醫(yī)學(xué)與生物安全

1、見習(xí)實(shí)習(xí)方案2010.9課程名稱：醫(yī)學(xué)與生物安全 課程編號(hào)：MED130197學(xué)分：2學(xué)時(shí)：36實(shí)習(xí)的目的與內(nèi)容目的：實(shí)驗(yàn)室生物安全是指在從事病原微生物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)室中避免病原微生物對(duì)工作人員和相關(guān)人員的危害，對(duì)環(huán)境的污染和對(duì)公眾的傷害，為了保證試驗(yàn)研究的科學(xué)性還要保護(hù)被試驗(yàn)因子免受污染。其措施包括強(qiáng)化工作和管理人員生物安全意識(shí)，建立規(guī)范化、法制化和日?；墓芾眢w系，加強(qiáng)人才的建設(shè)、培訓(xùn)，配備必要的物理、生物防護(hù)設(shè)施、設(shè)備，掌握規(guī)范的微生物操作技術(shù)和方法等。內(nèi)容：（一） 設(shè)施系統(tǒng)1-2（二） 個(gè)人防護(hù)3-4（三） 生物安全柜5-6（四） 清場7-8（五） 滅菌器9-10實(shí)驗(yàn)室生物安全基礎(chǔ)見習(xí)

2、實(shí)習(xí)指導(dǎo)（一）設(shè)施系統(tǒng)目的：闡述生物安全實(shí)驗(yàn)室的防護(hù)原則，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、設(shè)備的要求。初步了解生物安全實(shí)驗(yàn)室在建筑上的結(jié)構(gòu)特征，如實(shí)驗(yàn)室布局、送排風(fēng)系統(tǒng)等。材料與物品：復(fù)旦大學(xué)三級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)習(xí)步驟：生物安全實(shí)驗(yàn)室為“盒中盒”結(jié)構(gòu)，主要采用物理隔離分區(qū)與負(fù)壓通風(fēng)過濾技術(shù)。因此見習(xí)的重點(diǎn)為這兩個(gè)方面。A 物理隔離分區(qū)物理隔離（墻體）和密封門把實(shí)驗(yàn)室與公共環(huán)境分開，這里重點(diǎn)介紹BSL-3實(shí)驗(yàn)室由外到內(nèi)可以劃分為清潔區(qū)（更衣、淋?。⒕彌_區(qū)I、半污染區(qū)（準(zhǔn)備間）、緩沖區(qū)II、核心區(qū)（實(shí)驗(yàn)操作區(qū)）五個(gè)區(qū)域，其中緩沖區(qū)兩扇門互鎖，加上負(fù)壓通風(fēng)，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)氣流為定向流，方向?yàn)椋悍俏廴緟^(qū)半污染區(qū)

3、核心區(qū)。見習(xí)要點(diǎn)：控制室內(nèi)PLC控制系統(tǒng)上實(shí)驗(yàn)室平面分區(qū)圖告知分區(qū)設(shè)置、進(jìn)出路線。B 負(fù)壓通風(fēng)過濾技術(shù)負(fù)壓通風(fēng)過濾主要應(yīng)用于BSL-3/4、ABSL-3/4。在BSL-3實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)設(shè)計(jì)中，要求各區(qū)室之間氣壓保持一定的壓力梯度，且走向恒定（此處不是指實(shí)驗(yàn)室任何時(shí)刻氣流都是在房間與房間之間竄動(dòng)，而是指各區(qū)之間門打開時(shí)，不出現(xiàn)倒灌現(xiàn)象）。因此要求風(fēng)機(jī)開啟時(shí)先排后送，關(guān)閉時(shí)，先送后排。核心區(qū)與半污染區(qū)的空氣一律要經(jīng)HEPA過濾后排放。因此其安裝位置應(yīng)盡量減少污染范圍，即HEPA盡可能靠近污染源。按照GB19489-2004要求，BSL-3實(shí)驗(yàn)室應(yīng)頂部送風(fēng)，下面排風(fēng)，且送風(fēng)口與排風(fēng)口呈對(duì)角分布。另HEP

4、A安裝在排風(fēng)口的最前端。BSL-3實(shí)驗(yàn)室空氣排出方向：室內(nèi)前端HEPA末端HEPA（BIBO）環(huán)境安全柜內(nèi)空氣：安全柜內(nèi)安全柜HEPA排放管道末端HEPA外環(huán)境見習(xí)要點(diǎn)：機(jī)房內(nèi)告知其新風(fēng)采集、過濾；排風(fēng)中BIBO布置，風(fēng)管走向、排風(fēng)口設(shè)置。注意事項(xiàng)：1實(shí)習(xí)過程中禁止亂碰觸摸實(shí)驗(yàn)室內(nèi)設(shè)施設(shè)備2.實(shí)習(xí)過程中實(shí)驗(yàn)室內(nèi)按鈕、開關(guān)未經(jīng)允許禁止隨意按下附：見習(xí)過程中需介紹到的內(nèi)容：1. 位置：建筑物中自成隔離區(qū)（帶出入控制）或?yàn)楠?dú)立建筑物2. 平面布局：分區(qū)組成、安全門設(shè)置位置、傳遞窗使用、安全柜位置原理入口等3. 維護(hù)結(jié)構(gòu)：抗震防火 密封 避污染 門自動(dòng)關(guān)閉、發(fā)光指示、防嚙齒類節(jié)肢動(dòng)物進(jìn)入等4. 通風(fēng)系

5、統(tǒng)：A獨(dú)立的送排風(fēng)系統(tǒng)確保氣流走向與壓力梯度B送風(fēng)與排風(fēng)對(duì)角分布，上送下排，降低氣流死角與渦流形成C送排風(fēng)為直排式，不得采用回風(fēng)結(jié)構(gòu)DBSC內(nèi)氣體經(jīng)HEPA直接排出，確保BSC與排風(fēng)系統(tǒng)平衡E送風(fēng)經(jīng)初、中、高三級(jí)過濾，保證污染區(qū)的靜態(tài)潔凈度為7-8級(jí)，10W-1w級(jí)F排風(fēng)口直排，遠(yuǎn)離送風(fēng)口，設(shè)置在主導(dǎo)風(fēng)下風(fēng)向，高出建筑物2m，防雨鼠蟲GHEPA安裝在送風(fēng)末端，排風(fēng)前端H安裝牢固，部件氣密，HEPA更換前消毒，更換后焚燒消毒，年檢制度I送排風(fēng)安裝氣密閥，必要時(shí)進(jìn)行房間化學(xué)熏蒸J安裝風(fēng)機(jī)與安全柜啟動(dòng)連鎖裝置，確保實(shí)驗(yàn)室不出現(xiàn)正壓與確保生物安全柜內(nèi)氣流不倒流，排風(fēng)機(jī)一用一備，K核心區(qū)與半污染區(qū)不應(yīng)另

6、外安裝分體空調(diào)、暖風(fēng)、電風(fēng)扇等5. 環(huán)境參數(shù)：A室內(nèi)負(fù)壓，核心區(qū)-50Pa左右，半污染與實(shí)驗(yàn)室之間相對(duì)-30Pa，半污染區(qū)的相對(duì)壓力以（-20+-5）Pa為宜，B實(shí)驗(yàn)室溫度以人體舒適范圍為宜，相對(duì)濕度不超過70%C空氣潔凈度1-10w級(jí)D照明均勻，不炫目，不反光，工作照度不大于500lxF噪聲不超過65dB6. 其它A臺(tái)面防水耐熱耐腐蝕B家具牢固易清潔，邊角光滑無毛刺C最好不要使用真空泵，如需要真空管線接入在線高效過濾器，且不影響室內(nèi)的負(fù)壓D壓縮鋼瓶放于實(shí)驗(yàn)室外E安全出口應(yīng)有長效發(fā)光指示標(biāo)識(shí)F電源確保實(shí)驗(yàn)室工作期間有不間斷的電力供應(yīng)G實(shí)驗(yàn)室入口處的顯著位置安裝聲光報(bào)警壓力顯示裝置H通訊系統(tǒng) 如

7、電話、傳真、計(jì)算機(jī)等實(shí)驗(yàn)室生物安全基礎(chǔ)見習(xí)實(shí)習(xí)指導(dǎo)（二）個(gè)人防護(hù)部分目的：1. 掌握各種個(gè)人防護(hù)用品的正確使用方法，穿脫步驟。 2. 理解不同危害等級(jí)使用不同的個(gè)人防護(hù)用品 3. 了解個(gè)中個(gè)人防用品的工作原理準(zhǔn)備物品：口罩（N95，普通），手套，防護(hù)服（聯(lián)體，反穿），鞋套，靴套，袖套，帽子，面罩N95口罩個(gè)人密合適合性檢測系統(tǒng)；正壓呼吸系統(tǒng)步驟：1 以進(jìn)入的實(shí)驗(yàn)生物安全等級(jí)為基礎(chǔ)，考慮個(gè)人防護(hù)級(jí)別及防護(hù)要求的重點(diǎn)。2 清查所需個(gè)人防護(hù)用品是否齊全。3 任何個(gè)人防護(hù)用品使用前務(wù)必檢查其質(zhì)量，確保安全。4 穿戴過程：5 脫防護(hù)用品過程：注意事項(xiàng)：1 同一層次防護(hù)，手套腕部需蓋過防護(hù)服腕部；2 須選

8、擇自己適合的尺寸；3 N95口罩需要先進(jìn)行個(gè)人密合適合性試驗(yàn)。4 應(yīng)急情況下，視具體情況使用正壓呼吸系統(tǒng)。1）使用前準(zhǔn)備：設(shè)備應(yīng)完好、無損、安裝正確，使用前應(yīng)更換任何損壞或有缺陷部件；根據(jù)使用的使用說明對(duì)面罩做使用前檢查；使用前，檢查i.s.電機(jī)罩，將腰帶安裝在電動(dòng)送風(fēng)裝置上。2）電池提前充電，3）校準(zhǔn)，4）檢查濾罐，5）檢測流量，6）連接裝置，7）調(diào)整面罩，8）注意事項(xiàng)：注意防止呼吸管卷繞在突出的物體上；使用中若進(jìn)入面罩的氣流停止，或流量降低且有警報(bào)，或感覺到有異味，應(yīng)立即撤出污染區(qū)，檢查故障原因。9）摘卸：應(yīng)先撤出污染區(qū)域，再將面罩從頭上取下后，關(guān)閉電源，解開腰帶。穿戴防護(hù)用品過程 脫去防

9、護(hù)用品過程實(shí)驗(yàn)室生物安全基礎(chǔ)見習(xí)實(shí)習(xí)指導(dǎo)（三）生物安全柜目的：1. 掌握生物安全柜內(nèi)感染性物質(zhì)操作的一般準(zhǔn)則和技術(shù)要點(diǎn)； 2. 熟悉生物安全柜運(yùn)行的一般規(guī)則； 3. 了解生物安全柜故障時(shí)的一般處理原則。準(zhǔn)備物品：1. 培養(yǎng)液、TRIZOL2. 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、病毒收集瓶、15ml離心管3. 廢物缸、廢液缸、廢物盒實(shí)驗(yàn)步驟：1. 個(gè)人防護(hù)裝備：口罩，手術(shù)帽，手套（內(nèi)白外蘭），防水衣，鞋套2. BSC的準(zhǔn)備: 啟動(dòng)程序，清潔，UV消毒3. 物品清單，物品運(yùn)入及擺放（見附圖）4. 實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)一：樣品離心，3000rpm 5。防氣溶膠操作方法5. 實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)二：感染上清收集，防意外接種及氣溶膠操作方法。6.

10、物品退出BSC: 實(shí)驗(yàn)樣品，干凈物品，廢物7. BSC清潔: 酒精擦拭8. 廢棄物處理: 高壓滅菌程序9. 結(jié)束實(shí)驗(yàn): 防護(hù)服脫卸，洗手附：BSC內(nèi)物品擺放示意圖（for the right-hand）污染區(qū)域清潔區(qū)域?qū)嶒?yàn)區(qū)域?qū)嶒?yàn)步驟及記錄時(shí)間： 實(shí)驗(yàn)人員 ： 實(shí)驗(yàn)室：物品準(zhǔn)備：1. 培養(yǎng)液、TRIZOL2. 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、病毒收集瓶、15ml離心管3. 廢物缸、廢液缸、廢物盒實(shí)驗(yàn)步驟：1. 將帶入的H9細(xì)胞，廢物缸、廢液瓶、廢物盒、離心管、Trizol試劑等實(shí)驗(yàn)必需品按相對(duì)污染與清潔區(qū)依次放置。2. 分別將已接種HIV的H9細(xì)胞從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，編號(hào) ，置顯微鏡下觀察，記錄見下。3. 在安全柜正

11、中靠操作者處鋪上吸水墊，噴上75%酒精。4. 吸出已接種HIV的H9細(xì)胞懸液，編號(hào) ，移入15ml離心管。5. 將離心管在安全柜內(nèi)放入離心杯中，噴消毒液，更換手套，帶出離心。6. 轉(zhuǎn)/分鐘，離心 分鐘。7. 將離心杯帶入安全柜內(nèi)，取出離心管。離心杯噴灑消毒劑后取出。8. 分別將上清以每個(gè)ependorf管0.5ml分裝，標(biāo)記保種，共 管，標(biāo)記 。放入密封盒，記錄見附表。9. 分別吸取 ml病毒上清至帶入的未接種H9細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，輕搖培養(yǎng)瓶混合，使病毒上清充分接觸細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)瓶外表面噴灑消毒劑后，拿出安全柜后放入培養(yǎng)箱。標(biāo)記 。10. 將剩余上清 ，注意不要將沉淀細(xì)胞懸起。11. 吸取 微升T

12、rizol加入細(xì)胞沉淀，混勻后吸出，移入1.5ml離心管，標(biāo)記 ，放入密封盒，外表面噴灑消毒劑后，拿出安全柜。12. 將吸水墊收起放入廢物盒，雙手噴上消毒劑，脫去外層手套，重戴干凈手套。13. 將安全柜內(nèi)物品噴灑消毒劑后取出，取出順序?yàn)楦蓛舻奈锲废热〕?，廢棄物收集盒最后取出。最后將安全柜臺(tái)面噴灑消毒劑后，從干凈區(qū)域到污染區(qū)域的順序擦拭清潔。脫去外層手套帶出。14. 換上干凈外層手套，關(guān)上安全柜窗口，打開紫外，定時(shí)15分鐘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)意外情況及處理：實(shí)驗(yàn)室生物安全基礎(chǔ)見習(xí)實(shí)習(xí)指導(dǎo)（四）清場、消毒與廢棄物處理目的：1.掌握實(shí)驗(yàn)后清場的基本操作程序；2.了解消毒的原理及原則；3.了解污染廢棄物處

13、理的基本程序。準(zhǔn)備物品：4. 培養(yǎng)液、TRIZOL5. 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、病毒收集瓶、15ml離心管6. 廢物缸、廢液缸、廢物盒7. 滅菌整理箱，生物安全廢物袋、滅菌指示帶、消毒劑（乙醇、新潔爾滅、氯）。步驟：1. 良好的實(shí)驗(yàn)行為規(guī)范是生物安全防護(hù)的重要保證，正確的清場程序是良好的實(shí)驗(yàn)行為規(guī)范的一部分。2. 清場可分為日常實(shí)驗(yàn)后清場和實(shí)驗(yàn)對(duì)象變更后清場。3. 消毒劑的分類、消毒原理，配置方法以及消毒劑的選擇。4. 清場消毒的操作規(guī)程：（1） 日常實(shí)驗(yàn)過程按照不同的實(shí)驗(yàn)安全操作規(guī)程進(jìn)行。（2） 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，由實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行清場，首先更換新的外層手套。（3） 處理實(shí)驗(yàn)樣品如：取出實(shí)驗(yàn)樣品放回冰箱，取出細(xì)胞

14、培養(yǎng)瓶放回37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（4） 取出所有未使用的物品如：未拆包裝的移液管等。（5） 在使用過的移液器表面上噴灑75%乙醇，然后取出移液器放入抽屜中。（6） 將實(shí)驗(yàn)區(qū)域的吸水紙巾折疊好放入廢物盒中。（7） 將廢物盒中廢物整理好，拉起廢物袋，用膠帶將袋口扎好但不可過緊，貼好滅菌指示膠帶或放入滅菌指示劑，并在指示膠帶上寫明消毒日期。將廢液瓶放入廢物盒中。蓋上廢物盒的蓋子，然后在盒子表面噴灑75%乙醇。（8） 更換一副新的外層手套。（9） 取出廢物盒放入滅菌整理箱中。（10） 用75%乙醇清潔安全柜內(nèi)清潔區(qū)域、污染區(qū)域及實(shí)驗(yàn)區(qū)域所有表面，并用紙巾擦干。（11） 更換一副新的外層手套。（12） 關(guān)閉

15、生物安全柜，設(shè)置UV照射。（13） 退出實(shí)驗(yàn)室，帶出實(shí)驗(yàn)后的廢棄物，進(jìn)行高壓滅菌。（14） 60min后關(guān)閉通風(fēng)系統(tǒng)。（15） 每周對(duì)地面和墻面消毒清潔一次。5. 所有滅菌消毒處理后的廢物作為危險(xiǎn)廢棄物收集于洗滌室的醫(yī)療廢棄物回收桶內(nèi)，廢棄物應(yīng)放置整齊，然后蓋好回收桶的桶蓋。6. 所有滅菌消毒處理后的廢棄物送往指定的單位進(jìn)行焚燒處理，定點(diǎn)單位定期到實(shí)驗(yàn)室收取需要做焚燒處理的廢棄物。實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理人員和焚燒單位工作人員共同完成廢棄物回收記錄。實(shí)驗(yàn)室生物安全基礎(chǔ)見習(xí)實(shí)習(xí)指導(dǎo)（五）高壓蒸汽滅菌器的使用目的：1.掌握滅菌的原理和條件；2.了解高壓蒸汽滅菌器的使用。準(zhǔn)備物品：高壓蒸汽滅菌器，滅菌整理箱

16、，生物安全廢物袋、滅菌指示帶/劑、化學(xué)指示卡。步驟：1. 滅菌的方法和原理。2. 滅菌器的種類、構(gòu)造和工作原理。3. 雙扉高壓滅菌器的操作規(guī)程：3.1準(zhǔn)備工作：（1） 開啟中控室總電源。（2） 確認(rèn)水箱水位及水質(zhì)。（3） 確認(rèn)內(nèi)室及夾套壓力。（4） 確認(rèn)真空泵，壓縮泵。（5） 確認(rèn)清潔側(cè)門。3.2使用程序：（1） 將滅菌室墻上所有電源開關(guān)置于向上接通電源，壓縮泵啟動(dòng)，。（2） 打開控制系統(tǒng)電源，啟動(dòng)滅菌器。（3） 按住污染側(cè)門（后門）開門按鈕，將滅菌物品均勻地放入到滅菌器內(nèi)室中，同時(shí)放入生物滅菌指示劑。按住后門關(guān)閉按鈕，關(guān)閉電動(dòng)門直到門墊圈充氣封緊為止。（4） 點(diǎn)擊控制面板觸摸屏上的run模塊

17、，進(jìn)入滅菌器控制系統(tǒng)。（5） 面板左上方顯示當(dāng)前所處的行程，右上方顯示當(dāng)前使用的程序，下方顯示“程序”“檢測”“啟動(dòng)”和“校溫”四個(gè)可點(diǎn)擊的模塊。面板中間顯示滅菌器當(dāng)前的條件狀態(tài)包括：空氣源，蒸汽源，水源以及前后門的狀態(tài)和夾套溫度和壓力。（6） 點(diǎn)擊面板畫面中“程序”模塊，畫面即進(jìn)入程序選擇界面，顯示以下六種程序：輔料類，器械類，凈化，液體類，下排汽和動(dòng)物類。點(diǎn)擊需要選擇的程序模塊。設(shè)定完畢后點(diǎn)擊確定模塊即完成程序的設(shè)定。（7） 選擇程序完畢后，滅菌器進(jìn)入準(zhǔn)備行程，蒸汽發(fā)生器產(chǎn)生蒸汽，夾套壓力不斷上升?？牲c(diǎn)擊“檢測”模塊，顯示輸入輸出通斷狀態(tài)，點(diǎn)擊“返回”模塊，則返回目前行程。當(dāng)面板顯示“空氣源開關(guān)閉合 蒸汽源開關(guān)閉合 水源開關(guān)閉合 前門關(guān)閉 后門關(guān)閉”，壓力表顯示超過0.2MPa，以上條件均滿足的時(shí)候，可點(diǎn)擊觸摸屏上“啟動(dòng)”模塊，啟動(dòng)滅菌程序。（8） 當(dāng)滅菌程序所有行程進(jìn)行完畢以后，面板顯示“行程完畢，可開門”，壓力表顯示壓力為0MPa，開門燈亮起，此時(shí)可按住前門開門按鈕，打開前門，取出滅菌物品，觀察生物指示劑變色情況以檢測滅菌效果。如果滅菌效果