73標記免疫分析

1、17. 3 標記免疫分析標記免疫分析 針對抗原針對抗原-抗體反應缺乏高靈敏的定量檢測抗體反應缺乏高靈敏的定量檢測信號的缺點，人們發(fā)展了在分析體系中引入探信號的缺點，人們發(fā)展了在分析體系中引入探針系統(tǒng)針系統(tǒng)-標記技術的方法，從而開創(chuàng)了微量和超標記技術的方法，從而開創(chuàng)了微量和超微量分析的新天地。微量分析的新天地。標記免疫分析標記免疫分析是將已知抗是將已知抗體或抗原標記上易顯示的物質，通過檢測標記體或抗原標記上易顯示的物質，通過檢測標記物，反映有無抗原物，反映有無抗原-抗體反應，從而間接測定微抗體反應，從而間接測定微量的抗原或抗體。量的抗原或抗體。 2作為一種分析技術，標記免疫分析最早建立于作為一種

2、分析技術，標記免疫分析最早建立于1954年，它是由美國科學家年，它是由美國科學家R.S.Yallow和和S.A.Berson利利用放射同位素用放射同位素125I標記胰島素，并使其與血漿中游標記胰島素，并使其與血漿中游離的胰島素共同競爭有限的胰島素抗體的特異性結離的胰島素共同競爭有限的胰島素抗體的特異性結合位點，最終形成的放射性抗原合位點，最終形成的放射性抗原-抗體復合物與待抗體復合物與待測物含量呈線性負相關，應用測物含量呈線性負相關，應用 -或或 -計數(shù)器進行檢計數(shù)器進行檢測，這種方法稱為測，這種方法稱為放射免疫分析法放射免疫分析法。該方法在當時。該方法在當時及其隨后的及其隨后的20年中是生物

3、分析檢測中最重要的成就年中是生物分析檢測中最重要的成就，R.Yallow由此于由此于1977年獲得了諾貝爾獎。年獲得了諾貝爾獎。 3近年來標記免疫分析飛速發(fā)展，應用不同的標記近年來標記免疫分析飛速發(fā)展，應用不同的標記物，根據(jù)不同原理、不同技術建立起來的檢測方物，根據(jù)不同原理、不同技術建立起來的檢測方法層出不窮。常用的標記物有放射性同位素、酶、法層出不窮。常用的標記物有放射性同位素、酶、熒光素、化學發(fā)光試劑、鑭系稀土元素等。與這熒光素、化學發(fā)光試劑、鑭系稀土元素等。與這些標記物相對應的免疫分析方法分別稱為些標記物相對應的免疫分析方法分別稱為放射免放射免疫分析法疫分析法（RIA）、）、酶聯(lián)免疫吸附

4、測定法酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）、）、熒光免疫分析法熒光免疫分析法（FIA）、）、化學發(fā)光化學發(fā)光免疫分析法免疫分析法（CLIA）、）、時間分辨熒光免疫分析法時間分辨熒光免疫分析法（TrFIA）等多種。）等多種。 4根據(jù)抗原抗體反應后是否需要分離結合的與游離的根據(jù)抗原抗體反應后是否需要分離結合的與游離的標記抗原或標記抗體，標記免疫分析又分為異相標標記抗原或標記抗體，標記免疫分析又分為異相標記免疫分析和均相免疫分析兩大類。記免疫分析和均相免疫分析兩大類。 7. 3. 1 異相標記免疫分析的基本原理異相標記免疫分析的基本原理 異相標記免疫分析異相標記免疫分析是一種需要在檢測前分離是一種需要在

5、檢測前分離游離的標記抗原或標記抗體的方法，它是醫(yī)學檢驗游離的標記抗原或標記抗體的方法，它是醫(yī)學檢驗中常用的方法。中常用的方法。 5盡管目前已發(fā)展了許多涉及異相標記免疫分盡管目前已發(fā)展了許多涉及異相標記免疫分析的方法，在原理上它主要包括兩種：其一析的方法，在原理上它主要包括兩種：其一是利用標記抗原與待測抗原共同競爭有限的是利用標記抗原與待測抗原共同競爭有限的抗體結合位點的抗體結合位點的競爭結合免疫分析競爭結合免疫分析；其二是；其二是標記抗體過量的標記抗體過量的非競爭性免疫分析非競爭性免疫分析。這些方。這些方法均有商品化試劑盒和自動化檢測儀器。法均有商品化試劑盒和自動化檢測儀器。6一、競爭結合免疫

6、分析一、競爭結合免疫分析 這一技術的基本原理是固定抗體的量，通這一技術的基本原理是固定抗體的量，通過待測抗原與標記抗原間的競爭，獲得可測定的過待測抗原與標記抗原間的競爭，獲得可測定的免疫復合物，檢測信號與待測抗原濃度成反比。免疫復合物，檢測信號與待測抗原濃度成反比。任何可逆的特征鍵合蛋白質或細胞受體均可用此任何可逆的特征鍵合蛋白質或細胞受體均可用此法進行分析測定。其過程可用下式表示：法進行分析測定。其過程可用下式表示： Ag AgAb + Ab (7.3) Ag* Ag*Abk1 k2 其中標記抗原其中標記抗原Ag*與抗體與抗體Ab的濃度或總量是固定的濃度或總量是固定已知的，達到平衡時與抗體結

7、合的標記抗原已知的，達到平衡時與抗體結合的標記抗原Ag*的量與樣品中抗原的量與樣品中抗原Ag的量成反比。利用標準曲線的量成反比。利用標準曲線法可以測出待測抗原的量。當然在檢測前需分離法可以測出待測抗原的量。當然在檢測前需分離游離的標記抗原。游離的標記抗原。7二、非競爭免疫分析二、非競爭免疫分析 利用過量的標記抗體與待測抗原形成抗原抗利用過量的標記抗體與待測抗原形成抗原抗體免疫復合物。由于抗體過量，所有待測抗原均形體免疫復合物。由于抗體過量，所有待測抗原均形成絡合物，無需建立反應平衡：成絡合物，無需建立反應平衡：Ag + Ab* AgAb* + Ab* (7.4) 形成的復合物與形成的復合物與A

8、g濃度成正比。最后，分離已復濃度成正比。最后，分離已復合的合的Ab*和游離的和游離的Ab*進行測定。進行測定。 87. 3. 2 均相免疫分析均相免疫分析 均相法的最大特點是結合和未結合的抗原或均相法的最大特點是結合和未結合的抗原或抗體不需物理分離過程即可直接測定，使標記免抗體不需物理分離過程即可直接測定，使標記免疫分析更方便地實現(xiàn)自動化。最常用的體系是酶疫分析更方便地實現(xiàn)自動化。最常用的體系是酶放大免疫技術（放大免疫技術（EMIT），這一方法對小分子），這一方法對小分子（半抗原）如藥物的測定特別有用。（半抗原）如藥物的測定特別有用。 9用酶標記抗原后，酶保持它的生物活性。當酶標抗用酶標記抗原

9、后，酶保持它的生物活性。當酶標抗原與抗體反應后，酶的活性由于空間立體阻礙或構原與抗體反應后，酶的活性由于空間立體阻礙或構象改變而被抑制（圖象改變而被抑制（圖7.7）。）。這種抑制隨著游離抗這種抑制隨著游離抗原濃度的增加而減弱，因而酶的活性及其催化產物原濃度的增加而減弱，因而酶的活性及其催化產物所給出的信號也就越強，利用標準曲線可測定抗原所給出的信號也就越強，利用標準曲線可測定抗原濃度。濃度。 圖圖7.7 酶放大免疫技術檢測原理示意圖酶放大免疫技術檢測原理示意圖 10另一個均相免疫分析體系是利用磷光偏振技術，另一個均相免疫分析體系是利用磷光偏振技術，又稱熒光偏振免疫分析（又稱熒光偏振免疫分析（F

10、PIA）。熒光物質經(jīng)一）。熒光物質經(jīng)一平面的偏振光照射后，可躍入激發(fā)態(tài)，當其釋放平面的偏振光照射后，可躍入激發(fā)態(tài)，當其釋放能量回到基態(tài)時，便發(fā)出偏振熒光。熒光偏振強能量回到基態(tài)時，便發(fā)出偏振熒光。熒光偏振強度與熒光物質受激發(fā)時分子轉動速度成反比。分度與熒光物質受激發(fā)時分子轉動速度成反比。分子越大，旋轉越慢，發(fā)出的偏振光越強。熒光偏子越大，旋轉越慢，發(fā)出的偏振光越強。熒光偏振免疫技術中偏振光強度的變化如圖振免疫技術中偏振光強度的變化如圖7.8所示。所示。11例如，將熒光素標記的小分子藥物和例如，將熒光素標記的小分子藥物和待測藥物一起與該小分子藥物的抗體待測藥物一起與該小分子藥物的抗體混合。若體液

11、中待測未標記的小分子混合。若體液中待測未標記的小分子藥物濃度低，則標記的藥物分子與抗藥物濃度低，則標記的藥物分子與抗體結合的就多，由于抗體分子大，所體結合的就多，由于抗體分子大，所形成的熒光素標記的藥物分子與抗體形成的熒光素標記的藥物分子與抗體的結合物體積亦大，旋轉減慢，熒光的結合物體積亦大，旋轉減慢，熒光偏振光強度就高。反之，熒光偏振光偏振光強度就高。反之，熒光偏振光強度就低。利用所產生的熒光偏振信強度就低。利用所產生的熒光偏振信號與待測物濃度成反比，通過標準曲號與待測物濃度成反比，通過標準曲線可以進行定量分析。線可以進行定量分析。 圖圖7.8 FPIA原理示意圖原理示意圖127. 3. 3

12、 放射免疫分析放射免疫分析 如前文所述，放射免疫分析（如前文所述，放射免疫分析（RIA）是最早）是最早建立的標記免疫分析方法，它是將同位素標記技建立的標記免疫分析方法，它是將同位素標記技術與抗原抗體反應相結合的一種微量分析方法，術與抗原抗體反應相結合的一種微量分析方法，廣泛用于激素、藥物、細胞因子、抗體、腫瘤標廣泛用于激素、藥物、細胞因子、抗體、腫瘤標志物等化合物的定量分析，檢測范圍可達志物等化合物的定量分析，檢測范圍可達10-910-12 ng mL-1，是靈敏、可靠的免疫分析方法之一，是靈敏、可靠的免疫分析方法之一，現(xiàn)已有現(xiàn)已有300多種微量物質用此法測定。多種微量物質用此法測定。 13常

13、用來標記抗原或抗體的同位素有常用來標記抗原或抗體的同位素有125I，131I，3H和和35S。放射活性檢測用液體閃爍計數(shù)，固相體系則。放射活性檢測用液體閃爍計數(shù)，固相體系則用用X射線膠片顯影。射線膠片顯影。 在臨床上將利用放射同位素標記抗原通過競在臨床上將利用放射同位素標記抗原通過競爭法原理進行測定的方法稱為爭法原理進行測定的方法稱為放射免疫分析放射免疫分析（RIA），而將放射性同位素標記抗體，利用夾心），而將放射性同位素標記抗體，利用夾心法檢測的方法稱為法檢測的方法稱為免疫放射分析免疫放射分析（IRMA）。）。14放射免疫分析放射免疫分析的原理是用已知的標記抗原與標本中的原理是用已知的標記抗

14、原與標本中可能存在的抗原競爭一定量的已知抗體，分別形成可能存在的抗原競爭一定量的已知抗體，分別形成標記的抗原抗體結合物（標記的抗原抗體結合物（B）和無標記的抗原抗體）和無標記的抗原抗體結合物（結合物（F）。然后將兩者分離，并根據(jù)測得的放）。然后將兩者分離，并根據(jù)測得的放射性強度，算出結合率射性強度，算出結合率B/（B十十F），它與標本中，它與標本中抗原的量成反比。實驗時除作標本檢測外，還要以抗原的量成反比。實驗時除作標本檢測外，還要以不同濃度的已知抗原參與反應得到的數(shù)據(jù)給出競爭不同濃度的已知抗原參與反應得到的數(shù)據(jù)給出競爭抑制曲線，作為定量分析的依據(jù)。抑制曲線，作為定量分析的依據(jù)。 15免疫放射

15、分析免疫放射分析是將抗體固定在管壁或是將抗體固定在管壁或載體上，待測抗原與固定抗體反應后，載體上，待測抗原與固定抗體反應后，倒掉反應液，生成物抗原倒掉反應液，生成物抗原-抗體復合物抗體復合物留于管底或固定相載體上，再加入標留于管底或固定相載體上，再加入標記抗體，在固相上形成抗原記抗體，在固相上形成抗原-抗體抗體-標記標記抗體的復合物，洗滌后測定放射性強抗體的復合物，洗滌后測定放射性強度，從而推算出標本中抗原的含量。度，從而推算出標本中抗原的含量。這種形成抗原這種形成抗原-抗體抗體-標記抗體的復合物標記抗體的復合物的免疫檢測方法又稱為夾心法，它是的免疫檢測方法又稱為夾心法，它是固相免疫法的一種，

16、其原理如圖固相免疫法的一種，其原理如圖7.9所所示。示。 圖圖7.9 利用夾心法進行利用夾心法進行檢測的免疫放射分析流檢測的免疫放射分析流程圖程圖16標記抗原的放射性同位素有：標記抗原的放射性同位素有：1H、14C、131I和和125I。H和和C的標記較為復雜，而的標記較為復雜，而I的標記比較簡單，且的標記比較簡單，且131I和和125I的半衰期分別是的半衰期分別是8.05天和天和60天，無論是檢天，無論是檢測還是后處理都合適，故在應用中最常用的是放射測還是后處理都合適，故在應用中最常用的是放射性性125I的的射線（射線（0.035 meV）。）。 盡管放射免疫分析具有諸多優(yōu)點，且易于制成盡管

17、放射免疫分析具有諸多優(yōu)點，且易于制成配套試劑盒，實現(xiàn)自動化檢測，并已成為頗具權威配套試劑盒，實現(xiàn)自動化檢測，并已成為頗具權威性的分析方法，但由于放射性同位素的使用帶來了性的分析方法，但由于放射性同位素的使用帶來了污物處理的難題，不僅有可能損害操作人員的健康，污物處理的難題，不僅有可能損害操作人員的健康，而且限制了而且限制了“試劑試劑”的壽命，難以獲得長期穩(wěn)定的的壽命，難以獲得長期穩(wěn)定的檢測標準，在檢測標準，在RIA方法的啟發(fā)下，陸續(xù)發(fā)展了一系方法的啟發(fā)下，陸續(xù)發(fā)展了一系列非放射性的標記免疫分析方法。列非放射性的標記免疫分析方法。 177. 3. 4 酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析 1966年年Eng

18、rall等人將抗原抗體免疫反應和酶等人將抗原抗體免疫反應和酶的高催化作用相結合，用特定的酶標記抗原或抗的高催化作用相結合，用特定的酶標記抗原或抗體，酶催化底物的顯色程度，對待測物進行定性體，酶催化底物的顯色程度，對待測物進行定性或定量測定，建立了或定量測定，建立了酶免疫分析法酶免疫分析法（EIA）。目）。目前，常用的前，常用的EIA法是酶聯(lián)免疫吸附測定法法是酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA），其檢測原理如圖），其檢測原理如圖7.10所示。所示。 18A. 直接法（1）抗體包被（2）抗原包被B. 間接法C. 夾心法（1）直接夾心法（2）間接夾心法：抗原：酶標抗原：抗體：酶標抗體：底物產物圖圖7.1

19、0 ELISA的檢測原理的檢測原理19方法之一是將抗原或抗體吸附于固相載體上，分別方法之一是將抗原或抗體吸附于固相載體上，分別加入檢樣和酶標抗體或酶標抗原進行競爭反應，而加入檢樣和酶標抗體或酶標抗原進行競爭反應，而后利用酶催化其底物顯色反應來進行檢測。該方法后利用酶催化其底物顯色反應來進行檢測。該方法又稱又稱直接法直接法，可用于檢測大分子抗原和小分子抗原，可用于檢測大分子抗原和小分子抗原，也可用于檢測抗體，顯色的深淺與標本中待測抗原也可用于檢測抗體，顯色的深淺與標本中待測抗原或抗體量成反比。以測定抗原為例，待測樣品中的或抗體量成反比。以測定抗原為例，待測樣品中的抗原與酶標抗原競爭與固相抗體結合

20、，待測抗原含抗原與酶標抗原競爭與固相抗體結合，待測抗原含量越多，能與固相抗體結合的酶標抗原就越少，則量越多，能與固相抗體結合的酶標抗原就越少，則顯色越淺。顯色越淺。 20在檢測抗體時，將抗原包被于固相載體，加入待測在檢測抗體時，將抗原包被于固相載體，加入待測血清反應后，洗去未參與反應的無關蛋白成分后，血清反應后，洗去未參與反應的無關蛋白成分后，加入酶標記的抗體（如酶標抗人加入酶標記的抗體（如酶標抗人IgG作為第二抗體）作為第二抗體）或酶標記的抗原，使其與固相載體上抗原待測抗或酶標記的抗原，使其與固相載體上抗原待測抗體復合物反應，在固相載體上形成抗原待測抗體體復合物反應，在固相載體上形成抗原待測

21、抗體酶標記抗體（或抗原待測抗體酶標記抗原）酶標記抗體（或抗原待測抗體酶標記抗原）的復合物，加入底物后，利用顯色反應進行檢測，的復合物，加入底物后，利用顯色反應進行檢測，此法即為此法即為間接法間接法。其中使用酶標記抗原的方法又稱。其中使用酶標記抗原的方法又稱為雙抗原夾心法，它可避免檢樣中多種物質的干擾為雙抗原夾心法，它可避免檢樣中多種物質的干擾而產生假陽性反應。而產生假陽性反應。21由于酶聯(lián)免疫吸附測定的儀器設備價格低廉、操作由于酶聯(lián)免疫吸附測定的儀器設備價格低廉、操作簡便、酶對人和環(huán)境基本無污染，因此在免疫標記簡便、酶對人和環(huán)境基本無污染，因此在免疫標記技術中，該法應用最廣泛。在原有方法基礎上

22、對酶技術中，該法應用最廣泛。在原有方法基礎上對酶標技術加以改良，使眾多新方法如生物素一親和素標技術加以改良，使眾多新方法如生物素一親和素放大系統(tǒng)（放大系統(tǒng)（biotin-avidin system，BAS）和雙表位）和雙表位ELISA應運而生。生物素一親和素放大系統(tǒng)將酶標應運而生。生物素一親和素放大系統(tǒng)將酶標記在生物素或親和素上，借助生物素與親和素的高記在生物素或親和素上，借助生物素與親和素的高度親和力和生物素能與抗體結合的特點應用于度親和力和生物素能與抗體結合的特點應用于ELISA，顯著提高了檢測的敏感性。，顯著提高了檢測的敏感性。 227. 3. 5 熒光免疫分析法熒光免疫分析法 用熒光物

23、質作標記物的免疫分析方法稱為用熒光物質作標記物的免疫分析方法稱為熒光免疫分析法熒光免疫分析法（FIA）。早期的）。早期的FIA建立于建立于1942年，年，Coons等用異硫氰熒光素標記抗體，等用異硫氰熒光素標記抗體，檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖檢查小鼠組織切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。當時由于此種熒光物質標記物的性能抗原。當時由于此種熒光物質標記物的性能較差，未能推廣使用，直至較差，未能推廣使用，直至20世紀世紀50年代末，年代末，Riggs等合成了性能較為優(yōu)良的異硫氰酸熒光等合成了性能較為優(yōu)良的異硫氰酸熒光黃（黃（FITC），并由），并由Marshall等在等在1958年對標年對

24、標記抗體的記抗體的FIA進行了改進，才使免疫熒光技術進行了改進，才使免疫熒光技術逐漸推廣應用。逐漸推廣應用。 23 熒光是由熒光物質的分子吸收光能，而后釋熒光是由熒光物質的分子吸收光能，而后釋放能量，并發(fā)出一種較長波長的光。當一束光放能量，并發(fā)出一種較長波長的光。當一束光投射到熒光物質上，其電子被激發(fā)到較高的能投射到熒光物質上，其電子被激發(fā)到較高的能量水平。而后被激發(fā)的熒光物質釋放光子而回量水平。而后被激發(fā)的熒光物質釋放光子而回復到初始狀態(tài)。在這個過程中丟失了一部分能復到初始狀態(tài)。在這個過程中丟失了一部分能量，因而釋放的光子比激發(fā)光的波長更長。前量，因而釋放的光子比激發(fā)光的波長更長。前后二者波

25、長之差是熒光物質的特征，稱為后二者波長之差是熒光物質的特征，稱為stokes位移位移。 24熒光素是一種能吸收激發(fā)光的光能產生熒光，并能熒光素是一種能吸收激發(fā)光的光能產生熒光，并能作為染料使用的有機化合物，亦稱熒光色素。適用作為染料使用的有機化合物，亦稱熒光色素。適用于抗體標記的熒光素通常是環(huán)狀化合物，具有共軛于抗體標記的熒光素通常是環(huán)狀化合物，具有共軛結構。共軛體系越大，被激發(fā)的分子穩(wěn)定性越大，結構。共軛體系越大，被激發(fā)的分子穩(wěn)定性越大，即熒光增強；分子平面性和硬度越大，熒光傾向較即熒光增強；分子平面性和硬度越大，熒光傾向較大。目前用于標記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒大。目前用于標記抗體的熒

26、光素主要有異硫氰酸熒光黃（光黃（FITC）、四乙基羅丹明（）、四乙基羅丹明（RB200）及四甲基）及四甲基異硫氰酸羅丹明（異硫氰酸羅丹明（TRITC）。）。 25熒光物質可在室溫下使用，熒光可采用常見熒光物質可在室溫下使用，熒光可采用常見的、相對較便宜而無害的方法來檢測。此外，的、相對較便宜而無害的方法來檢測。此外，結合物在一般貯存條件下性能穩(wěn)定，可保存結合物在一般貯存條件下性能穩(wěn)定，可保存使用較長時間，因此該方法經(jīng)濟、安全、測使用較長時間，因此該方法經(jīng)濟、安全、測定簡便。但背景的干擾限制了它的靈敏度，定簡便。但背景的干擾限制了它的靈敏度，無法與無法與RIA相比。近年來，定量測定體液中相比。近

27、年來，定量測定體液中抗原或抗體的熒光免疫分析方法隨著一系列抗原或抗體的熒光免疫分析方法隨著一系列新儀器和新方法的建立，得到很大改進和發(fā)新儀器和新方法的建立，得到很大改進和發(fā)展。展。 26人們根據(jù)生物背景熒光壽命短（人們根據(jù)生物背景熒光壽命短（ns級）的特點，提級）的特點，提出了選擇長壽命的熒光物（稀土元素鑭系元素）出了選擇長壽命的熒光物（稀土元素鑭系元素）作為標記的時間分辨熒光免疫分析法（作為標記的時間分辨熒光免疫分析法（TrFIA），），使免疫熒光分析技術的標準化、定量化和自動化進使免疫熒光分析技術的標準化、定量化和自動化進入了一個新的發(fā)展階段。入了一個新的發(fā)展階段。 時間分辨熒光免疫測定是

28、時間分辨熒光免疫測定是20世紀世紀80年代初期在年代初期在免疫熒光分析的基礎上發(fā)展建立的一種新型免疫分免疫熒光分析的基礎上發(fā)展建立的一種新型免疫分析技術。其原理和方法與一般免疫熒光法不同，所析技術。其原理和方法與一般免疫熒光法不同，所用示蹤劑不是熒光素，而是采用鑭系元素銪離子用示蹤劑不是熒光素，而是采用鑭系元素銪離子（Eu3+）或鋱離子（）或鋱離子（Tb3+）等的配合物標記抗體或）等的配合物標記抗體或抗原，并利用時間分辨熒光計測量法排除樣品中非抗原，并利用時間分辨熒光計測量法排除樣品中非特異熒光的干擾，最大限度地提高了測定方法的靈特異熒光的干擾，最大限度地提高了測定方法的靈敏度。敏度。 27這

29、種方法利用一種門控技這種方法利用一種門控技術，使背景熒光信號降低術，使背景熒光信號降低到零以后，再測定長壽命到零以后，再測定長壽命標記物的熒光（圖標記物的熒光（圖7.11）。）。它將它將FIA的靈敏度提高了的靈敏度提高了幾個數(shù)量級，可達幾個數(shù)量級，可達10-17 mol L-1，明顯提高了熒光，明顯提高了熒光免疫分析的特異性。免疫分析的特異性。 圖圖7.11 時間分辨熒光測定時間分辨熒光測定 原理示意圖原理示意圖28TrFIA法在靈敏度、特異性、穩(wěn)定性及測量自法在靈敏度、特異性、穩(wěn)定性及測量自動化程度等方面都可與放射免疫測定（動化程度等方面都可與放射免疫測定（RIA）相媲美，而其標準曲線范圍寬

30、（跨越相媲美，而其標準曲線范圍寬（跨越45個數(shù)個數(shù)量級），最小檢出值可達量級），最小檢出值可達10-18 mol L-1，分析速，分析速度快，遠遠超過度快，遠遠超過RIA、EM及發(fā)光免疫測定，并及發(fā)光免疫測定，并具有結合物制備較簡便，有效使用期長，無放具有結合物制備較簡便，有效使用期長，無放射性污染，應用范圍廣等優(yōu)點。因此問世雖短，射性污染，應用范圍廣等優(yōu)點。因此問世雖短，發(fā)展卻十分迅速，成為目前超微量物質免疫分發(fā)展卻十分迅速，成為目前超微量物質免疫分析最有發(fā)展前途的一項技術。析最有發(fā)展前途的一項技術。 29TrFIA的測定原理與通常的熒光免疫分析（的測定原理與通常的熒光免疫分析（FIA）基本

31、相同，只是標記物和信號的測量不同?；鞠嗤?，只是標記物和信號的測量不同。當當Eu3+離子配合物標記抗原后，通過競爭反應，分離出免離子配合物標記抗原后，通過競爭反應，分離出免疫復合物，利用時間分辨熒光儀測定疫復合物，利用時間分辨熒光儀測定Eu3+離子發(fā)射離子發(fā)射的熒光強度，即可確定待測抗原的量。的熒光強度，即可確定待測抗原的量。 30在正常情況下，免疫復合物中在正常情況下，免疫復合物中的稀土離子自身的熒光信號較的稀土離子自身的熒光信號較弱。加入酸性增強液后，稀土弱。加入酸性增強液后，稀土離子從免疫復合物中解離出來，離子從免疫復合物中解離出來，與增強液中的與增強液中的 二酮體、三辛基二酮體、三辛基

32、氧化膦或氧化膦或Triton X-100等重新形等重新形成一種微膠體化合物。其中的成一種微膠體化合物。其中的Eu3+在在340 nm光激發(fā)下，可發(fā)光激發(fā)下，可發(fā)出長壽命的高強熒光（出長壽命的高強熒光（613 nm）（圖（圖7.12），強度增加），強度增加106倍，倍，用時間分辨熒光儀記錄下來進用時間分辨熒光儀記錄下來進行分析檢測。行分析檢測。 圖圖7.12 時間分辨熒光免疫分時間分辨熒光免疫分析原理示意圖析原理示意圖317. 3. 6 化學發(fā)光免疫分析化學發(fā)光免疫分析 酶免疫分析法克服了酶免疫分析法克服了RIA中放射性污染的弊病，中放射性污染的弊病，具有靈敏度高，設備簡單，操作安全等優(yōu)點，但也

33、具有靈敏度高，設備簡單，操作安全等優(yōu)點，但也存在酶不穩(wěn)定、光度測量范圍窄等不足之處。隨著存在酶不穩(wěn)定、光度測量范圍窄等不足之處。隨著免疫測定應用的日新月異以及分析方法及相關技術免疫測定應用的日新月異以及分析方法及相關技術的發(fā)展，的發(fā)展，20世紀世紀70年代末，年代末，Halmann和和Velan建立建立了了化學發(fā)光免疫分析化學發(fā)光免疫分析（CLIA）。發(fā)光免疫分析是）。發(fā)光免疫分析是以發(fā)光物質為標記物，通過偶聯(lián)反應，使標記物分以發(fā)光物質為標記物，通過偶聯(lián)反應，使標記物分子中的反應基團直接連接在標記免疫分子上。其檢子中的反應基團直接連接在標記免疫分子上。其檢測原理與以上方法相類似。測原理與以上方

34、法相類似。 32化學發(fā)光免疫分析具有免疫反應的特異性，又兼有發(fā)化學發(fā)光免疫分析具有免疫反應的特異性，又兼有發(fā)光反應的高敏感性，因此滿足了快速、簡單、穩(wěn)定、光反應的高敏感性，因此滿足了快速、簡單、穩(wěn)定、靈敏、特異和準確等要求。其最小檢出限可達靈敏、特異和準確等要求。其最小檢出限可達10-1210-15 mol。 發(fā)光免疫分析以化學發(fā)光反應為基礎。在常溫下，發(fā)光免疫分析以化學發(fā)光反應為基礎。在常溫下，一些特定的化學反應產生的能量使其產物或反應中間一些特定的化學反應產生的能量使其產物或反應中間態(tài)分子激發(fā)，形成電子激發(fā)態(tài)分子；當其衰退至基態(tài)態(tài)分子激發(fā)，形成電子激發(fā)態(tài)分子；當其衰退至基態(tài)時，所釋放出的化

35、學能量以可見光的形式發(fā)射，這種時，所釋放出的化學能量以可見光的形式發(fā)射，這種現(xiàn)象稱為化學發(fā)光（現(xiàn)象稱為化學發(fā)光（CL）。）。 33能產生能產生CL反應的物質稱為化學發(fā)光劑或化學發(fā)光反應的物質稱為化學發(fā)光劑或化學發(fā)光底物。化學發(fā)光試劑常用吖啶酯、魯米諾及其衍生底物?；瘜W發(fā)光試劑常用吖啶酯、魯米諾及其衍生物，反應時發(fā)光劑發(fā)生高能化學反應，形成處于激物，反應時發(fā)光劑發(fā)生高能化學反應，形成處于激發(fā)態(tài)的分子，當這些產物分子回到基態(tài)時，伴隨著發(fā)態(tài)的分子，當這些產物分子回到基態(tài)時，伴隨著光子的釋放發(fā)生化學發(fā)光現(xiàn)象。光子的釋放發(fā)生化學發(fā)光現(xiàn)象。CL反應絕大多數(shù)反應絕大多數(shù)屬于氧化反應，因為該反應能提供足夠的能

36、量便其屬于氧化反應，因為該反應能提供足夠的能量便其產物分子或反應中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài)。目產物分子或反應中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài)。目前應用在免疫測定中的重要化學發(fā)光反應有以下幾前應用在免疫測定中的重要化學發(fā)光反應有以下幾類：類： 34（1）氨基苯二酰肼類參加的）氨基苯二酰肼類參加的CL反應：主要是魯米反應：主要是魯米諾（諾（luminol）及異魯米諾衍生物。它們在催化劑）及異魯米諾衍生物。它們在催化劑（如過氧化物酶，（如過氧化物酶，POD或或HRP）的參與下被）的參與下被H2O2氧化而產生化學發(fā)光。發(fā)射光的波長為氧化而產生化學發(fā)光。發(fā)射光的波長為375550 nm，以，以425 nm波長

37、為主。波長為主。（2）吖啶酯參加的）吖啶酯參加的CL反應：這類化學發(fā)光劑不需反應：這類化學發(fā)光劑不需要催化劑的參與，在過氧化氫的稀堿溶液中即能發(fā)要催化劑的參與，在過氧化氫的稀堿溶液中即能發(fā)光。發(fā)射光的波長光。發(fā)射光的波長430 nm。（3）堿性磷酸酶（）堿性磷酸酶（AP）參與的）參與的CL反應：化學發(fā)光反應：化學發(fā)光劑為劑為adamantyl l,2-二氧雜環(huán)丁烷芳基（二氧雜環(huán)丁烷芳基（dioxetane）磷酸酯，在堿性磷酸酶的作用下能分解成不穩(wěn)定的磷酸酯，在堿性磷酸酶的作用下能分解成不穩(wěn)定的dioxetane底物而發(fā)光。底物而發(fā)光。35（4）生物發(fā)光：常見的反應體系為蟲熒素，在蟲熒）生物發(fā)光：常見的反應體系為蟲熒素，在蟲熒酶的催化下，有酶的催化下，有ATP，Mg2+及及O2存在時，發(fā)生瞬時發(fā)存在時，發(fā)生瞬時發(fā)光反應：光反應：LH2（蟲熒素）（蟲熒素） ATP + Mg2 蟲熒酶蟲熒酶 LHAMP+ LHAMP+ + O2 L（氯化蟲熒素）（氯化蟲熒素） CO2 + AMP + h 36 dioxetane磷酸酯