(修改)實(shí)驗(yàn)四Hb的醋酸纖維薄膜電泳與血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳

1、v電泳電泳：指帶電膠體粒子或分子在電場的作：指帶電膠體粒子或分子在電場的作用下，作定向移動。用下，作定向移動。v 由于各種物質(zhì)分子的等電點(diǎn)不同、分由于各種物質(zhì)分子的等電點(diǎn)不同、分子量、分子結(jié)構(gòu)不同，形狀大小各有差異子量、分子結(jié)構(gòu)不同，形狀大小各有差異，所以在同一，所以在同一P環(huán)境中所帶的電荷量各環(huán)境中所帶的電荷量各有不同，因此在同一電場中泳動速度也就有不同，因此在同一電場中泳動速度也就不同。一般來說，所帶的電荷多而分子量不同。一般來說，所帶的電荷多而分子量、形狀小者，泳動速度快，反之則慢。、形狀小者，泳動速度快，反之則慢。v 1）顯微電泳顯微電泳即在顯微鏡下觀即在顯微鏡下觀察膠體粒子或細(xì)胞的移

2、動度，也稱細(xì)察膠體粒子或細(xì)胞的移動度，也稱細(xì)胞電泳。胞電泳。 2）自由電泳自由電泳即懸浮在介質(zhì)中即懸浮在介質(zhì)中的細(xì)胞和生物大分子，在有電場作用的細(xì)胞和生物大分子，在有電場作用下自由定向移動。下自由定向移動。v 3）區(qū)域電泳區(qū)域電泳（區(qū)帶電泳）：即（區(qū)帶電泳）：即在不同電力條件、支持物上進(jìn)行直接在不同電力條件、支持物上進(jìn)行直接分離，鑒定生物物質(zhì)，促使獲得各自分離，鑒定生物物質(zhì)，促使獲得各自電荷差異的生物粒子或分子形成各自電荷差異的生物粒子或分子形成各自區(qū)域以帯形停留在載體上。如：濾紙區(qū)域以帯形停留在載體上。如：濾紙、淀粉、瓊脂、纖維素、聚丙烯酰胺、淀粉、瓊脂、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠等，此類凝膠等

3、，此類 電泳技術(shù)分離技巧簡便電泳技術(shù)分離技巧簡便，運(yùn)用十分廣泛。，運(yùn)用十分廣泛。 4）免疫電泳免疫電泳：即抗原與抗體在比：即抗原與抗體在比例合適的瓊脂糖載體中相結(jié)合的一種例合適的瓊脂糖載體中相結(jié)合的一種電免疫技術(shù)，親和電泳即屬此類。電免疫技術(shù)，親和電泳即屬此類。v1.1.連續(xù)系統(tǒng)連續(xù)系統(tǒng)：電泳：電泳緩沖緩沖液的離子成分、液的離子成分、PHPH、電位梯度與制膠（或浸膜）緩沖液相同、電位梯度與制膠（或浸膜）緩沖液相同，帶電顆粒電泳時僅具有，帶電顆粒電泳時僅具有電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)、分子分子篩效應(yīng)篩效應(yīng)。 2 2. .不連續(xù)系統(tǒng)不連續(xù)系統(tǒng)：電泳：電泳緩沖緩沖液離子成分、液離子成分、pHpH、電位梯度與制

4、膠（或浸膜）緩沖液不盡、電位梯度與制膠（或浸膜）緩沖液不盡相同，相同，帶電顆粒電泳時具有帶電顆粒電泳時具有濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)、電電荷效應(yīng)荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)。1.掌握醋酸纖維薄膜電泳的操作掌握醋酸纖維薄膜電泳的操作 2. 了解血紅蛋白的組成及分類了解血紅蛋白的組成及分類v 血紅蛋白（血紅蛋白（Hb) 的組成及分類的組成及分類： 血紅蛋白（血紅蛋白（Hb)：由亞鐵血紅素、珠蛋白：由亞鐵血紅素、珠蛋白 組成組成 。每個珠蛋白分子由每個珠蛋白分子由4條多肽鏈構(gòu)成條多肽鏈構(gòu)成 ，根據(jù)其一級，根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)的不同可分為結(jié)構(gòu)的不同可分為、四種類型。四種類型。 正常成人Hb種類： 組成 百分含量 pI

5、HbA 22 9598% 6.95HbA2 22 23% 7.38HbF 22 6.95 v在PH8.6的環(huán)境中，Hb是一種帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)（Hb的pI 8.6） ，因此，與醋酸纖維薄膜作支持物，在電場中Hb向陽極泳動。電泳時，由于各種Hb所帶電荷的不同，造成各自的泳動速度不同，因而被分離。這種分離可初步鑒定不同的Hb。v醋酸纖維素薄膜是由纖維素的羧基進(jìn)醋酸纖維素薄膜是由纖維素的羧基進(jìn)行乙?；蠖瞥傻模窈笥芯薮笮幸阴；蠖瞥傻?，浸濕后有巨大的張力和柔韌性，幾乎對所有生物活的張力和柔韌性，幾乎對所有生物活性物質(zhì)均能通過電泳作用得到分離。性物質(zhì)均能通過電泳作用得到分離。v醋酸纖維素薄膜電泳

6、因設(shè)備簡單、操醋酸纖維素薄膜電泳因設(shè)備簡單、操作方便、電泳時間短、分辨率高、區(qū)作方便、電泳時間短、分辨率高、區(qū)帶分離清晰、無拖尾、易定量等，已帶分離清晰、無拖尾、易定量等，已成為臨床、實(shí)驗(yàn)室首選的方法成為臨床、實(shí)驗(yàn)室首選的方法。v1.取血取血：用碘伏及：用碘伏及75%酒精棉球消毒手指尖，酒精棉球消毒手指尖，采血針穿刺采血針穿刺,取血約取血約0.05ml放入放入1.5mlEP管管中，并輕輕搖勻。中，并輕輕搖勻。v2.制備制備Hb液液：v 1）洗滌紅細(xì)胞：加）洗滌紅細(xì)胞：加0.9%NaCl 1 ml于上于上述管中，顛倒混勻述管中，顛倒混勻5-6次，次，3000rpm/分，離分，離心心3分鐘，棄上清

7、液。重復(fù)以上操作一次。分鐘，棄上清液。重復(fù)以上操作一次。v 2）溶血：向紅細(xì)胞沉淀中加入蒸餾水）溶血：向紅細(xì)胞沉淀中加入蒸餾水2滴，搖勻，再加入滴，搖勻，再加入CCl42滴，充分搖勻，滴，充分搖勻， 4000rpm/分，離心分，離心3分鐘分鐘,取上清液備用。取上清液備用。v3. 電泳電泳v 1）膜條準(zhǔn)備：提前）膜條準(zhǔn)備：提前2小時把膜條浸泡在小時把膜條浸泡在浸膜緩沖液中待用。浸膜緩沖液中待用。v 2）點(diǎn)樣：把膜條從緩沖液中取出，夾）點(diǎn)樣：把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的液體，然后平在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的液體，然后平鋪在濾紙上（鋪在濾紙上（毛面朝上毛面朝上），用小玻片沾取），用

8、小玻片沾取適量適量Hb液，按印于點(diǎn)樣線上。液，按印于點(diǎn)樣線上。v 3）電泳：在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，將）電泳：在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，將膜條平懸于電泳槽支架的濾紙橋上。膜條膜條平懸于電泳槽支架的濾紙橋上。膜條點(diǎn)樣面向下，光滑面向上。點(diǎn)樣的一端靠點(diǎn)樣面向下，光滑面向上。點(diǎn)樣的一端靠近負(fù)極。用浸泡在緩沖液中的紗布分別蓋近負(fù)極。用浸泡在緩沖液中的紗布分別蓋住膜條的兩端，使膜條兩端與緩沖液相連。住膜條的兩端，使膜條兩端與緩沖液相連。蓋嚴(yán)電泳室，通電，平衡蓋嚴(yán)電泳室，通電，平衡5-10分鐘，調(diào)節(jié)分鐘，調(diào)節(jié)電壓為電壓為100V，電泳，電泳30分鐘。分鐘。v 4）染色：電泳完畢后將膜條取下并放）染色：電泳完畢后

9、將膜條取下并放在麗春紅染色液中浸泡在麗春紅染色液中浸泡10 分鐘。分鐘。v4. 漂洗漂洗：將膜條從染色液中取出后放至漂：將膜條從染色液中取出后放至漂洗液中漂洗洗液中漂洗2-3次，使背景為白色即可，這次，使背景為白色即可，這樣就得到清晰的電泳圖譜。樣就得到清晰的電泳圖譜。v醋酸纖維素薄膜堿性電泳，正常醋酸纖維素薄膜堿性電泳，正常情況下可分離出情況下可分離出4條區(qū)帶。它們分條區(qū)帶。它們分別是：別是：（+）（-）v HbAHbA2CACAv觀察膜條上觀察膜條上Hb條帶的位置及顏色的深條帶的位置及顏色的深淺淺。v五、思考題：五、思考題：(Questions)v 電泳分離蛋白質(zhì)的原理是什么？電泳分離蛋白

10、質(zhì)的原理是什么？血紅蛋白病：指珠蛋白肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生異變。異常血紅蛋白：指珠蛋白鏈中一個或數(shù)個氨 基酸被置換、缺失或增加，造成血紅蛋白結(jié)構(gòu)及功能異常，導(dǎo)致一系列病理和生理改變。 人類異常血紅蛋白高達(dá)兩千多種類型，約300人中即有一人是異常血紅蛋白攜帶者。因此，在臨床上快速、早期診斷尤為重要。v醋酸纖維素薄膜電泳，為異常血紅蛋白的醋酸纖維素薄膜電泳，為異常血紅蛋白的篩選、診斷提供了可靠的途徑和依據(jù)。篩選、診斷提供了可靠的途徑和依據(jù)。v地中海貧血即是異常血紅蛋白的典型病例地中海貧血即是異常血紅蛋白的典型病例.v一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?（Experimental Objectives）：）： 1. 掌

11、握血清脂蛋白測定的臨床意義掌握血清脂蛋白測定的臨床意義; 2.了解血清脂蛋白電泳的基本原理及操了解血清脂蛋白電泳的基本原理及操 作方法作方法。 1. 按電泳法分 乳糜微粒（CM） -脂蛋白 前-脂蛋白 -脂蛋白 乳糜微粒 (CM) ( 0.96 )極低密度脂蛋白（VLDL) (0.961.006)中間密度脂蛋白 (IDL) (1.0061.019)低密度脂蛋白 （LDL） (1.0191.063)高密度脂蛋白 （HDL） (1.0631.21) v血清中的脂類物質(zhì)，都是以不同的比例與血清中的脂類物質(zhì)，都是以不同的比例與蛋白質(zhì)（載脂蛋白）結(jié)合成脂蛋白而存在。蛋白質(zhì)（載脂蛋白）結(jié)合成脂蛋白而存在。

12、在在PH8.6的緩沖液中，脂蛋白均帶負(fù)電荷，的緩沖液中，脂蛋白均帶負(fù)電荷，在電場中移向正極。各種脂蛋白因其所帶在電場中移向正極。各種脂蛋白因其所帶有的電荷量以及顆粒大小、形狀等不同，有的電荷量以及顆粒大小、形狀等不同，在電場中泳動的速度也不一樣，故可將其在電場中泳動的速度也不一樣，故可將其分離，用不同方法顯色便可以進(jìn)行定性、分離，用不同方法顯色便可以進(jìn)行定性、定量分析。定量分析。v用瓊脂糖凝膠作支持物進(jìn)行電泳時，先將用瓊脂糖凝膠作支持物進(jìn)行電泳時，先將血清用蘇丹黑血清用蘇丹黑B（脂類染料）預(yù)染，使脂（脂類染料）預(yù)染，使脂蛋白著色，經(jīng)電泳后可將血清脂蛋白分成蛋白著色，經(jīng)電泳后可將血清脂蛋白分成三

13、條清晰的區(qū)帶，可用光密度計(jì)掃描定量。三條清晰的區(qū)帶，可用光密度計(jì)掃描定量。v1預(yù)染血清：預(yù)染血清：取小試管一只，加入血清取小試管一只，加入血清0.2ml及蘇丹黑及蘇丹黑B染料液染料液0.02ml，混勻后置，混勻后置于于37C水浴中預(yù)染水浴中預(yù)染30分鐘備用。分鐘備用。（這一步（這一步由老師提前做好，同學(xué)免做）由老師提前做好，同學(xué)免做）v2.制備瓊脂糖膠板：制備瓊脂糖膠板：0.45%的瓊脂糖凝膠溶的瓊脂糖凝膠溶解后，將凝膠溶液均勻灌注于制膠板上，厚解后，將凝膠溶液均勻灌注于制膠板上，厚約約0.5cm，靜置約半小時后凝固。此時，小，靜置約半小時后凝固。此時，小心取出上樣梳，凝膠板上出現(xiàn)小凹槽即上樣

14、心取出上樣梳，凝膠板上出現(xiàn)小凹槽即上樣孔?？住3.點(diǎn)樣點(diǎn)樣：用微量加樣器吸取預(yù)染血清：用微量加樣器吸取預(yù)染血清15l，注入上述凹槽內(nèi)。注入上述凹槽內(nèi)。v4.電泳電泳：將點(diǎn)樣的凝膠板放于電泳槽中，：將點(diǎn)樣的凝膠板放于電泳槽中，點(diǎn)樣端置于負(fù)極，平衡點(diǎn)樣端置于負(fù)極，平衡5分鐘。接通電源，分鐘。接通電源，調(diào)電壓調(diào)電壓100V，約，約45分鐘，看到各區(qū)帶已分分鐘，看到各區(qū)帶已分開，即可關(guān)掉電源，取出凝膠板。開，即可關(guān)掉電源，取出凝膠板。v肉眼觀察各區(qū)帶的顏色深淺寬窄及其肉眼觀察各區(qū)帶的顏色深淺寬窄及其v排列順序，繪圖記錄之。排列順序，繪圖記錄之。v1. 正常人血清脂蛋白瓊脂糖電泳，可正常人血清脂蛋白瓊脂糖電泳，可分離出三條區(qū)帶，從正極到負(fù)極依次分離出三條區(qū)帶，從正極到負(fù)極依次為為-脂蛋白、前脂蛋白、前-脂蛋白和脂蛋白和-脂蛋白脂蛋白，原點(diǎn)處應(yīng)無乳糜微粒。，原點(diǎn)處應(yīng)無乳糜微粒。 2. 參考值：參考值：v -脂蛋白：