阿托品拮抗豚鼠回腸M受體的pA2測定

1、實(shí)驗(yàn)六 阿托品拮抗豚鼠回腸M受體的pA2測定 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 通過實(shí)驗(yàn)了解離體平滑肌基本實(shí)驗(yàn)方法； 2. 觀察阿托品對豚鼠回腸M受體競爭性拮抗作用。實(shí)驗(yàn)動物 豚鼠，體重300g左右，雄性。實(shí)驗(yàn)藥品 1.乙酰膽堿（2*10-5,2*10-4,2*10-3,2*10-2，2*10-1,2mol/L） 2.阿托品 （5*10-5,5*10-4,5*10-3mol/L） 3.臺氏液實(shí)驗(yàn)器材 100ul微量注射器、培養(yǎng)皿、眼科鑷、持針器、縫針、縫線、洗瓶、吸管、肌力換能器、HSS-1(B)型恒溫浴槽、RM6240生物信號采集處理系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)方法1. 儀器安裝調(diào)試：（1） 搭建好儀器后，打開水浴鍋電源，使浴

2、槽溫度保持在37，清洗水浴槽后，加入臺氏液20ml，通氣，使氣泡呈碎花狀釋放；（2） 啟動計算機(jī)，雙擊RM6240生物信號采集處理系統(tǒng)，打開“阿托品拮抗豚鼠回腸M受體的pA2測定”，設(shè)置好實(shí)驗(yàn)參數(shù)，使軟件處于示波狀態(tài)。2. 標(biāo)本準(zhǔn)備：取豚鼠回腸22.5cm，（制備詳見附錄），用絲線將腸管對角結(jié)扎（不要封閉腸腔），一端固定在浴槽的通氣鉤上，另一端垂直連接于肌力換能器的感應(yīng)片上，調(diào)節(jié)基礎(chǔ)張力約為0.5g。腸管在槽內(nèi)穩(wěn)定15min后，記錄正常收縮活動。3. 觀察項(xiàng)目：（1） 未加阿托品時每個ACh累集濃度引起的腸管最大收縮幅度；（2） 分別加入阿托品（3個濃度）后，每個ACh累加濃度引起的腸管最大收

3、縮幅度。4. 給藥方案：（1） 用微量注射器或微量加樣槍像麥?zhǔn)显〔蹆?nèi)從低到高加入ACh以累加摩爾濃度（mol/L）遞增，當(dāng)每個濃度引起腸管收縮反應(yīng)達(dá)到最大時，立即累加另一個濃度，直到收縮反應(yīng)不再增加，即達(dá)最大反應(yīng)，制作ACh量效曲線；（2） 用臺氏液沖洗標(biāo)本35次，穩(wěn)定10min后，加入5*10-5mol/L的阿托品20ul，使其終濃度為5*10-8mol/L，重復(fù)步驟（1）；（3） 上述離體回腸經(jīng)沖洗恢復(fù)正常后，加入5*10-4mol/L的阿托品20ul，使其終濃度為5*10-7mol/L，重復(fù)步驟（1）；（4） 上述離體回腸經(jīng)沖洗恢復(fù)正常后，加入5*10-3mol/L的阿托品20ul，使其

4、終濃度為5*10-6mol/L，重復(fù)步驟（1）。5. 數(shù)據(jù)處理（1） 數(shù)據(jù)保存實(shí)驗(yàn)結(jié)束，點(diǎn)擊“停止示波”，保存文件，對文件進(jìn)行編輯，選擇預(yù)覽鍵刪除不需要的頁面，注意應(yīng)另外備份一份原始數(shù)據(jù)以防編輯時發(fā)生錯誤而丟失數(shù)據(jù)。使用“反演”鍵選擇適當(dāng)?shù)挠涗涍M(jìn)行編輯，若太長，可調(diào)節(jié)通道右側(cè)“掃描速度”鍵，將波形壓密。點(diǎn)擊“分析”欄，選擇“區(qū)域測量”，測量每個ACh累計濃度下腸管收縮引起基線上移的累積高度。所得結(jié)果列于表中，以ACh引起最大收縮高度為分母，求每個ACh濃度下收縮高度與最大收縮高度的比值E/EMAX。在“文件”欄中選擇“打印模式設(shè)計”欄的“當(dāng)前整體打印”、“學(xué)生實(shí)驗(yàn)”；“實(shí)驗(yàn)”欄的“實(shí)驗(yàn)信息”，

5、輸入院系（姓名）、班級和學(xué)號，編輯完成后，使用“預(yù)覽打印”進(jìn)行檢查，確認(rèn)無問題后打印結(jié)果。（2） 結(jié)果處理A 繪制乙酰膽堿累積量效關(guān)系曲線：以乙酰膽堿引起的最大收縮幅度為100%，計算加入不同劑量乙酰膽堿后的張力變化百分率填入表一，并以此為縱坐標(biāo)，以乙酰膽堿的摩爾濃度為橫坐標(biāo)，作圖畫出量效曲線，并求出每條ACh量效曲線的EC50；根據(jù)改良的Linewaver-Burk公式可知C/E=KD/Emax+1/EmaxC.(1)以ACh濃度C為X，以每個ACh濃度與其引起收縮強(qiáng)度的比值c/E為Y，進(jìn)行直線回歸，求出每條ACh量效曲線的直線回歸方程Y=a+bX根據(jù)公式（1）可知，a/b=KD/Emax*

6、Emax=KD（此處KD相當(dāng)于EC50，由此可得在阿托品濃度為0、5*10-8、5*10-7、5*10-6mol/L的ACh量效曲線的EC50值分別為EC50a, EC50b, EC50c, EC50d。B 求出每個阿托品濃度下的AChEC50 與無阿托品時AChEC50的比值。X1= EC50b /EC50a, X2= EC50c /EC50a, X3= EC50d/EC50a C.找出阿托品的PA2 根據(jù)Schild方程 PAX=-lgB-lg(Xi-1) 當(dāng)X=2時，lg(Xi-1)=0, 此時-lgB=PA2 因此可用Schild作圖法求PA2,比單點(diǎn)法更準(zhǔn)確：以lg(Xi-1)為縱坐

7、標(biāo)，阿托品濃度負(fù)對數(shù)-lgB為橫坐標(biāo)作圖，將每個-lgB對應(yīng)的lg(Xi-1)值的連線與橫軸的交點(diǎn)即為PA2值。表一 乙酰膽堿累積給藥及張力變化Ach濃度 加藥量 Ach終濃度 負(fù)對數(shù) 加入阿托品后張力變化E/Emax(%)（mol/L） ul （mol/L） （-log） 0 5*10-8 5*10-7 5*10-62*10-5 10 10-8 8 21.3 50.0 26.4 19.3 20 3* 10-8 7.5 28.2 49.1 29.7 19.1 70 10-7 7 46.6 53.0 29.0 17.72*10-4 20 3*10-7 6.5 52.1 53.3 28.7 17.

8、0 70 10-6 6 61.4 50.8 24.4 13.92*10-3 20 3* 10-6 5.5 61.7 48.9 21.2 12.0 70 10-5 5 73.3 46.4 19.0 11.82*10-2 20 3*10-5 4.5 75.1 57.4 18.2 11.8 70 10-4 4 90.5 70.3 28.5 12.42*10-1 20 3* 10-4 3.5 100 69.1 33.3 12.7 70 10-3 3 99.4 73.6 34.9 23.12 20 3*10-3 2.5 100 90.8 81.0 57.2圖一 阿托品對Ach量效曲線影響根據(jù)公式 C/E

9、=KD/Emax+1/EmaxC，進(jìn)行直線回歸，得到下表表二直線回歸方程項(xiàng)目直線回歸方程R乙酰膽堿Y= 0.2966X + 9E-061阿托品濃度1+乙酰膽堿Y= 0.3315X + 9E-050.9942阿托品濃度2+乙酰膽堿Y= 0.3929X + 0.00050.8602阿托品濃度3+乙酰膽堿Y= 0.5616X + 0.00120.7938根據(jù) a/b=KD/Emax*Emax=KD，KD相當(dāng)于EC50,由此得到四個EC50值： EC50a=3*10-5 EC50b=2.7*10-4 EC50c=1.3*103 EC50d=2.1*10-3求出每個阿托品濃度下的AChEC50 與無阿托

10、品時AChEC50的比值: X1= EC50b /EC50a=8.95 X2= EC50c /EC50a=41.94 X3= EC50d/EC50a=70.42根據(jù) Schild方程 PAX=-lgB-lg(Xi-1) 作圖求pA2：圖二Schild方程求pA2所以：pA2=8.1363/1.9536=4.165 實(shí)驗(yàn)討論由公式：藥物效應(yīng)E=A/(A+KD)*Emax*a可知：1、 a=1 表示有較強(qiáng)的內(nèi)在活性，為受體的完全激動劑；2、 0a1表示無內(nèi)在活性不強(qiáng)，為部分激動劑；3、 a=0 則表示無內(nèi)在活性，與受體結(jié)合其拮抗激動劑的作用乙酰膽堿能夠作用于回腸平滑肌M3受體，引起平滑肌收縮，在肌力換能器上就表現(xiàn)為回腸的張力增大。當(dāng)加入M受體拮抗劑阿托品后，若提高乙酰膽堿濃度，仍能達(dá)到未加拮抗劑前的最大反應(yīng)，在以乙酰膽堿的摩爾濃度的負(fù)對數(shù)為橫坐標(biāo)，以張力變化百分率為縱坐標(biāo)的量效曲線中則表示為量效曲線平行左移，表明阿托品對乙酰膽堿呈競爭性拮抗。pA2是一種用以表示競爭性拮抗劑作用強(qiáng)度的指標(biāo)，其意義是能使激動劑提高到原來的2倍時，產(chǎn)生與原來濃度相