù)制體外復(fù)制特定特定DNA片片段的核酸合成段的核酸合成技術(shù)技術(shù)。通過此技術(shù)，可。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。獲取大量的目的基因。（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因圖像解讀：引物：一小段可以和目的基因互補(bǔ)配對(duì)的脫氧核苷酸鏈模板DNA:含有目的基因的一段DNA片段

10、原料:四種脫氧核苷酸（dCTPdCTP、dATPdATP、dGTPdGTP、dTTPdTTP）Taq酶：具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶過程：分變性、退火、延伸三步驟變性變性退火退火延伸延伸模板DNAPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物95PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束

11、 過程：過程：a a、DNADNA變性（變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火（、退火（復(fù)性復(fù)性55-6555-65）：系統(tǒng)溫度降低，引）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與物與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下進(jìn)行酶的作用下進(jìn)行延伸，合成與模板互補(bǔ)的延伸，合成與模板互補(bǔ)的_ _。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項(xiàng)，是一項(xiàng) 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技

12、術(shù)的核酸合成技術(shù)原理：原理：_條件：條件：_、 _、_ _ 、 _. _.前提條件：前提條件：方式：以方式：以_方式擴(kuò)增，即方式擴(kuò)增，即_ _（n n為擴(kuò)增循為擴(kuò)增循 環(huán)的次數(shù)）環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA雙鏈復(fù)制雙鏈復(fù)制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對(duì)引物一對(duì)引物DNADNA聚合酶聚合酶指數(shù)指數(shù)2 2n n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCRPCR技術(shù)技術(shù)DNADNA復(fù)制復(fù)制過程過程

13、DNADNA變性（變性（90909595）退火退火（復(fù)性（復(fù)性55556060）子鏈延伸子鏈延伸（70707575）重復(fù)循環(huán)重復(fù)循環(huán)DNADNA復(fù)制起始，復(fù)制起始，解旋酶解旋解旋酶解旋邊邊解旋邊復(fù)制解旋邊復(fù)制子鏈與母鏈互相盤子鏈與母鏈互相盤繞繞形成完整的形成完整的DNADNA分子分子相同相同點(diǎn)點(diǎn)原則原則堿基互補(bǔ)配對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)條件條件模板、原料（模板、原料（dCTPdCTP、dATPdATP、dGTPdGTP、dTTPdTTP）、能量、酶、引物等）、能量、酶、引物等不同不同點(diǎn)點(diǎn)解旋方解旋方式式氫鍵在高溫下斷裂，雙鏈全氫鍵在高溫下斷裂，雙鏈全部解開部解開解旋酶催化氫鍵逐步斷裂解旋酶催化氫鍵逐步斷

14、裂場(chǎng)所場(chǎng)所體外體外主要在細(xì)胞核中主要在細(xì)胞核中引物引物DNADNARNARNA酶酶熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）酶）解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶、聚合酶、DNADNA連接酶連接酶等等結(jié)果結(jié)果在短時(shí)間內(nèi)形成大量的在短時(shí)間內(nèi)形成大量的DNADNA片片段段形成完整的形成完整的DNADNA分子分子2 2、下列屬于獲取目的基因的方法的是、下列屬于獲取目的基因的方法的是( )( )利用利用mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄形成從基因組文庫中提取反轉(zhuǎn)錄形成從基因組文庫中提取從受體細(xì)胞中提取從受體細(xì)胞中提取 利用利用PCRPCR技術(shù)技術(shù) 利用利用DNADNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄 人工合成人工合成A.A

15、. B. B. C. C. D. D.1 1、 在基因工程中，把選出的目的基在基因工程中，把選出的目的基因（共因（共10001000個(gè)脫氧核苷酸對(duì)，其中腺嘌嶺個(gè)脫氧核苷酸對(duì)，其中腺嘌嶺脫氧核苷酸是脫氧核苷酸是460460個(gè)）放入個(gè)）放入DNADNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)擴(kuò)增儀中擴(kuò)增增4 4代，那么，在擴(kuò)增儀中應(yīng)放入胞嘧啶代，那么，在擴(kuò)增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個(gè)數(shù)是（脫氧核苷酸的個(gè)數(shù)是（ ）個(gè)）個(gè)A. 540 B. 8100 C. 17280 D. 75603.細(xì)菌的質(zhì)粒分子帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗細(xì)菌的質(zhì)粒分子帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是性基因在基因工程中的主要作用

16、是 A提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性 B B有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè)有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè)C C增加質(zhì)粒分子的分子量增加質(zhì)粒分子的分子量D D便于與外源基因連接便于與外源基因連接4.4. 有關(guān)基因工程的敘述正確的是有關(guān)基因工程的敘述正確的是A A限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用B B重組質(zhì)粒的形成是在細(xì)胞內(nèi)完成的重組質(zhì)粒的形成是在細(xì)胞內(nèi)完成的C C質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體 D D蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料5.哪項(xiàng)不是基因表達(dá)載體的組成部分哪項(xiàng)不是基因表達(dá)載體的組成部分( ) A.啟動(dòng)子啟動(dòng)子 B.終止密碼終止密碼 C.標(biāo)記基因標(biāo)記基因 D.目的基因目的基因6.6.已知某種限制酶在一線性已知某種限制酶在一線性DNADNA分子上有分子上有3 3個(gè)酶切位個(gè)酶切位點(diǎn)。如果該線性