醫(yī)學(xué)生物學(xué)設(shè)計性探索實驗

1、第一頁，共26頁。第二頁，共26頁。什么是生物大分子？什么是生物大分子？ 生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要活性成分的有機分子。常見的生物大分子包括包括核酸、蛋白質(zhì)和多糖等。 生物大分子的特點在于其表現(xiàn)出的各種生物活性和在生物新陳代謝中的作用。生物大分子是構(gòu)成生命的基礎(chǔ)物質(zhì)。第三頁，共26頁。整個過程可分為五個步驟 材料的選擇 細胞的破碎（有時需進行細胞器的分離） 提取 分離純化（包括鹽析，有機溶劑沉淀，有機溶劑提取、吸附、層析、超離心及結(jié)晶等） 鑒定（SDS一聚丙烯酞胺凝脈電泳法）第四頁，共26頁。 一 生物大分子生物大分子材料材料 制備生物大分子，首先要選擇適當?shù)纳锊牧稀?材料的來源是動物

2、、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物。 選擇的材料應(yīng)含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低，盡可能保持新鮮，盡快加工處理。 動物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等非活性部分，絞碎后在適當?shù)娜軇┲刑崛?，如果所要求的成分在細胞?nèi)，則要先破碎細胞。 植物要先去殼、除脂。 第五頁，共26頁。二二 細胞的破碎細胞的破碎 不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動物臟器的細胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細胞壁，要采取專門的細胞破碎方法。第六頁，共26頁。 細胞破碎的常用方法 (1)機械法：研磨，組織搗碎器。 (2)物理法： 反復(fù)凍融法

3、，超聲波 處理法， 壓榨法， 冷熱交替法 (3)化學(xué)與生物化學(xué)方法：自溶法， 溶脹法， 酶解法 ， 有機溶劑處理法第七頁，共26頁。細胞器的分離細胞器的分離 制備某一種生物大分子需要采用細胞中某一部分的材料，防止其他細胞組分的干擾，細胞破碎后常將細胞內(nèi)各組分先行分離。 細胞器的分離一般采用差速離心法。細胞經(jīng)過破碎后，在適當介質(zhì)中進行差速離心。利用細胞各組分質(zhì)量大小不同，沉降于離心管內(nèi)不同區(qū)域，分離后即得所需組分。細胞器的分離制備、介質(zhì)的選擇十分重要。最早使用的介質(zhì)是生理鹽水。因它容易使亞細胞顆粒發(fā)生聚集作用結(jié)成塊狀，沉淀分離效果不理想，現(xiàn)一般改用蔗糖、Ficoll（一種蔗糖多聚物）或葡萄糖-聚

4、乙二醇等高分子溶液。第八頁，共26頁。三三 生物大分子的提取生物大分子的提取 可分為水溶液提取和有機溶劑提取可分為水溶液提取和有機溶劑提取 提取時所選擇的條件應(yīng)有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性。 極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑； 堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑； 溫度升高，溶解度加大； 遠離等電點的pH值，溶解度增加。 第九頁，共26頁。水溶液提取水溶液提取 大部分蛋白質(zhì)均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質(zhì)的提取一般以水為主。稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶度大，也是提取蛋白質(zhì)的最常用溶劑。 鹽濃度，PH值，溫度對生物大分子的提取也有

5、一定影響。 此外提取酶時加入底物或輔酶，改變酶分子表面電荷分布，也能促進提取效果。第十頁，共26頁。有機溶劑提取 一些和脂結(jié)合較牢或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例的有機溶劑提取。 胰島素既能溶于稀酸、稀堿又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以6070%的酸性乙醇提取效果最好，一方面可抑制蛋白質(zhì)水解酶對胰島素的破壞，同時也達到大量除去雜蛋白的目的。第十一頁，共26頁。四四 生物大分子的分離純化生物大分子的分離純化 由于生物體的組成成分是如此復(fù)雜，數(shù)千種乃至上萬種生物分子又處于同一體系中，因此不可能有一個適合于各類分子的固定的分離程序，但多數(shù)分離工作關(guān)鍵部分的基本手

6、段是相同的。 第十二頁，共26頁。分離純化方法分離純化方法 1、根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法 2、根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法 3、根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進行分離 4、根據(jù)配體特異性的分離方法親和層析法第十三頁，共26頁。1根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法第十四頁，共26頁。2根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別分離 （)透析與超濾透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分子分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的濾膜截留不同相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)。 （)凝膠過濾法也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一

7、。柱中最常用的填充材料是葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠第十五頁，共26頁。3、根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進行分離 電泳法； 不同的物質(zhì)，由于其帶電性質(zhì)、顆粒形狀和大小不同，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，因此可使它們分離。 離子交換層析法離子交換劑有陽離子交換劑和陰離子交換劑，當被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變或離子強度的辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來第十六頁，共26頁。 4親和層析的分離原理親和層析的分離原理 簡單的說就是通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進行

8、分離純化。被固定在基質(zhì)上的分子稱為配體，配體和基質(zhì)是共價結(jié)合的，構(gòu)成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑。第十七頁，共26頁。 由于混合物中各組分所帶電荷性質(zhì)、數(shù)量及分子量由于混合物中各組分所帶電荷性質(zhì)、數(shù)量及分子量不同，因此不同，因此, , 在同一電場的作用下，各組分泳動的方在同一電場的作用下，各組分泳動的方向和速度各異，導(dǎo)致在一定時間內(nèi)，各組分移動距離向和速度各異，導(dǎo)致在一定時間內(nèi)，各組分移動距離的不同，從而使各組分得以被分離。的不同，從而使各組分得以被分離。五五 產(chǎn)物的鑒定產(chǎn)物的鑒定最后，對分離最后，對分離產(chǎn)物進行濃縮，干燥和保存產(chǎn)物進行濃縮，干燥和保存第十八頁，共26頁。二 肝酶的分離、提

9、取、純化與鑒定 從動物肝組織中分離、提取、純化和鑒定一種酶（該酶由三種不同的亞基組成，為結(jié)合酶，pI=6.2）的技術(shù)路線。并說明實驗步驟原理。第十九頁，共26頁。3.蛋白的純化蛋白的純化2酶蛋白的粗提酶蛋白的粗提1 1脫脂肝粉制備脫脂肝粉制備 實驗步驟實驗步驟 4.凝膠電泳鑒定純度凝膠電泳鑒定純度第二十頁，共26頁。1 1脫脂肝粉制備脫脂肝粉制備 將新鮮動物肝臟切成碎塊、攪碎、充分勻漿，然后加入丙酮后離心，收集沉淀，干燥。然后將肝粉顆粒研磨、過篩、收集細粉，加入三氯甲烷充分攪拌，抽濾，重復(fù)兩次，收集濾餅、干燥。 第二十一頁，共26頁。2酶蛋白的粗提酶蛋白的粗提 將肝粉用氨水溶液恒溫抽提兩次，合

10、并濾液。將所得水溶液用乙酸溶液酸化、離心，收集上清液。然后調(diào)PH至中性，用硫酸銨初次鹽析、離心、收集上清，再次鹽析、收集沉淀，得酯酶粗品。第二十二頁，共26頁。 許多蛋白質(zhì)在其等電點（pI）處凈電荷為零，溶解度最低，可以沉淀出來。故選用適當?shù)木彌_液，調(diào)節(jié)pH，可將目的物以沉淀狀態(tài)分離，再重新溶于適當?shù)木彌_液，以供進一步純化。3 蛋白質(zhì)的純化等電點沉淀技術(shù)第二十三頁，共26頁。4.凝膠電泳鑒定純度凝膠電泳鑒定純度 SDS(SDS(十二烷基磺酸鈉十二烷基磺酸鈉: :陰離子表面活性劑陰離子表面活性劑）能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負電荷的量遠超過其本身原有的電白質(zhì)帶負電荷的量遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋