國外全自動沙眼衣原體及淋球菌核酸雙檢技術(shù)新進(jìn)展

1、國外全自動沙眼衣原體及淋球菌核酸雙檢技術(shù)新進(jìn)展沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis,CT)和淋球菌(Neisseriagonorrhoeae,NG)是全球最主要的性傳播疾病的病原體。美國CDCffi薦16-25歲的年輕女性每年進(jìn)行CT的篩查。我國從2008年已經(jīng)開始對CT感染進(jìn)行單獨報病，而NG是我國法定上報的傳染病。CT和NG的共感染現(xiàn)象非常普遍，因此研發(fā)的診斷技術(shù)平臺也通常是檢測兩種病原體。最先發(fā)展起來的CT和NGK酸檢測技術(shù)是直接檢測核酸技術(shù)(NAH:包括Gen-probe公司的PACE2PACE2c和Digene公司的雜交捕獲HC2但是NAH的方法其敏感性遠(yuǎn)不如核酸擴(kuò)增

2、技術(shù)。隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)，這類方法逐步被取替而失去其應(yīng)用價值。截止目前為止，美國FDA批準(zhǔn)共五家公司的商品化試劑用于檢測泌尿生殖道的CT和NG感染檢測，分別是羅氏的AmplicorCT/NG、Cobas4800,雅培公司的RealTimeCT/NG,Gen-probe的APTIMACombo2(AC2,BectonDikinson(BD)公司的ProbeTecETCT/GCProbeTecETCTQx/GCQx和Cepheid公司的GeneXpertCT/NG。羅氏公司AmplicorCT/NG產(chǎn)品用于檢測CT的靶目標(biāo)基因位于CT隱蔽的質(zhì)粒基因上，而用于檢測NG的靶目標(biāo)基因則是DNA

3、74;喀咤甲基轉(zhuǎn)移酶基因，擴(kuò)增后的產(chǎn)物檢測則基于生物素-親和素的交互作用利用ELISA的方法進(jìn)行。該方法由于不能夠檢測出瑞典瑞典的CT新變種，現(xiàn)在該公司已出新的產(chǎn)品Cobas4800CT/NG以取代該產(chǎn)品。Cobas4800CT/NG檢測試劑盒在全自動的平臺基礎(chǔ)上完成實時定量PCR勺檢測全部步驟。該試劑利用兩個靶基因檢測CT,一個位于隱蔽質(zhì)粒上，另外一個靶基因位于編碼主要外膜蛋白的ompA可以保證能夠檢測瑞典的CT新變種2。而用于檢測NG的靶基因則分別位于正向重復(fù)序列9(DR9)及其DR9突變區(qū)上。該產(chǎn)品通過全自動化的處理，可有效的預(yù)防實驗過程中的人為污染，可在8小時內(nèi)完成高達(dá)278份的樣本量

4、。目前該產(chǎn)品可應(yīng)用于陰道拭子，宮頸拭子、尿液等標(biāo)本。而該產(chǎn)品應(yīng)用于液基細(xì)胞學(xué)還在評估當(dāng)中。研究者利用已上市的Gen-probe的AC2和BectonDikinson公司的ProbetecETCTQx/GCQx的產(chǎn)品作為參評試劑，多中心評價Roche的Cobas4800CT/NG產(chǎn)品的性能，以患者的患病狀態(tài)作為診斷的標(biāo)準(zhǔn)，該產(chǎn)品的敏感性和特異性的結(jié)果見表一。圖一：羅氏的Cobas4800檢測系統(tǒng)表一：羅氏的Cobas4800檢測CT和NG的臨床特性敏感性對照試劑特異性對照試劑量在本奐型C4800AC2CTQC4800AC2GCQ獻(xiàn)CT4316宮頸拭子91.696.695.199.899.299.

5、714316女性尿液92.395.894.899.899.599.814248陰道拭子92.9NDND99.7NDND2768男性尿液97.696.898.499.598.999.23NG4316宮頸拭子95.610094.310010099.814316女性尿液98.596.9979799.999.914248陰道拭子98.5NDND100NDND2768男性尿液10010010099.710099.73C4800,羅氏的Cobas4800;AC?Gen-probe的APTIMACombo2;CTQGCQ為BD公司的ProbetecETCTQx/GCQx;ND文獻(xiàn)中沒有提及該數(shù)據(jù)。雅培公司R

6、ealTimeCT/NG產(chǎn)品依賴于m2000全自動系統(tǒng)。該產(chǎn)品目前也包含了CT的兩個靶基因，其中一個位于隱蔽質(zhì)粒上，另一對引物同樣是為了保證能夠檢測瑞典的CT新變種而選用的ompA基因的一段保守序列；而用于檢測NG的引物位于Opa基因上。該產(chǎn)品所用對照是在DNA提取步驟中加入的，可以用以評價提取的效率和潛在的PCR卬制。該系統(tǒng)可以在8小時內(nèi)一次處理96個樣品，檢測186個樣品。GaydosCA等通過多中心的臨床試驗評估了雅培公司的RealTimeCT/NG產(chǎn)品，研究中共采集16個地區(qū)共3832例患者的標(biāo)本，選用已上市的Gen-probe的AC2和BectonDikinson公司的Probete

7、cETCT/GC的產(chǎn)品作為參評試劑，以患者的患病狀態(tài)作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，研究發(fā)現(xiàn)RealTimeCT/NG產(chǎn)品檢測CT的敏感性和特異性分別為92.4%和99.2%,NG的敏感性和特異性分別為96.9%和99.7%。圖二：雅培的m2000檢測系統(tǒng)Gen-probe公司生產(chǎn)的AC2是利用轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增特異性的靶rRNA序列，旨在減少或消除擴(kuò)增抑制，通過磁珠法提取核甘酸，然后轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增CT的23SrRNA和NG的16SrRNA,將擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)記的寡核甘酸探針雜交，通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行檢測。擴(kuò)增的過程恒溫，操作較簡便。該產(chǎn)品可在TIGRIS系統(tǒng)上實現(xiàn)自動化（見圖三），可在8小時內(nèi)檢測多達(dá)500份的樣品。為了獲得更高

8、的特異性，廠家建議對陽性的標(biāo)本進(jìn)行CT的16SrRNA和NG的16SrRNA（另外一個序列）進(jìn)行再檢測。該產(chǎn)品和BD公司的產(chǎn)品已是較為老牌的上市產(chǎn)品，新的產(chǎn)品上市前的試劑評估通常選用這兩家的產(chǎn)品，其檢測敏感性和特異性在前文已經(jīng)有表述，在此不再贅述。圖三：Gen-probe公司的TIGRIS系統(tǒng)BD公司生產(chǎn)的ProbetecET是美國FDA第一個批準(zhǔn)的實時定量檢測這兩類病原體的產(chǎn)品。該技術(shù)以等溫（溫度為52.5C）鏈置換擴(kuò)增（SDA技術(shù)為基礎(chǔ)。該產(chǎn)品選用CT的隱蔽質(zhì)粒和NG的菌毛反相蛋白同系物（PivNg）序歹U為靶目標(biāo)基因，利用熒光探針檢測擴(kuò)增后產(chǎn)物。該產(chǎn)品利用擴(kuò)增后的產(chǎn)物不暴露在環(huán)境中以盡可

9、能減少潛在的環(huán)境污染，但是無法降低在擴(kuò)增前攜帶進(jìn)去的污染。BD公司目前已經(jīng)研發(fā)了新一代的產(chǎn)品CTQx/GCQx可在Viper系統(tǒng)實現(xiàn)自動化（見圖四）。使用BDViper系統(tǒng)（采用XTR技術(shù)）進(jìn)行測tO寸，BDProbeTecCTQx/GCQxDNA擴(kuò)增檢驗會利用BD的專利氧化鐵、FOX?Extraction和鏈轉(zhuǎn)移擴(kuò)增技術(shù)對CT和NG進(jìn)行直接定性檢驗。該系統(tǒng)利用雙化學(xué)擴(kuò)增檢測系統(tǒng)可同時用來檢測CT和NG該產(chǎn)品在8小時工作時間內(nèi)可分析278個樣品。XTR圖四：BD公司的Viper系統(tǒng)CepheidGeneXpertCT/NG是最近剛被FDA批準(zhǔn)的體外定量檢測CT和NG的分子診斷技術(shù)，該技術(shù)首次使

10、同時感染CT/NG兩種病原體的患者可在同一天內(nèi)得到診斷和治療。該試劑選用NG基因組染色體DNA±兩個相對保守且不相連的基因作為檢測NG的靶基因，選用CT染色體基因作為CT的靶基因，并選用細(xì)胞看家基因作為樣品對照基因，該對照基因不要求完整的細(xì)胞只需要有樣本含有DNA即可。該產(chǎn)品是通過模塊筒為基礎(chǔ)的平臺對子宮頸拭子、陰道拭子和尿液標(biāo)本的DNA進(jìn)行基因組DNA勺純化、濃縮、檢測和并利用硅法暴露多重基因靶標(biāo)，然后進(jìn)行實時定量PCR勺方法進(jìn)行檢測，可在2小時之內(nèi)對1-96個標(biāo)本進(jìn)行處理分析，可以最大程度的減少處理的步驟和污染的可能。該全自動系統(tǒng)可將樣品準(zhǔn)備、定量PCFT增及熒光檢測集于一體并自

11、動進(jìn)行核酸檢測分析。GaydosCA等通過多中心的臨床試驗評估了Cepheid公司的GeneXpertCT/NG產(chǎn)品，研究中共招募1722例女性患者和1387例男性患者，選用已上市的Gen-probe的AC2和BD司的ProbetecETCT/GC的產(chǎn)品作為參評試劑，以患者的患病狀態(tài)作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示女性宮頸拭子、陰道拭子及尿液檢測CT的敏感性分別為97.4%,98.7%和97.6%,男性尿液檢測的敏感性為97.5%,所有標(biāo)本檢測的特異性均高于99.4%;而女性宮頸拭子、陰道拭子及尿液檢測NG的敏感性分別為100.0%,100.0%及95.6%,男性尿液檢測的敏感性為98.0%,所有標(biāo)本檢

12、測的特異性均高于99.8%14。而該產(chǎn)品應(yīng)用于眼部檢測CT也具有良好的敏感性和特異性。圖五：Cepheid公司的全自動系統(tǒng)目前所有FDA批準(zhǔn)的商業(yè)化核酸檢測產(chǎn)品都僅限用于泌尿生殖道標(biāo)本的臨床診斷，其敏感性和特異性都比較好，其中Genprobe是檢測RNA其余均是DNA僉測。全自動化的系統(tǒng)中，羅氏和雅培的核酸提取和實時定量檢測是在不同的儀器中完成的。其中Genprobe和BD公司是等溫的擴(kuò)增系統(tǒng)，但有樣本量檢測的限制。而Cepheid是目前唯一沒有樣本量限制的，可自由實現(xiàn)1-96個標(biāo)本的檢測。生殖道外的標(biāo)本如直腸和咽部拭子還未被批準(zhǔn)，但是越來越多的證據(jù)顯示核酸擴(kuò)增的檢測技術(shù)在這些部位的敏感性要高于培養(yǎng)。其中主要的原因在于NG核酸檢測