色譜分析法 - 浙江大學 2008 年精品課程 - -

1、色譜分析法 陳兢 30119010051、高效液相色譜法（HPLC） 具有在分析過程中不破壞樣品的特點，適合于對高沸點、大分子、強極性和熱穩(wěn)定性差的生化藥物的分析。此外，對于某些極性化合物，如有機酸、有機堿等使用液相分析亦為方便。 HPLC法的種類很多，應用廣泛。（1）反相高效液相色譜法（RP-HPLC）：以C8C18烷基硅烷鍵合相為柱填料，以甲醇-水、乙腈-水或甲醇、乙腈與緩沖液組成的溶液為流動相，以紫外監(jiān)測器、熒光檢測器或電化學監(jiān)測器為檢測手段，這種色譜體系在肽類、氨基酸、蛋白質和多糖等定量分析中應用廣泛。 示例 生白能的RP-HPLC法測定 活性成分為重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，

2、一種蛋白質。 磷酸緩沖溶液：Na2HPO43.55g加水400ml，溶解后用稀磷酸調pH到7.0加水至500ml，搖勻。 色譜條件、計算 (見書P331) 討論：tR21.236min峰為生白能的主成分，tR13.639min峰為人血白蛋白（生白能添加劑）主成分與添加劑的分離度R2.0。采用梯度洗脫，流動相中加入三氟乙酸，增大了對蛋白質的洗脫力，且使主成分鋒形尖銳、對稱。（2）高效離子交換色譜法（HPIEC）： 是蛋白質、多肽分離分析常見的方法，具有以下特點： 1）根據(jù)相應的離子化程度對蛋白質、多肽進行分離。 2）梯度洗脫法是以鹽濃度增大而進行的分離過程。 3）柱效中等并具有較高質量的活性回收

3、。（3）高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）： HPGFC柱上填充著微粒狀的具有親水性表面組成的有機物載體，或表面性質得到改造的硅膠類物質，可用于多肽和蛋白質等的分離及其分子量測定。 示例 HPGFC法測定重組人腫瘤壞死因子衍生物 的分子量標準蛋白分子量曲線的制備：醛縮酶、血清白蛋白、碳酸酐酶和抑蛋白酶肽制成混合標樣，加入右旋糖酐藍和酪氨酸作為內標，進樣后可同時測得完全進入填料空隙的兩種內標的保留時間T0和Tt，用分配系數(shù)對分子量作圖13-4 樣品測定：根據(jù)樣品的保留時間求出其分配系數(shù)，由分配系數(shù)從標準蛋白分子量曲線上查出相應的分子量對數(shù)。2、灌注色譜法（1）基本理論： 傳統(tǒng)的液相色譜法：流動相流

4、經(jīng)介質顆粒間隙，介質顆粒內部接擴散作用進行，需在低流速下進行，以維持一定的容量和分辨率，因而分離時間長；流速增大時，介質顆粒間隙被縮短，系統(tǒng)壓力上升，介質內擴散難以有效進行，導致分辨率和容量的急速下降而不能得到滿意的分離效果。 灌注色譜法：其介質為在聚苯二乙烯苯高度交聯(lián)的基礎結構上構成的貫穿孔顆粒分離介質（POROS）。其為雙模式孔結構。 樣品由流動相直接灌注入介質顆粒中，擴散作用不再是主要的了。且由于顆粒內部表面積大幅度增加，容量和分辨率也隨之提高。因此在高流速下，由于流動相流通路大幅度增加，故壓力稍有上升，從而打破了傳統(tǒng)的流速與柱容量、分辨率三者間的關系，使生物活性大分子如生化藥物和基因工程藥物的快速分離純化和快速分析成為可能。（2）應用： 蛋白質類、肽類和多聚核苷酸類等基因工程藥物，如促紅細胞省長蘇、干擾素、白介素、集落刺激因子、組織型纖溶酶原激活劑、單克隆抗體等；酶類如溶菌酶、核糖核酸酶、超氧化物歧化酶等；天然藥物成分如多糖類、低聚糖等；合成肽和其他生化藥物如細胞色素、前列腺素等，應用灌注色譜法進行分離純化和分析結果均滿意。 3、高效毛細管電泳法 HPCE ：在多肽分離方面具有高效、快速等優(yōu)點。 原理：根據(jù)帶電組分在管中由于其所帶電荷和分子量的大小，即荷質比不同產(chǎn)生不同的遷移速度而進行分離。 毛細管電泳技術提供了與HPLC法完全不同的選