高效液相色譜分析(哈爾濱商業(yè)大學(xué)電子課件)

1、第八章 高效液相色譜分析第一節(jié)第一節(jié) 特點(diǎn)特點(diǎn)與分類與分類 一、一、特點(diǎn)：特點(diǎn)： 高壓、高效、高速、高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化高壓、高效、高速、高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。試樣的高效分離分析方法。第二節(jié)第二節(jié) 高效液相色譜法的主高效液相色譜法的主要類型要類型及基本原理及基本原理一、一、液液-固吸附色譜（固吸附色譜（liquid-solid adsorption chromatography）固固 定定 相相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5 10m的硅膠吸附劑。流流 動動 相相：各種不同極性的一元或多元溶劑。基本原理基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸

2、； 適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有 官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性。缺缺 點(diǎn)點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾。二二、液、液-液分配色譜液分配色譜（liquid- liquid partition chromatography）固定相與流動相均為液體（互不相溶）；固定相與流動相均為液體（互不相溶）；基本原理基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；流流 動動 相相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極 性小于固定液的極性（正相正相 normal phase），反之，流 動相的極性大于固定液的極性（反相反相 reverse phase）。 正相與反相的出峰順序相反；固

3、固 定定 相相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠 （擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。三三、離子交換色譜、離子交換色譜（ion-exchange chromatography）固固 定定 相相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；流流 動動 相相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離 子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；基本原理基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換 劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。 親和力大，保留時間長； 陽離子交換：RSO3H

4、+M+=RSO3M+H+ 陰離子交換：RNR4OH+X-=RNR4X+OH-應(yīng)應(yīng) 用用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。四四、離子色譜、離子色譜（ion chromatography） 離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來的一中技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。 有關(guān)內(nèi)容將在第十章第六節(jié)中講授。五五、離子對色譜、離子對色譜（ion pair chromatography）原理原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子 或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合

5、形成疏水 性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配；陰離子分離陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十 六烷基三甲銨作為對離子；陽離子分離陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；反相離子對色譜反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子 Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離 子X-進(jìn)入流動相后，生成疏水性離子對Y+X - 后；在兩相間分配。六六、排阻色譜色譜、排阻色譜色譜 （size- exclusion chromatography）固定相固定相：凝膠凝膠(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)；原原 理：理：按分子大小分離。小分子可以

6、擴(kuò)散 到凝膠空隙，由其中通過，出峰 最慢；中等分子只能通過部分凝 膠空隙，中速通過；而大分子被 排斥在外，出峰最快；溶劑分子 小，故在最后出峰。 全部在死體積前出峰；可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離。七七、親和色譜（、親和色譜（Affinity chromatograph）原理原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。 先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。第三節(jié)第三節(jié) 固定相與流動相固定相與流動相

7、一、液相色譜固定相（一、液相色譜固定相（stationary phases of LC）1. 液液-液分配及離子對分離固定相液分配及離子對分離固定相 （1）全多孔型擔(dān)體）全多孔型擔(dān)體 由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用 100m的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多 見；現(xiàn)采用10m以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；（2）表面多孔型擔(dān)體）表面多孔型擔(dān)體 （薄殼型微珠擔(dān)體）3040m的玻璃微球，表面附著一層厚度為1 2m的多孔硅膠。 表面積小，柱容量底；（3）化學(xué)鍵合固定相）化學(xué)鍵合固定相 化學(xué)鍵合固定相: 目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳鍵型：硅氧碳鍵型： Si

8、OC b. 硅氧硅碳鍵型：硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣； c. 硅碳鍵型：硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型：硅氮鍵型： SiN化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)1）傳質(zhì)快傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；2）壽命長壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；3）耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定； 4）選擇性好選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；5）有利于梯度洗脫；有利于梯度洗脫； 存在著存在著雙重分離機(jī)制雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；2、液

9、液-固吸附分離固定相固吸附分離固定相種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：粒度：510 m。3.離子交換色譜離子交換色譜分離固定相分離固定相結(jié)構(gòu)類別：結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂）薄殼型離子交換樹脂 薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面 涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相）離子交換鍵合固定相 薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵 合型（鍵合離子交換基團(tuán)）樹脂類別：樹脂類別：（1） 陽離子交換樹脂（強(qiáng)酸陽離子交換樹脂（強(qiáng)酸 性、弱酸性）性、弱酸性）（2） 陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿 性、弱堿

10、性）性、弱堿性）4. 空間排阻分離固定相空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠）軟質(zhì)凝膠 葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； 水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠）半硬質(zhì)凝膠 苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠； 非極性有機(jī)溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠）硬質(zhì)凝膠 多孔硅膠、多孔玻珠等； 化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動相性質(zhì)影響小， 可在較高流速下使用。 可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。二、液相色譜的流動相（二、液相色譜的流動相（mobile phases of LC）1.、流動相特性流動相特性 （1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，

11、洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況； （2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。 （3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。 2.、流動相類別流動相類別按流動相組成分按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙 腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分

12、離或調(diào)整出峰時間。3、 流動相選擇流動相選擇 在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。 常用溶劑的極性順序常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小)4.、選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微

13、量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。第四節(jié)第四節(jié) 影響影響色譜峰擴(kuò)展及色譜峰色譜峰擴(kuò)展及色譜峰分離的因素分離的因素 一、一、影響影響分離的因素與提高柱效的途徑分離的因素與提高柱效的途徑 在高效液相色譜中, 液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項B/U較小，可以忽略不計，即： H=A+Cu 故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形

14、狀不同，如圖所示。1）液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。2）由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。3）液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)，恒溫。4）改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。二、二、 流速流速 流速大于0.5 cm/s時,Hu曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。三、三、 固定相及分離柱固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行

15、制備。第五節(jié) 高效液相色譜儀 高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意見圖，一般可分為4個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。 一、高壓輸液系統(tǒng) 由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液罐、高

16、壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。對于一個好的高壓輸液泵應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點(diǎn)是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時間的重視性差，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機(jī)械泵，它又分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。二、進(jìn)樣系統(tǒng) 高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約530cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色

17、譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。 三、三、 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)色譜柱色譜柱 色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長530cm，內(nèi)徑為45mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑312mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm 以上。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時

18、不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。 柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細(xì)粒度的填料（20m）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。 四、四、檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)另一類是總體檢

19、測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器等?，F(xiàn)將常用的檢測器介紹如下等?，F(xiàn)將常用的檢測器介紹如下: 1、紫外檢測器 2、熒光檢測器 3、示差折光率檢測器 幾乎所有物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此差示折光檢測器是一種通用型檢測器。靈敏度可達(dá)10-7gcm-3。主要缺點(diǎn)是對溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 4、電導(dǎo)檢測器 5、 附屬系統(tǒng) 它包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動進(jìn)樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置 . 第七節(jié)第七節(jié) 高效液相色譜分高效液相色譜分

20、離類型選擇離類型選擇 第八節(jié) 毛細(xì)管電泳簡介 在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實現(xiàn)分離。 1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和、球蛋白； 發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定；發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定； 第一次的自由溶液電泳；第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀；第一臺電泳儀； 1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎；年，獲諾貝爾化學(xué)獎；二、

21、經(jīng)典電泳分析 利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方利用電泳現(xiàn)象對某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。 按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳； 按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳； 傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳。三、高效毛細(xì)管電泳分析高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項重要改進(jìn)：高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項重要改進(jìn)： 一是采用了一是采用了0.