高效液相色譜法課件

1、第十五章 高效液相色譜法High Performance Liquid Chromatography，HPLC15.1概述高效液相色譜又稱為高壓液相色譜（High Pressure Liquid Chromatography）、高速液相色譜（High Speed Liquid Chromatography）、高分離度液相色譜（High Resolution Liquid Chromatography）或現(xiàn)代液相色譜（Modern Liquid Chromatography），是在20世紀(jì)60年代末期在經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)。由于其適用范圍廣，分離速度快

2、，靈敏度高，色譜柱可以反復(fù)使用，樣品用量少，還可以收集被分離的組分，特別是計算機等新技術(shù)的引入使其自動化與數(shù)據(jù)處理能力大大提高，高效液相色譜技術(shù)得到飛速發(fā)展。高效液相色譜法和經(jīng)典液相色譜法在分析原理上基本相同，但由于在技術(shù)上采用了新型高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，而使經(jīng)典的液相色譜法煥發(fā)出新的活力。經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，高效液相色譜法在分析速度、分離效能、檢測靈敏度和操作自動化等方面，都達(dá)到了很高的程度，可以和氣相色譜法相媲美，并保持了經(jīng)典液相色譜對樣品通用范圍廣、可供選擇的流動相種類多和便于用作制備色譜等優(yōu)點。至今，高效液相色譜法已在生物工程、制藥工業(yè)、食品行業(yè)、環(huán)境監(jiān)測、石油化工

3、等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。15.1.1與經(jīng)典液相色譜法比較經(jīng)典液相色譜法通常使用的固定相是多孔粗粒，裝填在大口徑長色譜柱（玻璃）管內(nèi)，流動相是靠重力作用流經(jīng)色譜柱的，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)速度緩慢，柱入口壓力低，分析時間長，因此柱效低，分離能力差，難以解決復(fù)雜混合物的分離分析；而高效液相色譜法使用的固定相是全多孔微粒，裝填在小口徑、短不銹鋼柱內(nèi)，流動相是通過高壓輸液泵進入色譜柱的，溶質(zhì)在固定相的傳質(zhì)、擴散速度大大加快，柱效可比前者高23個數(shù)量級，從而在短時間內(nèi)獲得高柱效和高分離能力，可以分離上百個組分?？傮w來看高效液相色譜法和經(jīng)典液相色譜法主要有以下不同（見表15.1）。表15.1 高效液相色譜法與經(jīng)

4、典液相色譜法的比較方法 項目高效液相色譜法經(jīng)典液相色譜法色譜柱柱長/cm柱內(nèi)徑/mm可重復(fù)使用1025210只用一次102001050固定相粒徑/µm篩孔/目5502503007560020030色譜柱入口壓力/MPa2200.0010.1色譜柱柱效/（理論塔板數(shù)/m）2×1035×104250進樣量/g10-410-2110分析時間/h0.051.0120在線檢測能在線檢測不能在線檢測15.1.2與氣相色譜法比較氣相色譜法具有高選擇性、高分離效率、高靈敏度和分析速度快的特點，但它僅適用于分析蒸氣壓低、沸點低的樣品，而不適用于分析高沸點有機物、高分子和熱穩(wěn)定性差的

5、化合物以及生物活性物質(zhì)，因而使其應(yīng)用范圍大受限制。在全部有機合物中僅有20的樣品適用于氣相色譜法分析。而高效液相色譜法卻恰好彌補氣相色譜法的不足，適合分離分析80%的有機化合物，廣泛的用于天然產(chǎn)物、生物活性物質(zhì)、生物大分子等有機物的分離分析。此兩種方法的比較可見表15.2。表15.2 高效液相色譜法與氣相色譜法的比較 方法項目高效液相色譜法氣相色譜法進樣方式樣品制成溶液樣品需加熱氣化或裂解流動相（1）液體流動相可為離子型、極性、弱極性、非極性溶液，可與被分析樣品產(chǎn)生相互作用，并能改善分離的選擇性（2）液體流動相動力粘度大，傳輸流動相壓力高。（1）氣體流動相為惰性氣體，不與被分析的樣品發(fā)生相互作

6、用（2）氣體流動相動力粘度小，傳輸流動相壓力低固定相（1）分離機理：可依據(jù)吸附、分配、篩析、離子交換、親和等多種原理進行樣品分離，可供選用的固定相種類繁多（2）色譜柱：固定相粒度小為510µm；填充柱內(nèi)徑為36mm，柱長1025cm，柱效為103104，毛細(xì)管柱內(nèi)徑為0.010.03mm，柱長510m，柱效為104105；柱溫為常溫（1）分離機理：可依據(jù)吸附、分配兩種原理進行樣品分離，可供選用的固定相種類較多（2）色譜柱：固定相粒度大0.10.5mm；填充柱內(nèi)徑為14mm，柱長14m，柱效為102104，毛細(xì)管柱內(nèi)徑為0.10.3mm，柱長10100m，柱效為103104；柱溫為常溫

7、300檢測器選擇性檢測器：UVD，PDAD，F(xiàn)D，ECD通用型檢測器：ELSD，RID通用型檢測器：TCD，F(xiàn)ID（有機物）選擇性檢測器：ECD*，F(xiàn)PD，NPD應(yīng)用范圍可分析低分子量低沸點樣品；高沸點、中分子、高分子有機化合物；離子型無機化合物；熱不穩(wěn)定，具有生物活性的生物分子可分析低分子量低沸點有機化合物；永久性氣體；配合程序升溫可分析高沸點有機化合物；配合裂解技術(shù)可分析高聚物儀器組成溶質(zhì)在液相的擴散系數(shù)很小，因此在色譜柱以外的死空間應(yīng)盡量小，以減少柱外效應(yīng)對分離效果的影響溶質(zhì)在氣相的擴散系數(shù)大，柱外效應(yīng)影響較小，對毛細(xì)管氣相色譜應(yīng)盡量減小柱外效應(yīng)對分離效果的影響注：UVD-紫外吸收檢測器

8、，PDAD-二極管陣列檢測器，ECD-電化學(xué)檢測器，ECD*-電子捕獲檢測器，ELSD-蒸發(fā)激光散射檢測器，F(xiàn)D-熒光檢測器，RID-折光指數(shù)檢測器，TCD-熱導(dǎo)檢測器，F(xiàn)ID-氫火焰離子化檢測器，F(xiàn)PD-火焰光度檢測器，NPD-氮磷檢測器15.1.3高效液相色譜法的特點 （1）分離效能高 由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色譜填充柱的柱效可達(dá)2×1035×104塊·m-1理論塔板數(shù)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氣相色譜填充柱103塊·m-1理論塔板數(shù)的柱效。（2）選擇性高 由于液相色譜柱具有高柱效，并且流動相可以控制和改善分離過程的選擇性。因此，高效液相色譜法不僅可以

9、分析不同類型的有機化合物及其同分異構(gòu)體，還可分析在性質(zhì)上極為相似的旋光異構(gòu)體，并已在高療效的合成藥物和生化藥物的生產(chǎn)控制分析中發(fā)揮了重要作用。（3）檢測靈敏度高 在高效液相色譜法中使用的檢測器大多數(shù)具有較高的靈敏度。如使用廣泛的紫外吸收檢測器，最小檢出量可達(dá)10-9g；用于痕量分析的熒光檢測器，最小檢出量可達(dá)10-12g。（4）分析速度快 由于高壓輸液泵的使用，相對于經(jīng)典液相（柱）色譜，其分析時間大大縮短，當(dāng)輸液壓力增加時，流動相流速會加快，通常分析一個樣品在1530 min，有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。高效液相色譜法除具有以上特點外，它的應(yīng)用范圍也日益擴展。由于它使用了非破壞性檢測器

10、，樣品被分析后，在大多數(shù)情況下，可除去流動相，實現(xiàn)對少量珍貴樣品的回收，亦可用于樣品的純化制備。15.2高效液相色譜儀高效液相色譜儀自1967年問世以來，由于使用了高壓輸液泵、全多孔微粒填充柱和高靈敏度檢測器，實現(xiàn)了對樣品的高速、高效和高靈敏度的分離測定。20世紀(jì)7080年代高效液相色譜儀獲得快速發(fā)展，并引入微處理機技術(shù)，極大地提高了儀器的自動化水平和分析精度。高效液相色譜儀可分為分析型和制備型，雖然它們的性能各異、應(yīng)用范圍不同，但其基本組件相似?，F(xiàn)在用計算機控制的高效液相色譜儀，其自動化程度高，既能控制儀器的操作參數(shù)（如溶劑梯度洗脫、流動相流量、校溫、自動進樣、洗脫液收集、檢測器功能等），又

11、能對獲得的色譜圖進行收縮、放大、疊加，以及對保留數(shù)據(jù)和峰高、峰面積進行處理等，為色譜分析工作者提供了高效率、功能全面的分析工具。圖15.1為高效液相色譜儀的組成示意圖。圖15.1 高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖高效液相色譜工作過程為：高壓泵將貯液器中的流動相經(jīng)過進樣器帶入色譜柱，當(dāng)注入欲分離的樣品時，流動相將樣品一并帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器輸出的信號記錄下來，即得到色譜圖，流動相和樣品從色譜儀出口流出被餾分收集器收集得到。以下分別介紹構(gòu)成高效液相色譜儀的主要部件：貯液器、高壓輸液泵、進樣裝置、色譜柱、檢測器、餾分收集器、記錄儀和數(shù)據(jù)處理裝置。15.2.1貯液器15

12、.2.1.1簡介貯液器是用來存放流動相的容器，供給符合要求的流動相以完成分離分析工作。貯液器的材料應(yīng)耐腐蝕、對洗脫液呈化學(xué)惰性，可為玻璃、不銹鋼、聚四氟乙烯等材料制成。容積大小與柱子的粗細(xì)、泵的種類以及所采用的液相色譜系統(tǒng)有關(guān)。一般容積約為0.52.0 L，以便在不重復(fù)加液的情況下能連續(xù)工作。對凝膠色譜儀、制備型儀器，其容積應(yīng)更大一些。貯液器的放置位置要高于泵體，以便保持一定的輸液靜壓差。使用過程中貯液器應(yīng)密閉，以防溶劑蒸發(fā)引起流動相組成的變化，還可防止空氣中O2、CO2重新溶解于已脫氣的流動相中。 高效液相色譜所用的溶劑在放入貯液器之前必須經(jīng)過0.45µm的濾膜過濾，除去溶劑中可能

13、含有的機械性雜質(zhì)，以防輸液管道或進樣閥產(chǎn)生阻塞現(xiàn)象。對輸出流動相的連接管路，其插入貯液罐的一端，通常要連有孔徑為0.45µm的多孔不銹鋼過濾器或由玻璃制成的專用膜過濾器。15.2.1.2流動相脫氣高效液相色譜所用的流動相在使用前必須進行脫氣，以除去其中溶解的氣體，防止在洗脫過程中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時因壓力降低而產(chǎn)生氣泡，從而影響色譜柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線的穩(wěn)定性，嚴(yán)重時無法進行分析。此外溶解在流動相中的氧氣，會造成熒光淬滅現(xiàn)象，影響熒光檢測器的檢測，還會導(dǎo)致樣品中某些組分被氧化或會使柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。常用的脫氣方法有如下幾種：（1）吹氦脫氣

14、法 使用在液體中比空氣溶解度低的氦氣，在0.1MPa壓力下，以約60mL·min-1的流速通入流動相1015min以驅(qū)除溶解的氣體。此法適用于所有的溶劑、脫氣效果較好，但因氦氣價格較貴，使用具有局限性。（2）加熱回流法 此法脫氣效果較好，但操作較復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。（3）真空脫氣法 此時可使用微型真空泵，降壓至0.050.07MPa即可除去溶解的氣體。顯然使用水泵連接抽濾瓶和G4微孔玻璃漏斗可一起完成過濾機械雜質(zhì)和脫氣的雙重任務(wù)。由于抽真空易抽走有機相會引起混合溶劑組成的變化，故此法適用于單一溶劑體系脫氣。對于多元溶劑體系，每種溶劑應(yīng)預(yù)先脫氣后再進行混合，以保證混合后的比例不變。

15、（4）超聲波脫氣法 將欲脫氣的流動相放于超聲波清洗器中，用超聲波振蕩1015min。但此法的脫氣效果較差。（5）在線真空脫氣法（on-1ine degasser） 以上幾種方法均為離線（off-1ine）脫氣操作，隨著流動相存放時間的延長又會有空氣重新溶解到流動相中。在線真空脫氣技術(shù)是把真空脫氣裝置串接到貯液系統(tǒng)中，結(jié)合膜過濾器，實現(xiàn)了流動相在進入輸液泵前的連續(xù)真空脫氣。此法能智能控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果優(yōu)于上述幾種方法，并適用于多元溶劑體系。15.2.2高壓輸液泵15.2.2.1高壓輸液泵的特點高壓輸液泵是高效液相色譜儀的重要單元部件，用于將流動相和樣品輸入到色譜柱和檢測器中，從

16、而使樣品得以分析，其性能的好壞直接影響整個儀器和分析結(jié)果的可靠性。高壓輸液泵應(yīng)具備以下特點：（1）泵體材料耐化學(xué)腐蝕。通常使用普通耐酸、堿和緩沖液腐蝕的不銹鋼。（2）能在高壓下連續(xù)工作。通常要求耐壓4050MPa·cm-2，能長時間連續(xù)工作。（3）輸出流量范圍寬。對填充柱：0.110 mL·min-1（分析型）；1100 mL·min-1 （制備型）。對微孔柱：101000µL·min-1（分析型）；19900µL·min-1（制備型）。（4）輸出流量穩(wěn)定，重復(fù)性高。高效液相色譜使用的檢測器，大多數(shù)對流量變化敏感，高壓輸液泵

17、應(yīng)提供無脈沖流量，這樣可以降低基線噪聲并獲較好的檢測下限。流量控制的精密度應(yīng)小于1%，最好小于0.5%，重復(fù)性最好小于0.5%。其次還應(yīng)具有易于清洗、易于更換溶劑、具有梯度洗脫功能等。15.2.2.2高壓輸液泵的類型高壓輸液泵按排液性能可分為恒流泵和恒壓泵，按其結(jié)構(gòu)不同又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。目前多用柱塞往復(fù)泵。（1）恒流泵 輸出恒定體積流量的流動相，在色譜分析中，柱系統(tǒng)中阻力總是會變的，因此恒流泵比恒壓泵更具優(yōu)勢，使用更普遍。按工作方式恒流泵又可分為注射型泵和往復(fù)型泵。注射型泵 又稱注射式螺桿泵，如圖15.2所示。圖15.2 注射型泵工作原理圖1.步進電動機 2.變速齒輪

18、箱 3.螺桿 4.活塞5.載液 6.至色譜柱 7.用單向閥封閉的載液入口工作原理：它利用步進電動機經(jīng)齒輪螺桿傳動、帶動活塞以緩慢恒定的速度移動，使載液在高壓下以恒定流量輸出。當(dāng)活塞達(dá)到每個輸出沖程末端時，暫時停止輸出流動相，然后以極快速度進入吸入沖程，再次將流動相由單向閥封閉的載液入口吸入泵中，再重新進入輸出沖程的運行，如此往復(fù)交替進行。優(yōu)點：可在高輸液壓力下給出精確的（0.1%）無脈動、可重現(xiàn)的流量；可通過改變電動機的電壓，控制電動機的轉(zhuǎn)速，來改變活塞的移動速度，從而可調(diào)節(jié)流動相流量，使其輸出流量與系統(tǒng)阻力無關(guān)；該泵因其流量穩(wěn)定、操作方便、可與多種高靈敏度檢測器聯(lián)接使用。缺點：由于泵液缸容積

19、（約100150mL）有限，每次流動相輸完后，需重新吸入流動相，故當(dāng)流動相流量大時，流動相中斷頻繁，不利于連續(xù)工作，使用兩臺泵交替工作可克服此不足之處；此泵在高壓下工作，對活塞和液缸間的密封要求很高，更換溶劑不方便，且價格昂貴。注射型泵目前在高效液相色譜儀中使用較少，而在超臨界流體色譜儀中使用較多。 往復(fù)型泵工作原理：柱塞往復(fù)式泵，類似于具有單向閥的往復(fù)運動的小型注射器。通常由電動機帶動凸輪（或偏心輪）轉(zhuǎn)動，再用凸輪驅(qū)動活塞桿作往復(fù)運動，柱塞向前運動，液體輸出，流向色譜柱；向后運動，將貯液器中流動相吸入缸體。前后往復(fù)運動，將流動相源源不斷地輸送到色譜柱中。通過單向閥的開啟和關(guān)閉，定期將貯存在液

20、缸里的液體以高壓連續(xù)輸出。當(dāng)改變電動機轉(zhuǎn)速時，通過調(diào)節(jié)活塞沖程的頻率，就可調(diào)節(jié)輸出液體的流量，如圖15.3所示。此泵每往復(fù)一次輸出的流量由柱塞的截面積和沖程決定，單位時間輸出的流量由柱塞的往復(fù)次數(shù)決定。隔膜式往復(fù)泵的工作原理與柱塞式往復(fù)泵相似，只是流動相接觸的不是活塞，而是具有彈性的不銹鋼或聚四氟乙烯隔膜。此隔膜經(jīng)液壓驅(qū)動脈沖式地排出或吸入流動相，隔膜式往復(fù)泵的優(yōu)點是可避免流動相被污染。目前已研制出雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵，它由馬達(dá)從相反方向推動兩個球形螺旋傳動，由于球形螺旋傳動的齒輪有不同的圓周（2：1），使第一個活塞的運動速度是第二個活塞的兩倍，如圖15.4所示。它啟動時，通過運行一個初始程序來

21、決定兩個柱塞向上移動能到達(dá)的最高位置，然后再向下移動至一個預(yù)定高度，控制器將兩個活塞位置貯存在記憶中，完成初始化設(shè)定，泵I和泵就按設(shè)定參數(shù)操作。當(dāng)驅(qū)動馬達(dá)正向運轉(zhuǎn)時，泵I流動相入口主動單向閥打開時，柱塞I向下移動，將流動相吸入泵I內(nèi)，與此同時，泵柱塞向上移動，將流動相送入色譜系統(tǒng)。在完成由控制器設(shè)定的第一種柱塞運行沖程長度后，驅(qū)動馬達(dá)停止，泵I入口主動單向閥門關(guān)閉，然后驅(qū)動馬達(dá)反向運轉(zhuǎn)，泵I流動相出口被動單向閥打開，此時柱塞I向上移動，泵柱塞向下移動，使泵I中流動相轉(zhuǎn)移至泵，就完成控制器設(shè)定的第二種柱塞運行程序。重復(fù)進行上述過程，就使泵I吸入的流動相連續(xù)不斷地進入泵，而泵每次僅排出壓入流動相的

22、一半，而實現(xiàn)以恒定流量連續(xù)向色譜系統(tǒng)輸液。雙桿塞往復(fù)式串聯(lián)泵的主要特點是僅在泵I配有一單向閥，全部操作是用計算機進行控制的。 圖15.3 柱塞式往復(fù)型泵工作原理圖 圖15.4 雙柱塞往復(fù)式串聯(lián)泵1.偏心輪 2.柱塞 3.密封墊 1.貯液罐 2.泵（柱塞） 3.單向閥4.流動相進口 5.單向閥 6.流動相出口 4.阻尼器 5.泵（柱塞） 6.至色譜柱優(yōu)點：可在高壓下連續(xù)以恒定的流量輸液；泵的液缸容積很小，其柱塞尺寸小易于密封；容易清洗及更換流動相、特別適用于梯度洗脫。缺點：輸出流動相雖然是連續(xù)的恒流量的，但存在脈沖波動，若與對流量敏感的折光指數(shù)檢測器連接，就產(chǎn)生基線波動，難以進行準(zhǔn)確的定量分析工

23、作；柱塞式往復(fù)泵，柱塞直接與流動相接觸造成污染（使用隔膜式往復(fù)泵可克服此缺點）；長期運轉(zhuǎn)后，因流動相含有的機械雜質(zhì)會造成單向閥的阻塞，或因單向閥的閥球磨損而不能關(guān)閉單向閥。這些都會造成往復(fù)泵不能正常工作。柱塞式往復(fù)泵在高效液相色譜儀中獲得最廣泛的應(yīng)用，也是最重要的高壓輸液泵。（2）恒壓泵 恒壓泵又稱氣動放大泵，是輸出恒定壓力的泵。工作原理：當(dāng)系統(tǒng)阻力不變時可保持恒定流量，當(dāng)系統(tǒng)阻力發(fā)生變化時，輸入壓力雖然不變，但流量卻隨阻力而變。其氣動放大泵的工作原理如圖15.5所示。恒壓泵是利用氣體的壓力去驅(qū)動和調(diào)節(jié)流動相的壓力，通常采用壓縮空氣作為動力去驅(qū)動氣缸中橫截面積大的活塞5，再經(jīng)過一個連桿去驅(qū)動液

24、缸中橫截面積小的活塞6。由于兩個活塞面積有一定的比例（約50：1），則氣缸壓力p2傳于液缸壓力p1時，其壓力也增加相應(yīng)的倍數(shù)，而獲得輸出液的高壓p1：， （15.1）式中：A1活塞面積；A2大活塞面積。當(dāng)=50時，。此高壓可將液缸中的液體排出。單液缸氣動放大泵，每個輸液沖程結(jié)束，氣缸和液缸活塞即快速反向運行而重新吸液，結(jié)果幾乎不中斷流動相輸出，但基線會有暫時的波動。若其具有雙液缸，則可通過兩個電磁閥定時切換氣體壓力，實現(xiàn)在一個液缸輸液的同時，另一個液缸正在吸液，從而使流動相連續(xù)輸出且不引起基線波動。使用氣動放大泵時，輸出流動相的流量不僅由泵的輸出壓力決定，還取決于流動相的粘度及色譜柱的壓力降，

25、因此在分析過程不能獲得穩(wěn)定的流量。圖15.5 氣動放大泵1.空氣 2.連桿 3.輸液 4.吸液 5.大活塞 6.小活塞優(yōu)點：能以比較簡單的方式建立高壓并輸出無脈動的、穩(wěn)定的流動相液流；可與折光指數(shù)檢測器配合使用；可利用改變氣源壓力的方法來調(diào)節(jié)載液流速。缺點：液缸體積大（約70mL），更換流動相不方便，如不使用兩臺泵無法實現(xiàn)梯度洗脫。不能輸出恒定流量的流動相，不易測出重復(fù)的保留時間，不能獲得可靠的定性結(jié)果。在高效液相色譜儀發(fā)展初期，恒壓泵使用較多，隨往復(fù)式恒流泵的廣泛使用，恒壓泵現(xiàn)已基本不再使用。但在填充高效液相色譜柱時，使用的勻漿裝柱機都配備氣動放大泵，以快速建立所需的高壓輸出。15.2.2.

26、3輸液系統(tǒng)的輔助設(shè)備為了給色譜柱提供穩(wěn)定、無脈動、流量準(zhǔn)確的流動相，除具備高壓輸液泵外、還需配備管道過濾器和脈動阻尼器等輔助設(shè)備。（1）管道過濾器 在高壓輸液泵的進口和它的出口與進樣閥之間，應(yīng)設(shè)置過濾器。高壓輸液泵的柱塞和進樣閥閥芯的機械加工精密度非常高，微小的機械雜質(zhì)進入流動相，會導(dǎo)致上述部件的損壞，同時機械雜質(zhì)在接頭的積累，會造成柱壓升高，使色譜柱不能正常工作，因此管道過濾器的安裝是十分必要的。過濾器的濾芯是用不銹鋼燒結(jié)材料制造的，孔徑約23µm，耐有機溶劑的侵蝕。若發(fā)現(xiàn)過濾器堵塞（發(fā)生流量減小的現(xiàn)象），可將其浸入稀HNO3溶液中，在超聲波清洗器中用超聲波振蕩1015min，即可

27、將堵塞的固體雜質(zhì)洗出，若清洗后仍不能達(dá)到要求，則應(yīng)更換濾芯。（2）脈動阻尼器 往復(fù)式柱塞泵輸出的壓力脈動，會引起記錄儀基線的波動，這種脈動可以通過在高壓輸液泵出口與色譜柱入口之間安裝一個脈動阻尼器（或稱緩沖器）來加以消除。圖15.6為幾種脈動阻尼器示意圖。其中圖15.6（a）為最簡單、最常用的脈動阻尼器，它由一根外徑約1.11.5mm、內(nèi)徑0.25mm，長約5m的螺旋狀不銹鋼毛細(xì)管組成，利用它的撓性來阻滯壓力和流量的波動。起到緩沖作用，毛細(xì)管內(nèi)徑越細(xì)，其阻滯作用越大。這種阻尼器制作簡單，但會引起系統(tǒng)中一定的壓力損失。如將它改裝成圖15.6（b）所示的三通式，即可避免壓力損失，且阻尼效果更好。圖

28、15.6（a）和（d）分別是可調(diào)彈簧式和波紋管式脈動阻尼器，它們的阻尼效果好，但其體積大，更換溶劑很不方便不適于梯度洗脫。圖15.6（e）為一種新式脈沖阻尼器，它的內(nèi)管壁用彈性材料制成，內(nèi)、外管之間裝有已脫氣可壓縮的液體，內(nèi)管的彈性和裝填液體的可壓縮性，都可吸收輸液系統(tǒng)中的壓力波動。這種阻尼器死體積小，適用于梯度洗脫。在輸液系統(tǒng)中還應(yīng)配備由壓力傳感器組成的壓力測量、顯示裝置及流動相流量的測量裝置。圖15.6 脈動阻尼器15.2.2.4梯度洗脫裝置高效液相色譜洗脫技術(shù)有等強度（isocratic）和梯度（gradient）洗脫兩種。等強度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動相組成保持恒定不變，適合于組分?jǐn)?shù)

29、目較少、性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分析周期內(nèi)由程序來控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強度和pH值等。在分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)相差較大的復(fù)雜樣品時須采用梯度洗脫技術(shù)、使所有組分都在適宜條件下獲得分離。梯度洗脫能縮短分析時間、提高分離度、提高柱效、改善峰形、提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。梯度洗脫的方法是使流動相中含有兩種或兩種以上不同極性的溶劑，在洗脫過程連續(xù)或間斷改變流動相的組成，以調(diào)節(jié)它的極性，使每個流出的組分都有合適的容量因子k，并使樣品中的所有組分在最短的分析時間內(nèi)獲得較好的分離效果。當(dāng)樣品中第一個組分的k值和最后一個峰的k值相差幾十倍至上百倍時，使用梯度洗

30、脫的效果就特別好。此技術(shù)相似于氣相色譜中使用的程序升溫技術(shù)，現(xiàn)已在高效液相色譜法中獲得廣泛的應(yīng)用，有兩種實現(xiàn)梯度洗脫的裝置，即高壓梯度裝置和低壓梯度裝置。（1）低壓梯度（外梯度） 在常壓下將兩種溶劑（或多元溶劑）通過梯度比例閥按程序混合，然后再用高壓輸液泵送入到色譜柱中，其裝置圖15.7所示，此法的主要優(yōu)點是僅需使用一個高壓輸液泵。如對二元混合溶劑體系，操作時先將弱極性溶劑A，通過由微處理機控制的低壓計量泵和時間比例電磁閥（6）直接流入混合器；強極性溶劑B，也通過低壓計量泵，并由微處理機控制另一時間比例電磁閥（7）的開關(guān)時間，來調(diào)節(jié)流入混合器的B溶劑的體積百分?jǐn)?shù)、以控制輸出混合溶劑的組成。溶劑

31、A和B在混合器內(nèi)充分混合后，再用高壓輸液泵輸至色譜柱。通過預(yù)先設(shè)定溶劑A、B時間比例電磁閥的開啟時間，就可控制二元混合溶劑流動相的組成，并連續(xù)輸出具有不同極性的流動相。此種梯度洗脫方式可以減小溶劑可壓縮性的影響，并能完全消除由于溶劑混合引起的熱力學(xué)體積變化所帶來的誤差。（2）高壓梯度（內(nèi)梯度） 目前，大多數(shù)高效液相色譜儀均配有高壓梯度裝置，它是用兩臺高壓輸液泵分別將兩種溶劑A、B輸入混合室，進行混合后再送入色譜柱。兩種溶劑進入混合室的比例可由溶劑程序控制器或計算機來調(diào)節(jié)。此類裝置如圖15.8所示，它的主要優(yōu)點是兩臺高壓輸液泵的流量可獨立控制，可獲得任何形式的梯度程序，且易于實現(xiàn)自動化。由于高壓

32、梯度裝置中，每種溶劑是分別由泵輸送的，進入混合器后，溶劑的可壓縮性和溶劑混合時熱力學(xué)體積的變化，可能影響輸入到色譜柱中的流動相的組成。在梯度洗脫中為保證流速穩(wěn)定必須使用恒流泵，否則很難獲得重復(fù)性結(jié)果。 圖15.7 低壓梯度裝置圖 圖15.8 高壓梯度裝置圖1.低壓計量泵 2.微處理機 3.混合器 1.程序控制器 2.溶劑A 3.溶劑B 4.高壓泵A 5.高壓泵B4.高壓輸液泵 5.至色譜柱 6、7.時間比例電磁閥 6.反饋控制器 7.混合室 8.流量計信號 9.混合溶劑出口（3）梯度洗脫曲線 梯度洗脫時常用一個弱極性溶劑A和一個強極性溶劑B組合。以梯度洗脫時間作橫坐標(biāo)，以流動相中強極性組分B的

33、體積百分含量作縱坐標(biāo)，可繪出梯度曲線。若在單位時間內(nèi)，強極性溶劑B在流動相中的體積百分含量以恒定的速率增加，則流動相的極性呈“線性梯度輸出”，若不以恒定速度增加，流動相呈現(xiàn)凸形或凹形輸出，如圖15.9所示。當(dāng)梯度洗脫方式確定后。對應(yīng)于不同梯度洗脫形狀，獲得的色譜分離圖如圖15.10所示。若呈線性梯度洗脫，如圖15.10（b），譜圖中每個譜帶寬度相等，且各個譜帶間具有相同的分離度。若呈“指數(shù)形式”的凸形洗脫，如圖15.10（a），在分離開始時，B的體積百分含量迅速增加，使各組分譜帶以較低的平均容量因子k值洗脫，并且最終譜帶的k值也較低，使開始被洗脫的色譜峰形尖銳，且分離度減?。欢诜蛛x的后期，B

34、的體積百分?jǐn)?shù)增長減慢，使后被洗脫的色譜峰譜帶加寬，分離度增大。若呈“指數(shù)形式”的凹形洗脫，則如圖15.10（c）所看到的譜圖變化與圖15.10（a）恰好相反。即開始被洗脫的色譜峰譜帶較寬，分離度較好，而后洗脫的色譜峰譜帶較尖銳，分離度減小。 圖15.9 梯度洗脫形狀 圖15.10 梯度洗脫的形狀及對分離的影響（4）影響梯度洗脫的因素 進行梯度洗脫時，選定溶劑A、B之后，設(shè)定梯度速度和梯度時間，確定梯度曲線形狀，要以最經(jīng)濟的梯度洗脫程序，實現(xiàn)樣品的最佳化分離。影響梯度洗脫的因素有：溶劑的純度要高，否則會使梯度洗脫的重現(xiàn)性變壞；梯度混合的溶劑互溶性要好，應(yīng)防止不互溶的溶劑進入色譜柱、應(yīng)當(dāng)注意溶劑的

35、粘度和相對密度對混合流動相組成的影響；梯度洗脫應(yīng)使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器（如折光指數(shù)檢測器）。15.2.3進樣裝置進樣裝置是將分析樣品引入色譜柱的裝置，要求重復(fù)性好，死體積小，保證中心進樣，進樣時色譜柱壓力、流量波動小，便于實現(xiàn)自動化等。高效液相色譜中的進樣方式可分為隔膜進樣、閥進樣、自動進樣器進樣等。15.2.3.1隔膜進樣用微量注射器針頭穿過橡皮隔膜進樣，這是最簡便的一種進樣方式。而且由于可以把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，所以往往可獲得最好的柱效。但是由于這種進樣方式不能在高壓

36、下使用（如10MPa以上），重復(fù)性較差（包括柱效和定量結(jié)果），加之能耐各種溶劑的橡皮材料不易找到，因而常規(guī)分析使用受到局限。15.2.3.2閥進樣這是目前高效液相色譜普遍采用的一種進樣方式。雖然由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率稍低于注射器隔膜進樣，但因耐高壓，重復(fù)性良好，操作方便，因而深受色譜工作者的歡迎。其中，圖15.11所示的六通進樣閥最為常用。此閥的閥體用不銹鋼材料，旋轉(zhuǎn)密封部分由堅硬的合金陶瓷材料制成，既耐磨、密封性能又好。當(dāng)進樣閥手柄置取樣位置（a），用特制的平頭注射器吸取比定量管體積（5µL或10µL）稍多的樣品從注入口處進入定量管，多余的樣品從出口排出。

37、再將進樣閥手柄置進樣位置（b），流動相將樣品攜帶進入色譜柱。此種進樣直觀性好，能耐20MPa的高壓。 圖15.11 六通閥進樣示意圖（a）取樣位置 （b）進樣位置15.2.3.3自動進樣器自動進樣器是由計算機自動控制定量閥，按預(yù)先編制注射樣品的操作程序工作。操作者只需把裝好樣品的小瓶按一定次序放入樣品架上，然后取樣、進樣、復(fù)位、樣品管路清洗等全部按預(yù)定程序自動運行，一次可進行幾十個或上百個樣品的分析。自動進樣的樣品量可連續(xù)調(diào)節(jié)、進樣重復(fù)性高，適合作大量樣品分析，節(jié)省人力，可實現(xiàn)自動化操作。15.2.4色譜柱色譜柱被稱為高效液相色譜儀的“心臟”，因為色譜的核心問題分離是在色譜柱中完成的，色譜柱的

38、設(shè)計（包括柱型、結(jié)構(gòu)、填料和裝填方法）或稱柱技術(shù)（Column technology）對現(xiàn)代液相色譜的發(fā)展起著關(guān)鍵性作用。為了適應(yīng)不同的分離分析要求，色譜柱有不同的柱型，不同的柱材料及規(guī)格。15.2.4.1柱材料常用內(nèi)壁經(jīng)過精密加工拋光的不銹鋼管作色譜柱的柱管以獲得高柱效。不銹鋼管耐溶劑、水和緩沖溶液的腐蝕，使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用50%的HNO3對柱內(nèi)壁作鈍化處理。鈍化時使HNO3在柱管內(nèi)至少滯留10min，以在內(nèi)壁形成鈍化的氧化物涂層。此外也有使用氟塑料、玻璃和玻璃襯里材料作色譜柱的，主要從抗腐蝕和易加工兩方面來考慮。15.2.4.2柱結(jié)構(gòu)一套完整的色譜柱，除柱管外，還應(yīng)

39、有柱頭及配套的連接管。一般色譜柱是由柱管，末端接頭，卡套（又稱密封環(huán)）和過濾篩板等組成的。圖15.12是目前較為流行的典型分析型高效液相色譜柱的結(jié)構(gòu)。圖15.12 高效液相色譜柱結(jié)構(gòu)示意圖15.2.4.3柱規(guī)格般采用直形柱管，標(biāo)準(zhǔn)填充柱柱管內(nèi)徑為4.6mm或3.9mm，長1050cm，填料粒度510µm時，柱效達(dá)500010000塊·m-1理論塔板數(shù)。使用35µm填料，柱長可減至510cm。當(dāng)使用內(nèi)徑在0.51.0 mm的微孔填充柱或內(nèi)徑為3050µm的毛細(xì)管柱時，柱長為1550cm。當(dāng)使用粗內(nèi)徑短柱或細(xì)內(nèi)徑長柱時，應(yīng)注意由于柱內(nèi)體積減小，由柱外效應(yīng)（是

40、指色譜柱之外的造成色譜峰展寬的成因，主要由進樣裝置、檢測池及它們與柱之間的連接管路所產(chǎn)生）引起的峰形擴展。此時應(yīng)對進樣器、檢測器和連接接頭作特殊設(shè)計以減少柱外死體積。15.2.4.4柱連接方式柱接頭通過過濾片與色譜柱管連接，在色譜柱管的上下兩端要安裝過濾片，過濾片一般用多孔不銹鋼燒結(jié)材料制成，此燒結(jié)片上的孔徑小于填料顆粒直徑，可阻擋流動相中的極小的機械雜質(zhì)以保護色譜柱，但流動相可順利通過。柱入口、出口的連接管的死體積愈小愈好，一般常用窄孔（內(nèi)徑0.13mm）的厚壁（1.52.0mm）不銹鋼管，以減少柱外死體積。15.2.4.5柱溫控制高效液相色譜在以下幾種情況須精確控制柱溫：在一些法定標(biāo)準(zhǔn)分析

41、方法中，要求保留時間具有再現(xiàn)性；必須通過改變柱溫來提高分離效率；對高分子化合物或粘度大的樣品，分析時柱溫必須高于室溫；對一些具有生物活性的生物分子，要求分析時柱溫應(yīng)低于室溫，防止活性成分失活；對某些組成復(fù)雜的樣品，在單一色譜柱不能實現(xiàn)完全分離，需要使用二維色譜技術(shù)；利用柱切換，使兩根色譜柱在不同柱溫下操作，以實現(xiàn)多組分的完全分離。一個理想的HPLC柱溫控制系統(tǒng)可以實現(xiàn)從低于室溫10 至80 柱溫的精確控制。對凝膠滲透色譜儀，其柱溫可從室溫至150實現(xiàn)精確控溫。15.2.5檢測器檢測器是高效液相色譜儀中的三大關(guān)鍵部件（高壓輸液泵、色譜柱、檢測器）之一，主要用于監(jiān)測經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度的變化，

42、被稱為色譜儀的“眼睛”，檢測器的性能直接關(guān)系著定性定量分析結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。一個理想的液相色譜檢測器應(yīng)具備以下特征：靈敏度高、對所有的溶質(zhì)都有快速響應(yīng)、響應(yīng)對流動相流量和溫度變化都不敏感、不引起柱外譜帶擴展、線性范圍寬、適用的范圍廣等，但沒有一種檢測器能完全具備這些特征。在高效液相色譜技術(shù)發(fā)展中，檢測器至今仍是一個薄弱環(huán)節(jié)，它沒有相當(dāng)于氣相色譜中使用的熱導(dǎo)檢測器和氫火焰離子化檢測器那樣既通用又靈敏的檢測器。但近幾年出現(xiàn)的蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）有望成為高效液相色譜全新的、通用靈敏的質(zhì)量檢測器。目前常用的檢測器有紫外吸收檢測器（UVD）、折光指數(shù)檢測器（RID）、和熒光檢測器（FD）。1

43、5.2.5.1檢測器的分類和響應(yīng)特征高效液相色譜儀的檢測器很多，分類方法也很多。（1）按照用途分類，可分為通用型和選擇性兩類。屬于通用型的有示差折光（有時也稱為折射指數(shù)，RI）、火焰離子化、電容等。它對大多數(shù)物質(zhì)的響應(yīng)相差不大幾乎適用于所有物質(zhì)。但它的靈敏度低，受溫度影響波動大，使用時有一定局限性。屬于選擇性檢測器的有紫外吸收、熒光、化學(xué)發(fā)光、安培、光導(dǎo)、極譜等。它們對被檢測物質(zhì)的響應(yīng)有特異性，而對流動相則沒有響應(yīng)或響應(yīng)很小，因此靈敏度很高，受操作條件變化和外界環(huán)境影響很小，可用作梯度淋洗。（2）按測量性質(zhì)分類，可分為濃度型和質(zhì)量型。前者與溶質(zhì)在溶液中的濃度有關(guān)，是總體性質(zhì)的檢測器。紫外吸收、

44、示差折光、熒光等屬于此類。后者與待測物的質(zhì)量有關(guān)，氫火焰、庫侖、同位素及質(zhì)譜中的總離子流等屬于質(zhì)量型。按測量原理又可分為光學(xué)檢測器和電學(xué)檢測器，此外還有利用熱學(xué)原理檢測的吸附熱檢測器。UVD、RID、FD三種檢測器皆屬于非破壞性檢測器，樣品流出檢測器后可進行餾分收集，并可與其它檢測器串聯(lián)使用。對熒光檢測器因測定中加入熒光試劑會對樣品產(chǎn)生污染，當(dāng)串聯(lián)性用時應(yīng)將它放在最后檢測。15.2.5.2紫外吸收檢測器紫外吸收檢測器（u1traviolet absorption detector，UVD）是高效液相色譜儀中使用最廣泛的一種檢測器，幾乎所有的高效液相色譜儀都配有紫外吸收檢測器。它的靈敏度較高，線

45、性范圍寬，對流速和溫度的變化不敏感，適用梯度洗脫，屬于溶質(zhì)性質(zhì)的檢測器，只能用于檢測能吸收紫外光的物質(zhì)，溶劑要選用無紫外吸收特性的物質(zhì)。（1）工作原理 紫外檢測器是吸收光譜分析類型的儀器，無論是何種設(shè)計方法，其工作原理都是基于朗伯-比耳定律。對于給定的檢測池，在固定的波長下（為定值），紫外檢測器應(yīng)輸出一個與樣品濃度（c）成正比的光吸收信號吸光度（A）。而檢測器光電元件的輸出信號與透過率成正比，所以為了定量計算方便，在儀器采用對數(shù)放大器，將透過率轉(zhuǎn)換成吸光度，使儀器輸出信號與樣品濃度成直線關(guān)系。因此紫外檢測器屬于濃度敏感型檢測器。（2）儀器結(jié)構(gòu) 紫外檢測器的基本結(jié)構(gòu)與一般紫外可見分光光度計是相同

46、的，均包括光源、分光系統(tǒng)、樣品池和檢測系統(tǒng)四大部分。隨高效液相色譜法的發(fā)展，紫外檢測器也發(fā)展為多種類型，用于滿足不同分析任務(wù)及各種紫外吸收物質(zhì)檢測的需求。紫外檢測器按波長來分，有固定波長和可變波長兩類。固定波長檢測器又有單波長式和多波長式兩種；可變波長檢測器可以按照對可見光的檢測與否分為紫外-可見分光檢測器和紫外分光檢測器，按波長掃描的不同又有不自動掃描、自動掃描和多波長快速掃描等。其中屬于多波長快速掃描的光電二極管陣列檢測器具有很多優(yōu)點，是高效液相色譜最有發(fā)展前途的檢測器。 固定波長紫外吸收檢測器（fixed wavelength UV detctor）顧名思義，是指光源發(fā)射不連續(xù)可調(diào)，只選

47、擇固定的單一光源波長作為檢測波長。這種檢測器結(jié)構(gòu)簡單，價格便宜，應(yīng)用范圍較寬，購買的液相色譜儀均配套有該檢測器。由低壓汞燈提供固定波長254nm（或280nm）的紫外光，其結(jié)構(gòu)如圖15.15所示。由低壓汞燈發(fā)出的紫外光經(jīng)入射石英棱鏡準(zhǔn)直、再經(jīng)遮光板分為一對平行光束分別進入流通池的測量臂和參比臂。經(jīng)流通池吸收后的出射光，經(jīng)過遮光板、出射石英棱鏡及紫外濾光片，只讓254nm的紫外光被雙光電池接收。雙光電池檢測的光強度經(jīng)對數(shù)放大器轉(zhuǎn)化成吸光度后，經(jīng)放大器輸送至記錄儀。圖15.15 紫外光度檢測器光路圖為減少死體積，流通池的體積很小，僅為5l0µL，光路約510mm，結(jié)構(gòu)常采用H形。此檢測器

48、結(jié)構(gòu)緊湊、造價低、操作維修方便、靈敏度高，適于梯度洗脫。 可變波長紫外吸收檢測器 是一種應(yīng)用非常廣泛的檢測器，雖然固定波長檢測器可以提供多種光源波長進行檢測，但可變波長檢測器的波長選擇是任意可調(diào)的，因此與固定波長檢測器相比，有以下優(yōu)點：可以選擇樣品的最大吸收波長作為檢測波長，提高檢測靈敏度；可以選擇樣品有強吸收而干擾無吸收的波長進行分析，提高分析的選擇性；可以選擇在梯度洗脫時，流動相改變，而其吸光度不變的波長下進行檢測，有利于梯度洗脫。可變波長紫外吸收檢測器，由于可選擇的波長范圍很大，既提高了檢測器的選擇性，又可選用組分的最靈敏吸收波長進行測定，從而提高了檢測的靈敏度。它還有停流掃描功能，可繪

49、出組分的光吸收譜圖，以進行吸收波長的選擇。 光電二極管陣列檢測器 圖15.16 可變波長紫外吸收檢測器光學(xué)系統(tǒng)圖1.氘燈 2.透鏡 3.濾光片 4.狹縫 5.反射鏡 6.光柵7.分束器 8.參比光電二極管 9.流通池 10.樣品光電二極管光電二極管陣列檢測器，又稱光電二極管列陣檢測器或光電二極管矩陣檢測器，表示為PDA（photo-diode array）、PDAD（photo-diode array detector）或DAD（diode array detector）。此外，還有的商家稱之為多通道快速紫外-可見光檢測器（multichannel rapid scanning UV-VIS

50、detector），三維檢測器（three dimensional detector）等。光電二極管陣列檢測器目前已在高效液相色譜分析中大量使用，一般認(rèn)為是液相色譜最有發(fā)展、最好的檢測器（見圖15.17）。圖15.17 二極管陣列檢測器光路示意圖光學(xué)多通道檢測技術(shù)不僅僅可以采用光電二極管陣列作為光電檢測元件。硅光導(dǎo)攝像管是首先被應(yīng)用到液相色譜陣列檢測器的光電檢測元件，但由于紫外響應(yīng)弱，成本比光電二極管陣列高，響應(yīng)慢等缺點而較少應(yīng)用。電荷耦合陣列檢測器（charge-coupied device array detector，CCD檢測器）具有很多優(yōu)異的性能，如光譜范圍寬、量子效率高、暗電流小、

51、噪聲低、線性范圍寬等。但CCD檢測器的紫外響應(yīng)弱，信號收率低，有礙它的進一步發(fā)展。其它的光電檢測元件同樣具有以上這些缺點，因此光電二極管成為目前最主要、最常用的光學(xué)多通道檢測技術(shù)的光電檢測元件。15.2.5.3折光指數(shù)檢測器折光指數(shù)檢測器（refractive index detector，RID）又稱示差折光檢測器（DRD），是1942年由Tiselius和Claesson首次提出的，是最早的在線液相色譜檢測器之一和最早的液相色譜商品檢測器。它是通過連續(xù)監(jiān)測參比池和測量池中溶液的折射率之差來測定試樣濃度的檢測器。由于每種物質(zhì)都具有與其他物質(zhì)不相同的折射率，因而RID是一種通用型檢測器。 溶液

52、的折射率等于溶劑及其中所含各組分溶質(zhì)的折射率與其各自的摩爾分?jǐn)?shù)的乘積之和。當(dāng)樣品濃度低時，由樣品在流動相中流經(jīng)測量池時的折射率與純流動相流經(jīng)參比池時的折射率之差，指示出樣品在流動相中的濃度。此類檢測器一般不能于梯度洗脫，因為它對流動相組成的任何變化都有明顯的響應(yīng)，會干擾被測樣品的監(jiān)測。示差折光檢測器一般可按檢測原理可分為反射式和偏轉(zhuǎn)式兩類。它們的共同特點是檢測器響應(yīng)信號反映了樣品流通池和參比池之間的折射率之差。圖15.18是偏轉(zhuǎn)式示差折光檢測器的光路圖。圖15.18 偏轉(zhuǎn)式示差折光檢測器的光路圖15.2.5.4熒光檢測器熒光檢測器（fluorescence detector，F(xiàn)D）是利用某些溶

53、質(zhì)在受紫外光激發(fā)后，能發(fā)射可見光（熒光）的性質(zhì)來進行檢測的。它是一種具有高靈敏度和高選擇性的檢測器，對不產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，可使其與熒光試劑反應(yīng)，制成可發(fā)生熒光的衍生物再進行測定。根據(jù)化合物發(fā)生熒光的條件和對化合物熒光強度檢測的要求，熒光檢測器包括以下基本部件：激發(fā)光源；選擇激發(fā)波長用的單色器；流通池；選擇發(fā)射波長用的單色器及用于檢測發(fā)光強度的光電檢測器。由光源發(fā)出的光，經(jīng)激發(fā)光單色器后，得到所需要的激發(fā)光波長。激發(fā)光通過樣品流通池，一部分光線被熒光物質(zhì)吸收，熒光物質(zhì)激發(fā)后，向四面八方發(fā)射熒光。為了消除入射光與散射光的影響，一般取與激發(fā)光成直角的方向測量熒光（直角光路）。熒光至發(fā)射光單色器分光后，

54、單一波長的發(fā)射光由光電檢測器接收。熒光檢測器的靈敏度比紫外吸收檢測器高100倍，可用于梯度洗脫，當(dāng)要對痕量組分進行選擇性檢測時，它是一種有力的檢測工具。但它的線性范圍較窄，不宜作為一般的檢測器來使用。測定中不能使用可熄滅、抑制或吸收熒光的溶劑作流動相。對不能直接產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，要使用色譜柱后衍生技術(shù)，操作比較復(fù)雜。此檢測器現(xiàn)已在生物化工、臨床醫(yī)學(xué)檢驗、食品檢驗、環(huán)境監(jiān)測中獲得廣泛的應(yīng)用。15.2.5.6蒸發(fā)光散射檢測器在高效液相色譜分析中，人們一直希望能有一臺像FID那樣的通用型質(zhì)量檢測器，它能對各種物質(zhì)均有響應(yīng)，且響應(yīng)因子基本一致，它的檢測不依賴于樣品分子中的官能團，且可用于梯度洗脫。目前最

55、能接近滿足這些要求的就是蒸發(fā)光散射檢測器（Evaporative Light scattering Detector，ELSD）。圖15.19為蒸發(fā)光散射檢測器工作原理示意圖。色譜柱后流出物在通向檢測器途中，被高速載氣（N2）噴成霧狀液滴。在受溫度控制的蒸發(fā)漂移管中，流動相不斷蒸發(fā)，溶質(zhì)形成不揮發(fā)的微小顆粒，被載氣載帶通過檢測系統(tǒng)。檢測系統(tǒng)由一個激光光源和一個光電倍增管構(gòu)成。在散射室中，光被散射的程度取決于散射室中溶質(zhì)顆粒的大小和數(shù)量。粒子的數(shù)量取決于流動相的性質(zhì)及噴霧氣體和流動相的流速。當(dāng)流動相和噴霧氣體的流速恒定時，散射光的強度僅取決于溶質(zhì)的濃度。此檢測器可用于梯度洗脫，且響應(yīng)值僅與光束中

56、溶質(zhì)顆粒的大小和數(shù)量有關(guān)，而與溶質(zhì)的化學(xué)組成無關(guān)。圖15.19 蒸發(fā)光散射檢測器示意圖蒸發(fā)光散射檢測器與RID和UVD相比，它消除了溶劑的干擾和因溫度變化引起的基線漂移，即使用梯度洗脫也不會產(chǎn)生基線漂移。它還具有噴霧器、漂移管易于清洗、死體積小、靈敏度高、噴霧氣體消耗少等優(yōu)點。此種檢測器在今后將會逐漸獲得廣泛應(yīng)用。15.2.6餾分收集器如果所進行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做其他波譜鑒定，或獲取少量試驗樣品的小型制備，餾分收集是必要的。用小試管收集，手工操作只適合于少數(shù)幾個餾分，手續(xù)麻煩，易出差錯。餾分收集器比較理想，因為便于用微處理機控制，按預(yù)先規(guī)定好的程序，或按時間，或按色譜

57、峰的起落信號逐一收集和重復(fù)多次收集。15.2.7色譜數(shù)據(jù)處理裝置現(xiàn)代高效液相色譜儀多用微處理機控制，這通常是一臺專用的計算機，其功能有二，一是作為數(shù)據(jù)處理機，例如輸入定量校正因子，按預(yù)先選定的定量方法（歸一化、內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法等），將面積積分?jǐn)?shù)換算成實際的成分分析結(jié)果，或者給出某些色譜參數(shù)；二是作為控制機，控制整個儀器的運轉(zhuǎn)，例如按預(yù)先編好的程序控制沖洗劑的選擇、梯度淋洗、流速、柱溫、檢測波長、進樣和數(shù)據(jù)處理。所有指令和數(shù)據(jù)通過鍵盤輸入，結(jié)果在陰極射線管或繪圖打印機上顯示出來。更新一代的色譜儀，應(yīng)當(dāng)具有某些人工智能的特點，即能根據(jù)已有的規(guī)律自動選擇操作條件，根據(jù)規(guī)律和已知的數(shù)據(jù)、信息，進行判斷，給出定性定量結(jié)果。15.3 高效液相色譜的固定相和流動相15.3.1固定相高效液相色譜采用小顆粒、高效能的固定相，從而克服了經(jīng)典液相色譜中傳質(zhì)慢、柱效低的缺點。目前，高效液相色譜采用的固定相可分為以下幾類。15.3.1.1按化學(xué)組成分類微粒硅膠（無機材料）、高分子微球（有機材料）和微粒多孔碳（有機/無機材料）是幾種主要的類型。310µm微粒硅膠和以此為基質(zhì)的各種化學(xué)鍵合固定相是目前高效液相色譜填料中占統(tǒng)治地位的化學(xué)類型。這是由于硅膠具有良好的機械強度，容易控制的孔結(jié)構(gòu)和表面積