菌株分離鑒定藥敏實驗及PCR擴增實驗過程

1、目錄2.1菌株的分離純化1菌株的分離1菌株的純化12.2菌株的鑒定2革蘭氏染色鏡檢2菌株的生化鑒定22.3藥敏試驗3藥物的配制3質(zhì)控4（最小抑菌濃度）實驗42.4 CTX- M型基因的PCR擴增模板的提取72.5 CTX- M型基因的PCR擴增72.5.1 PCR 擴增引物及條件7電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物8 2.1菌株的分離純化2.1.1菌株的分離2.1.1.1實驗的準備1.分離管的準備：本實驗需要100個50ml離心管（1）用過的離心管，將蓋子擰開，加入清潔劑，沸水浴10min，毛刷清潔；（2）沒入加入清潔劑的水中，灌滿水，不要留有大氣泡；（3）放入超聲清潔機中超聲清潔45min，25,100

2、Hz；（4）倒出管中水，灌滿去離子水，再超聲20min，25，100 Hz；（5）倒出管中水，重復(fù)（4）一次；（6）倒出管中水，放入60烘箱中烘干；（7）待烘干后裝入保鮮袋中，扎孔通氣，再用報紙或牛皮紙包好，放入高壓鍋中高壓滅菌，121，20min；（8）高壓后取出放入烘箱中，烘干后待用。2.BPW（蛋白胨水）的配制：按所選試劑的規(guī)格進行配制，再送入高壓鍋中高壓滅菌，高壓后放入烘箱中烘干待用。注意瓶裝液體高壓前一定要蓋子擰松。3.試管的準備：本實驗需要100根試管（1）塞子拔出，與試管一起放入清潔劑水中，沸水浴煮沸10min，毛刷清潔；（2）10個一捆，于烘箱中烘干后，塞上塞子，報紙或牛皮紙包

3、好，高壓；（3）取出后烘干待用。4.LB肉湯培養(yǎng)液的準備：本實驗需要100根LB管根據(jù)所選購商品說明配制，將配制好的LB培養(yǎng)液，分裝到100根干凈試管，每根3ml，包好后于121高壓15min，烘干待用。5.麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的準備：按所選商品說明配制，121高壓15min，溫度稍涼后于超凈臺中倒板，待吹干后收板待用。2.1.1.2實驗過程（1）每個分離管裝入20mlBPW；（2）三點取樣剪取100份待檢肉樣分裝到100個分離管中，按肉樣的標號在分離管上標號，放入37±1溫箱搖床上培養(yǎng)6h，200r；（3）取分離管中的菌液50L加入LB管中，標號，37±1溫箱搖床上培養(yǎng)10-

4、12h，200r；（4）用接種環(huán)取一環(huán)菌液畫到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，標號，37±1溫箱過夜培養(yǎng)。菌株的純化2.1.2.1實驗的準備1.伊紅美蘭（EMB）瓊脂培養(yǎng)基的準備：按所選商品的規(guī)格配制，121高壓15min，溫度稍涼后于超凈臺中倒板，待吹干后收板待用。2. LB肉湯培養(yǎng)液的準備：同.1.1中LB肉湯培養(yǎng)液的準備。2.1.2.2實驗過程（1）接菌：用2.5L或10L移液槍的槍頭挑取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的單菌落，將槍頭打到LB管中，標號，37±1溫箱搖床上培養(yǎng)10-12h，200r；（2）劃板：用接種環(huán)取一環(huán)菌液畫到麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，標號，37±1溫箱過夜培養(yǎng)；（

5、3）用接種環(huán)挑取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的單菌落劃到EMB板上，標號，37±1溫箱培養(yǎng)18-20h；2.2菌株的鑒定 革蘭氏染色鏡檢在麥康凱瓊脂上長出紅色的菌落，在伊紅美蘭瓊脂上長出黑色、帶金屬光澤的菌落。挑取典型菌接種于MH肉湯培養(yǎng)基，37± 1 培養(yǎng)12-24 h，取出1接種環(huán)菌液進行固定、革蘭氏染色和鏡檢，根據(jù)細菌形態(tài)和染色特點，將革蘭氏染色為陰性、兩端鈍圓、無芽胞、中等大小的桿菌初步判定為大腸桿菌。2.2.2菌株的生化鑒定 1.實驗準備 生理鹽水、液體石蠟高壓進行滅菌，待用。提前復(fù)活菌株，吸取30-50L甘油保存菌液于LB肉湯，搖床培養(yǎng)3-5h（時間因菌株活性不同做適當調(diào)

6、整，此步主要是保證菌株全部復(fù)活）。純化菌株：將LB肉湯復(fù)活的菌株接種到麥康凱板，37過夜培養(yǎng)，18-24h。要求所有受試菌株必須是單一的菌落形態(tài)而且有單個菌落存在。2.實驗過程（1）接種前準備安瓿瓶：從包裝盒中取出安瓿瓶，朝易折點(瓶頸上藍點)反方向用力折開安瓿瓶，或用砂輪劃一圈安瓿瓶瓶頸處，然后用力掰開安瓿瓶，插入安瓿瓶架或雙面板中。試管：從包裝盒中取出試管，插入試管架中。注：如果染菌或變色，則不能使用，重新拿一支。折開安瓿瓶時最好包裹紗布，以免劃傷手指。 （2）接種方法直接接種：用接種針從平板上挑取已純化分離的菌落接種于需要試驗的安瓿瓶（試管）中。 菌懸液法：取一內(nèi)盛有2ml無菌水試管，用

7、接種針從平板上挑取已純化單個菌落至無菌水中仔細研磨制成0.5麥氏濁度的均一細菌懸液，滴入需要試驗的試管（安瓿瓶）中，每管3滴。 注：如內(nèi)容物為半固體或半固體生化管，采取直接穿刺接種。 （3）接種完后用封口膜封口放于37±1培養(yǎng)箱中培養(yǎng)或根據(jù)檢測標準中所規(guī)定的培養(yǎng)溫度進行培養(yǎng)。注意，腸桿菌科葡萄糖鑒定管接菌后封口，倒放置進行培養(yǎng)；氨基酸類的要先用石蠟封口。(4) 讀生化鑒定的結(jié)果，根據(jù)腸桿菌科細菌生化鑒定編碼冊查找到菌株的菌名以及陽性機率。生化反應(yīng)判斷標準見表1，其中蛋白胨水需加靛基質(zhì)溶液，苯丙氨酸需加三氯化鐵溶液，之后觀察顏色變化。葡萄糖產(chǎn)酸為陽性變成黃色標記A，不產(chǎn)酸則為陰性顏色不

8、變，產(chǎn)氣則標記G，即產(chǎn)酸產(chǎn)氣標記為AG，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣標記為A，產(chǎn)氣不產(chǎn)酸標記為G。表1 腸桿菌科細菌生化反應(yīng)判斷標準結(jié)果葡萄糖賴氨酸鳥氨酸硫化氫蛋白胨水乳糖衛(wèi)茅醇苯丙氨酸尿素枸櫞酸鹽陰性紫色黃色黃色無色無色紫色紫色無色黃色綠色陽性黃色紫紅紫紅灰褐紅色黃色黃色綠色環(huán)紅色藍色經(jīng)生化反應(yīng)鑒定為大腸桿菌者，用大接種環(huán)在接有分離純化菌株的LB瓊脂平板上輕輕刮取菌落，接到含1 mL 30%甘油肉湯的EP管中；放于-20 冰箱中保存，便于后續(xù)實驗用。如要長久保存，可用磁珠式菌種保藏管于-80 冰箱中保存菌株。2.3藥敏試驗2.3.1藥物的配制2.3.1.1實驗準備1.儲藥管的準備：用50ml離心管做為儲藥管，

9、其準備過程同.1.1中分離管的準備。2.慮管的準備：慮管用保鮮膜包好后放于燒杯中，報紙或牛皮紙封口，于121高壓20min，烘干待用。2.3.1.2實驗過程本實驗所用藥品需要配制成濃度為5120g /mL，體積40 mL。（1）稱藥：根據(jù)所購藥品的包裝上的濃度計算所要稱量的藥品量。如果包裝上沒有注明藥品濃度可根據(jù) 瓶裝藥品按5120×40/90% = 0.2276 g 稱??； 袋裝藥品按5120×40/95% = 0.2156 g 稱取。（2）溶解藥品：根據(jù)每種藥品的溶解方法來溶解以及定容稱量好的藥品；如氨芐西林（AMP）用超純水溶解即可，然后定容到40ml；氯霉素（CHL

10、）用95%的乙醇溶解后，定容到40ml；環(huán)丙沙星（CIP）用10%的醋酸溶解后，定容到40ml。表2 抗菌藥物的質(zhì)控范圍及稀釋濃度梯度抗菌藥物溶劑質(zhì)控范圍稀釋濃度梯度氨芐西林AMP超純水2-80.5-512頭孢噻呋CTFPBS+PBC0.25-10.125-512頭孢噻肟CTX超純水0.008-512頭孢他啶CTZ超純水0.03-512頭孢曲松CTR超純水0.008-512頭孢西丁CXT超純水2-80.25-512慶大霉素GEN超純水0.25-10.25-512卡那霉素KAN超純水1-40.5-512四環(huán)素TET超純水0.5-20.25-512環(huán)丙沙星CIP10%醋酸+超純水0.004-512

11、恩諾沙星ENR超純水0.004-512萘啶酸NAL1mol NaOH +超純水1-40.25-512鏈霉素STR超純水2-80.5-1024阿米卡星AMI二甲基甲酰胺（DMF）+PBS0.5-40.25-512氟苯尼考FLF95%乙醇0.5-512氯霉素CHL95%乙醇+超純水2-160.125-512喹乙醇OQX超純水0.25-512（3）濾藥：在無菌的條件下進行，將高壓過的離心管、濾管，注射器，平皿，標簽紙，鑷子等在無菌超凈臺中紫外照射15min； 將配好的藥液倒入平皿中，注射器抽取，用鑷子在火焰上滅菌后夾取濾管的粗管處，安裝到注射器上； 注入到高壓過的儲藥管中； 用鑷子將濾管取下，再抽取

12、藥液重復(fù)，直至藥液完全濾完；過濾另一種藥液時，要將平皿、注射器、濾管全部換新，不可重復(fù)用； 貼標簽：要注明藥品名稱、濃度、配制時間；如 AMP 5120 g /mL 2013.4.2。放于20 冰箱中，可保存半年之久。2.3.2質(zhì)控2.3.2.1實驗準備MH肉湯培養(yǎng)液按其商品說明進行配制，配制好后于121高壓20min，放于超凈臺中待用。大腸桿菌標準菌株ATCC25922, 購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。2.3.2.2實驗過程（1）復(fù)活大腸桿菌標準菌（ATCC25922）：取大腸桿菌ATCC25922接入LB肉湯試管中37 ± 1 溫箱搖床中培養(yǎng)3-4h；（2）計算初始濃度：根據(jù)藥品的質(zhì)控

13、計算出第一孔所要稀釋的濃度；（3）第一孔中加入180LMH肉湯，其余用排槍每孔加100LMH肉湯，；（4）藥液的稀釋：用去離子水或MH肉湯稀釋，初始濃度 = 512/（n + 2）以2L藥液為初量進行稀釋，n為稀釋藥液所加MH肉湯的量；n:2即為藥品稀釋的倍數(shù)。（5）加藥液：取出稀釋的藥液20L加入第一孔；每種藥物做兩行，96孔板的最后一行不加藥液也不加菌液，作為陰性對照。（6）倍比稀釋：取第一孔100L液體移加到第二孔，從第二孔開始倍比稀釋，最后一孔吸取100L棄去。（7）加菌液：用排槍除最后一排外每孔加100L菌液；（8）蓋好96孔板，放于37±1溫箱搖床中培養(yǎng)10-12h；（9

14、）讀取結(jié)果。2.3.3MIC（最小抑菌濃度）實驗參照2012版CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute，臨床實驗室標準研究所 ）指導(dǎo)原則和執(zhí)行標準，用瓊脂二倍稀釋法，測定63株大腸桿菌對17種常用抗菌藥物的敏感性。用二倍稀釋法把各種藥物稀釋到所需的各個濃度梯度，分別定量加入高壓滅菌過的MH 瓊脂在平皿中輕輕搖晃使之混合均勻，冷卻凝固，制成含所需藥物濃度的瓊脂平板。把稀釋至含菌量約為1. 0 × 106 CFU/mL 的菌液用微量多點接種儀接種到MH 瓊脂平板上，于37 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 18 h 后觀察結(jié)果。以完全不見細菌生

15、長的最低藥物濃度為該藥物對細菌的最小抑菌濃度( Minimal inhibitory concentration，MIC) 。2.3.3.1實驗的準備MH瓊脂、MH肉湯培養(yǎng)液分別按其商品說明進行配制，121高壓20min；20ml移液管兩支包好于121高壓20min,烘干后待用；去離子水裝入瓶中于121高壓20min，待用；章用牛皮紙或報紙包好后于121高壓20min，烘干待用。2.3.3.2實驗過程第一天1.復(fù)活菌株：吸取30-50L甘油保存菌液于到LB肉湯，搖床培養(yǎng)3-5h（時間因菌株活性不同做適當調(diào)整，此步主要是保證菌株全部復(fù)活）。復(fù)活的菌株包括47種受試離菌株和1株質(zhì)控菌株。不同的菌種

16、的質(zhì)控菌株是不一樣的，參照CLSI上選取合適的質(zhì)控菌株。2.純化菌株：將LB肉湯復(fù)活的菌株接種到麥康凱板，37過夜培養(yǎng)， 18-24h。（所有受試菌株必須是單一的菌落形態(tài)而且有單個菌落存在）3.準備無菌室中過夜紫外照的物品：（1）高壓滅菌過的移液管（20或25ml，至少兩支）；（2）過夜泡酸并清洗過的96孔板（至少兩塊），烘干后，過夜照；（3）稀釋藥用的去離子水（已高壓），MH肉湯（已高壓，稀釋菌液用）；（4）1ml槍頭，1ml槍，高壓過的章（接種儀）；（5）酒精燈，酒精棉，口罩，實驗服，記號筆，打火機，帶有濃度稀釋梯度的紙；（6）一次性平皿（藥物及濃度均標記好）。4. 根據(jù)CLSI上每種藥物

17、的質(zhì)控范圍和耐藥臨界值來確定的藥物的濃度梯度，大到應(yīng)該設(shè)置到耐藥臨界值上的1-2個梯度，小到應(yīng)該設(shè)置到包括質(zhì)控范圍內(nèi)的1-2個濃度或設(shè)置到質(zhì)控范圍的最小值下一個梯度，計算每種藥物所需的一次性平皿個數(shù)，計算時要各加一個空白板。5.準備足量的的MH瓊脂（20ml/平皿），壓好后置于60烘箱。不要過早進行高壓，要保證瓊脂的新鮮度。第二天1.將無菌室調(diào)至抽濕模式至少30min，一人在超凈臺接菌，挑單個菌落至MH肉湯中，搖床培養(yǎng)3-5h；一人在無菌室寫板，稀釋藥液。2.寫板時，在平皿底部一端寫出每種藥的稀釋度。若同時做兩個組份時，則應(yīng)用不同顏色標記區(qū)分開；板上必須寫清藥名、濃度梯度。3.除512、256

18、外，余下的濃度中各加入1ml水；需注意鏈霉素（STR）中，除1024外均加入1ml水。此時，要檢查有無漏寫的濃度；注意整個過程需在酒精燈附近操作。4.濃度編號為 512、256、128，均加1ml原藥，從128開始倍比稀釋，最后一板棄去1ml。注意，此處根據(jù)自己設(shè)定的濃度，應(yīng)有所變化，一般是依照自己所要設(shè)定的板上濃度、原藥濃度、最后加入瓊脂的體積來計算；且整個過程需在酒精燈附近操作。5.加瓊脂：512的藥板加9ml，其余加19ml，邊加邊搖晃，藥物均勻散在瓊脂板中，自然吹干；鏈霉素（STR）中均加19ml瓊脂。注意，瓊脂應(yīng)當是冷卻到50-60即不燙手背時再加入，以免溫度過高會破壞藥物的活性；混

19、勻時，動作要輕而快，要充分混合均勻，保證藥物均勻分布到瓊脂中。6.收板：待平皿蓋上無水汽或有較少水汽時，從大濃度到小濃度收板即收好后每種藥物的小濃度板置于最上面，正放。7.稀釋菌液：超凈臺中酒精燈附近進行操作（6行8排），菌液濃度為0.5麥氏比濁時，按1：100的比例將各菌液濃度稀釋到1×106CFUmL-1 ；并記錄96孔板上各菌株的順序。注意，所用96孔板，必須是打開蓋子過夜照過紫外或是新的已經(jīng)滅過菌的；若菌液濃度不同，應(yīng)當有所調(diào)整；吸取不同的菌液時，要換槍頭。8.接種細菌（又稱蓋章）：酒精燈旁，把接種儀放入96孔板中，先上下抽取混勻后，由低濃度至高濃度開始蓋，每次蓋三塊板，最高

20、濃度后換下一種藥物時，加蓋空白板，從而緩沖前面藥物的高濃度對下一個藥物的低濃度的影響。9.蓋好后，約半個小時，等菌液全部吸收好后，將其倒置于37±1培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18 h。10.處理實驗用過的物品（煮章、煮菌液、移液管），洗凈后，包好，高壓，待下次用。第三天1.讀板將平板置于暗色、無反光物體表面上判斷試驗終點，空白對照板上菌株應(yīng)該是生長良好且無污染時，以抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。以三個或三個以下小型單菌落或出現(xiàn)了云霧狀的薄層菌落，為判斷為抑制生長。如果出現(xiàn)有3個以上菌落生長于含藥濃度高于終點水平的瓊脂平板上，或低濃度藥物瓊脂平板上不長而高濃度藥物瓊脂平板上生長現(xiàn)象，則應(yīng)

21、檢查培養(yǎng)物純度或重復(fù)試驗。2.在Excel表中輸入實驗結(jié)果；煮板。注：1.進無菌室首先帶上口罩，酒精棉擦手滅菌。 2.盡量少說話，避免雜菌污染。 3.加瓊脂時，要在酒精燈附近操作，注意看好移液管量程，以防加錯。另外要防止加瓊脂時瓶中瓊脂溫度過低，使得平板中瓊脂有凝塊而造成藥液不能均勻分布。所以，有凝塊的瓊脂不要使用。 4.建議在做一批菌株時，先做一個平行，只要這個結(jié)果中的質(zhì)控菌株對藥物的敏感性在質(zhì)控范圍內(nèi)，那么這次結(jié)果即有效，不用再做第二個平行；如不能滿足上述條件，那么將不滿足條件的藥物再重新做。5.實驗中所用的菌液必須是新鮮的，不能使用已經(jīng)放置過很久的菌株。6.實驗中，要時刻記住無菌操作，避

22、免污染。2.3.3.3細菌藥敏試驗結(jié)果判定標準參照2010版CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute，臨床實驗室標準研究所 ）指導(dǎo)原則和執(zhí)行標準，用瓊脂二倍稀釋法，測定63株大腸埃希菌對18 種常用抗菌藥物的敏感性。以敏感、中介、耐藥3種形式對MIC大小作出解釋, 判定標準如表3所示。表3 大腸桿菌耐藥判定標準抗菌藥物Antibacterial agentsMIC解釋標準（g/mL）S（Susceptive）I（Intermediate）R（Drug resistant）氨芐西林AMP 81632頭孢噻呋CTF*81632頭孢噻肟CTX1

23、24頭孢他啶CTZ4816頭孢曲松CTR124頭孢西丁CXT81632慶大霉素GEN4816卡那霉素KAN163264四環(huán)素TET4816環(huán)丙沙星CIP0.061恩諾沙星ENR*-2萘啶酸NAL16-32鏈霉素STR*-64阿米卡星AMI163264氟苯尼考FLF*-32氯霉素CHL81632喹乙醇OQX*-64注：根據(jù)文獻報道，頭孢噻呋(CTF)的耐藥轉(zhuǎn)折點為8 g/mL；氟苯尼考(FLF) 的耐藥轉(zhuǎn)折點32 g/mL ；恩諾沙星(ENR)的耐藥轉(zhuǎn)折點為2 g/mL；鏈霉素(STR)的耐藥轉(zhuǎn)折點為64 g/mL 10。喹乙醇(OQX) 的耐藥轉(zhuǎn)折點為64 g/mL 20。CLSI根據(jù)細菌學(xué)、

24、藥動學(xué)和臨床資料設(shè)定并定期修訂抗生素對不同細菌敏感折點，通過折點將細菌分為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）。敏感（S）指被測菌株能被使用推薦劑量在感染部位通?？蛇_到的抗菌藥物濃度所抑制。中介（I）指抗菌藥物最低抑菌濃度MIC接近血液和組織中通常科達到的濃度，療效低于敏感菌。還表示藥物在生理濃集的部位具有臨床效力（如尿液中的喹諾酮類和-內(nèi)酰胺類）。另外，中介還作為緩沖區(qū)，以防止微笑的技術(shù)因素失控導(dǎo)致較大的錯誤結(jié)果，特別是對那些藥物毒性范圍窄的藥物。耐藥（R）指被測菌株不能被常用劑量抗菌藥物所抑制，和/或抑菌環(huán)直徑落在某些特定的微生物耐藥機制范圍（如-內(nèi)酰胺酶），臨床療效不可靠。2.4 CTX- M型基因的PCR擴增模板的提?。?）將LB管中的菌液倒入1.5mlEP管中，標號，離心，13000r，5min；（2）倒掉上清液，再將LB管剩