尼龍固定化木瓜蛋白酶

1、尼龍固定化木瓜蛋白酶一 實(shí)驗(yàn)原理通過(guò)物理或化學(xué)的方法，將水溶性的酶與水不溶性的載體結(jié)合，固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶稱(chēng)為固定化酶。酶的固定化方法有：吸附法（物理吸附、離子吸附）、包埋法、共價(jià)鍵結(jié)合法、交聯(lián)法。固定化酶的優(yōu)越性主要表現(xiàn)在：（1）在大多數(shù)情況下，可提高酶的穩(wěn)定性；（2）提高酶的使用效率，降低生產(chǎn)成本；（3）酶不與產(chǎn)品混合，制品易于純化；（4）利用固定化酶，工業(yè)上可以大批量、連續(xù)化生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)猃埞潭ɑ竟系鞍酌笇俟矁r(jià)鍵結(jié)合法。尼龍長(zhǎng)鏈中的酰胺鍵，經(jīng) HCl水解后，產(chǎn)生游離的-NH基，在一定條件下與雙功能試劑戊二醛中的一個(gè)-CHO縮合，戊二醛的另一個(gè)-CHO則與酶

2、中的游離氨基縮合，形成尼龍（載體）戊二醛（交聯(lián)劑）酶，即尼龍固定化木瓜蛋白酶。二.實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器3.1 材料尼龍布(86)或(66)，100目，剪成33cm2。3.2試劑1(1) 甲醇溶液(含18.6CaCL2和18.6水)（每組50mL）：稱(chēng)18.6克CaCL2 溶于18.6 mL蒸餾水，冷卻后，用甲醇定容至100 mL。1(2) 3.5molL HCl溶液（每組30mL）：取29.2 mL濃HCl，定容至100 mL。1(3) 0.2 molL硼酸緩沖液(pH 8.4) （每組30mL）：稱(chēng)取0.858克Na2B4O710H2O和0.68克H3BO3用蒸餾水溶解，定容至100 mL。

3、1(4) 5戊二醛(以0.2mo1L pH 8.4硼酸緩沖液配制，每組30mL）：取25戊二醛20mL，用0.2mo1L pH 8.4硼酸緩沖液定容至100 mL。2(5) 0.1mo1/L pH 7.2磷酸緩沖液 （每組250mL）: 稱(chēng)取1.28克Na2HPO42H2O和1克NaH2PO412H2O用蒸餾水溶解，定容至100 mL。2(6) 0.5mo1L NaCl溶液用0.1mo1/L pH 7.2磷酸緩沖液配制（每組150mL）: 稱(chēng)取2.93NaCl，用0.1mo1/L pH 7.2磷酸緩沖液溶解，定容至100 mL。3(7) 木瓜蛋白酶溶液(1mgmL，用0.1mo1/L pH 7

4、.2磷酸緩沖液配制 （每組15mL）：稱(chēng)取100 mg木瓜蛋白酶粉末，加1 mL激活劑，研磨10min,用0.1mo1/L pH 7.2磷酸緩沖液溶解，定容至100 mL。3(8) 激活劑用0.1mo1/L pH 7.2磷酸緩沖液配制，含半胱氨酸10mmo1L，EDTA 1mmo1/L（每組50mL）：稱(chēng)取0.12克半胱氨酸和0.04克EDTA，用0.1mo1/L pH 7.2磷酸緩沖液溶解，定容至100 mL。4(9) 0.5酪蛋白用0.1mo1/L pH 7.2磷酸緩沖液配制（每組20mL）。稱(chēng)取0.5克酪蛋白，加100 mL0.1mo1/L pH 7.2磷酸緩沖液，37下保溫振蕩3h，至

5、酪蛋白溶解。4(10) 10三氯乙酸(用蒸餾水配制) （每組40mL）：稱(chēng)取10克三氯乙酸，加蒸餾水溶解，定容至100 mL。3.3儀器恒溫水浴鍋, 紫外分光光度計(jì), 冰箱。 四.實(shí)驗(yàn)步驟4.1固定化酶的制備(1) 每組取5塊尼龍布洗凈，涼干。用含18.6% CaC12和18.6%水的甲醇溶液在室溫下保溫10秒鐘左右，并輕輕攪拌至尼龍布發(fā)粘，取出用水沖去污物，用吸水紙吸干。(2) 尼龍布用3.5mo1L HCl在室溫水解45min，用水洗至pH中性。(3) 尼龍布用5戊二醛在室溫下浸泡偶聯(lián)20min。(4) 取出尼龍布，用0.1molL pH7.2磷酸緩沖液反復(fù)洗去多余的戊二醛，吸干，立即用酶

6、液(1mgmL)在4下固定3.5h(酶液用量每塊布為0.8mL)。 (5) 從酶液中取出尼龍布(保留殘余酶液作測(cè)定用)，用0.5 mo1L的NaCl(用0.1molL pH7.2磷酸緩沖液配制)洗去多余的酶蛋白，即為尼龍固定化酶。4.2 酶活力測(cè)定（1）溶液酶活力測(cè)定 取0.2mL酶液，加入1.8mL激活劑，37預(yù)熱10min，加入37預(yù)熱10min的0.5%酪蛋白溶液1mL，準(zhǔn)確反應(yīng)10min，加入10%三氯乙酸2mL反應(yīng)終止酶反應(yīng)。對(duì)照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它與測(cè)定管相同。以4000rpm轉(zhuǎn)速離心5min或者過(guò)濾，清液于280nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值。在上述條件下 ，

7、 在酶反應(yīng)的10min內(nèi)增加0.001個(gè)光吸收值為1個(gè)酶單位（U）（以下同）。 表1 酶活力測(cè)定試劑溶液酶固定化酶殘留酶對(duì)照組12對(duì)照組12對(duì)照組12激活劑（mL）1.81.81.82.02.02.01.81.81.8酶液/固定化酶（mL或塊）0.20.20.21塊1塊1塊0.20.20.237保溫10min37 0.5%酪蛋白（mL）11111137反應(yīng)10 min10% TCA （mL），搖勻2222222221%酪蛋白（mL）111離心或過(guò)濾取上清A280nm（2）殘留酶活力測(cè)定 同溶液酶活力測(cè)定。（3）固定化酶活力測(cè)定 取一塊尼龍布固定化酶，加入2.0mL激活劑，其余步驟與溶液酶測(cè)定相同。五.數(shù)據(jù)處理及計(jì)算活力回收=（固定化酶總活力數(shù)/溶液酶總活力數(shù)） 100相對(duì)活力=固定化酶總活力數(shù)/(溶液酶總活力數(shù)殘留酶活力數(shù)) 100六.注意事