生物標記檢測在神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷中的研究進展

1、352 2009年12月 Journal of Jilin Medical College Dec.2009文章編號:16732995(200906-0352-06生物標記檢測在神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷中的研究進展Study progress on biomarker detection in glioma diagnosis綜述郭素紅1,盧 潔2,于常海2(1.吉林醫(yī)藥學院,吉林吉林 132013;2.北京大學神經(jīng)科學研究所,北京 100083摘 要:神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見而又最難治的惡性腫瘤,因其部位的特殊性,造成診斷困難,因而 尋找膠質(zhì)瘤特異性生物標記的診斷變得更為重要。生物標記物是近些年

2、來出現(xiàn)在醫(yī)學研究領(lǐng)域上的熱點,它 作為可供客觀測定和評價的一個生化或分子生物學指標,反映機體當前所處的生物學狀態(tài)及進程。檢測一種 疾病特異性的生物標記物,對于疾病的鑒定、早期診斷、預防、預后及治療過程中的監(jiān)控可起到關(guān)鍵的輔助作 用。本文將通過對近些年來出現(xiàn)在血液、腦脊液、組織中用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷的生物標記的特性、檢測方法及 適用性進行綜述。關(guān)鍵詞:神經(jīng)膠質(zhì)瘤;生物標記中圖分類號:R543.1文獻標識碼:A神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma是一種起源于膠質(zhì)細胞的 中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤,是顱內(nèi)最常見的腫瘤之 一,目前,對于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷主要依賴影像學的 檢查和術(shù)后病理組織切片的實驗室分析,此方法的局 限

3、性在于取樣不便,也不能及時診斷和跟蹤治療效 果。因此,尋找其他特異性的診斷指標對膠質(zhì)瘤患者 進行明確診斷已成為近年來的研究熱點。生物標記 物(biomarker作為反映器官功能或健康狀況的一個 指標,可以用一種蛋白或核酸的水平變化或狀態(tài)的改 變來指示疾病的發(fā)生和發(fā)展1引。針對生物標記的研 究已經(jīng)開展幾十年了,但直到最近,生物標記與臨床 診斷應(yīng)用的相關(guān)性才取得了一些進展。除經(jīng)典的膠 質(zhì)瘤生物標記,如透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白、神經(jīng)巢蛋白、神 經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE、S100蛋白等外,以下是 近些年來出現(xiàn)的與神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷相關(guān)的生物標記, 按它們在檢測標本中存在的情況大體分為兩類。1血液和腦脊液中的生物

4、標記對血液和腦脊液中的生物標記用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤 診斷的檢測在研究領(lǐng)域中曾被認為是一種挑戰(zhàn),也是 目前研究的熱點。從膠質(zhì)瘤的血瘤屏障特點看,膠質(zhì)作者簡介:郭素紅(1968一,女(漢族,副教授,碩士 瘤附近的血腦屏障由于瘤細胞的侵襲及形態(tài)異質(zhì)性 而被破壞,且腫瘤內(nèi)毛細血管的通透性高,因此膠質(zhì) 瘤細胞或分泌、或壞死的相關(guān)生物標記就游離到腦脊 液中,進而流入血液中,所以為血液和腦脊液中生物 標記的存在提供了理論依據(jù),目前,出現(xiàn)在血液和腦 脊液中的膠質(zhì)瘤標記有如下幾種:1.1AttractinAttractin是細胞黏附和指導蛋白CUB家族的成 員之一,最初被鑒定為一種可溶性的人血漿蛋白,它 具有二肽基肽

5、酶活性。同時是控制色素沉著和能 量代謝的鼠紅褐色基因的產(chǎn)物。人attractin的基因 結(jié)構(gòu)揭示可溶性attractin來自于人20p13的25個連 續(xù)的外顯子轉(zhuǎn)錄,因可變剪接ATRN基因而以 175kDa分泌形式和200kDa的跨膜形式存在,J。分 泌型的attractin是一種血清糖蛋白,但正常生理情況 下在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中缺乏,并在腦脊液中不能測得。 Khwaja等H o發(fā)現(xiàn)97%的惡性膠質(zhì)瘤患者的腦脊液中 attractin升高,以4級膠質(zhì)瘤中升高最為明顯。免疫 組化證實attracfin是由腫瘤細胞產(chǎn)生和分泌的,這種 蛋白對惡性膠質(zhì)瘤的病人是特異的,并證實來自于膠 質(zhì)瘤病人的腦脊液促使

6、膠質(zhì)瘤細胞株遷移。由此可 見,對惡性膠質(zhì)瘤來說attractln是一種分泌性蛋白, 并提示它可能是一種促進腫瘤侵襲的重要因子。它 的侵襲力是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性特征和難以治療的主萬方數(shù)據(jù)第6期 郭素紅,等.生物標記檢測在神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷中的研究進展 一353一要原因,同時也是未來治療的一個潛在靶標。1.2甲基化腫瘤特異性DNA血漿和血清中腫瘤DNA的出現(xiàn)反映腫瘤凋亡與 壞死比率的生物學特性。在致癌作用期間出現(xiàn)了很 多與關(guān)鍵基因缺失相關(guān)的異?；騿幼蛹谆?。 這種甲基化基因含量的改變對早期腫瘤發(fā)生及癌癥 進展或轉(zhuǎn)移的形成有著顯著的生物學含義。啟動子 區(qū)甲基化對腫瘤抑制基因、DNA修飾基因和轉(zhuǎn)移抑 制

7、基因的轉(zhuǎn)錄沉默起關(guān)鍵作用,同時與其他癌癥相關(guān) 基因改變的遺傳缺陷相關(guān)聯(lián)"j。l臨床上表現(xiàn)為腫瘤 病人的血漿和血清中的甲基化DNA可作為早期非浸 襲性篩查的危險率估計,以及對新生腫物監(jiān)測的特 異、敏感的生物標記。非腫瘤性病人血漿中的總DNA含量很低,通常 小于100Ixg/mL。而Weaver等用甲基化特異性多 聚酶鏈反應(yīng)的方法分別檢測膠質(zhì)瘤患者血漿和腫瘤 組織中p16、p73、RARl3和MGMT甲基化基因啟動 子,結(jié)果顯示,膠質(zhì)瘤患者血漿中總的DNA濃度明顯 增高。因此推斷膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生大量的DNA進入血 液,這些病人血漿腫瘤特異性DNA的檢測可用于開 展定量監(jiān)測腫瘤狀態(tài)的神經(jīng)膠質(zhì)

8、瘤血漿生物標記的 第一步。兩年后,WeaverL61和他的研究小組進一步證 實了相同的結(jié)論。1.3膠質(zhì)纖維酸性蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP為中間絲蛋白,是星形膠質(zhì)細胞的特異性標記 物,但也存在于其他類型細胞(如上皮細胞的早期 發(fā)育階段。xu等口。采用免疫組化染色的方法發(fā)現(xiàn)各 型星形膠質(zhì)瘤中GFAP表達呈陽性反應(yīng);對GFAP陽 性細胞計數(shù),可見隨著病理分級增高,GFAP陽性細 胞數(shù)減少,兩兩比較顯示,級與級、級間差異顯 著(P<0.05,而級與級間差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05?？梢娦切渭毎鲋蠫FAP免疫反應(yīng)強

9、度對判斷預后有一定意義。Brommeland等【8】采用ELISA法對3l例高級別 的膠質(zhì)瘤病人血清中的GFAP和SIOOB進行檢測,同 時結(jié)合臨床數(shù)據(jù)庫的影像資料和組織學變化來進行 統(tǒng)計分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)52%的患者血清中GFAP升高, 而只有6.8%的患者S100B升高。腫瘤大小與血清 中GFAP水平相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.67。表明在診斷 高級別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤時,與S100B相比,GFAP為相 對更可靠的生物標記。 1.4胰島素樣生長因子和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋 白2胰島素樣生長因子(insulinlike gro叭h factor, IGF是一類多肽類生長因子,它作為一種重要的促 有絲分裂原在腫

10、瘤細胞的惡性增殖、細胞周期調(diào)節(jié)、 拮抗凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)移等方面起著重要作用。一些研 究顯示:IGF與患癌癥的風險相關(guān)。L6nnl9o采用巢式 病例對照的方法探討血清中IGF一1和IGF結(jié)合蛋白3 (IGFBP3與患膠質(zhì)瘤的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)IGFBP3與患 神經(jīng)膠質(zhì)瘤間沒有統(tǒng)計學聯(lián)系,而IGF一1與患神經(jīng)膠 質(zhì)瘤呈負相關(guān)。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2(insulin-like growth factor binding protein 2,IGFBP2是IGF超家族 成員之一,可由多種神經(jīng)組織合成,是腦脊液中含量 最豐富的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP,腦內(nèi) 合成部位主要為脈絡(luò)叢和軟腦膜,與大腦發(fā)育

11、有關(guān)。 Sallinen等¨剛通過cDNA微陣列及組織芯片技術(shù)發(fā) 現(xiàn),多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM中IGFBP2有高表 達,其表達水平越高,預后越差。可見IGFBP2可作 為對神經(jīng)膠質(zhì)瘤預后的一個特異性標志物。金屬基質(zhì)蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP.9是一種自明膠溶解酶B,大小為92kDa,研究 發(fā)現(xiàn)許多惡性腫瘤細胞都分泌MMP-9,它在促血管 生成、腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移灶形成中起作用。YKL一 40作為哺乳動物甲殼酶樣蛋白的成員之一,由幾種 實體瘤分泌與表達。在對組織改造過程中顯現(xiàn)出細 胞生長因子活性。YKL-40可能在癌細胞增殖、生存、 入

12、侵、腫瘤周圍的炎癥、血管生成以及細胞外基質(zhì)的 重建中起作用。Hormigo等121把血清中YKL40 (一種糖蛋白,關(guān)節(jié)破壞指標和MMP-9的水平結(jié)合 用于各期神經(jīng)膠質(zhì)瘤病人診斷的潛在生物標記,提示 在GBM中是否存在轉(zhuǎn)移以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤病人手術(shù)后 的復發(fā)情況。這需要用大量病人進行縱向調(diào)查研究 來進一步證實。2組織中的生物標記目前,由于在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中,腫瘤組織 中的某些特異性標記物不能大量進入血液及腦脊液 中,而是存在于腫瘤細胞中,組織中癌細胞形態(tài)檢測 依然是診斷惡性腫瘤的金標準,而細胞化學染色是鑒 別惡性腫瘤類型的主要依據(jù)。臨床上常用細胞或組萬方數(shù)據(jù)吉林醫(yī)藥學院學報2009年12月

13、第30卷織化學染色的方法來定位這些特異性標記物的存在。 目前用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織診斷的生物標記有:PTEN、 存活素、VEGF、GGs、HPSE、端粒酶等。2.1PTENPTEN(phosphatase and tension homology deletedOn ehrom080me ten是一個與很多癌癥相關(guān)的腫瘤抑 制基因,位于10q23.3染色體,全長200kb,其蛋白的 分子量為47.1kD,是編碼403個氨基酸的多肽鏈, 具有雙特異性磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸酶活性,有促進 細胞凋亡、參與細胞周期的調(diào)控以及抑制細胞的粘附 及腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。PTEN標記至少由9個基因組 成,一些與腫瘤形成相

14、關(guān)。Steck等131通過等位基因 缺失分析發(fā)現(xiàn)PTEN的突變主要發(fā)生于GBM,而很 少發(fā)生于低惡性度膠質(zhì)瘤中。Zhou等¨41對46例膠 質(zhì)瘤標本進行DNA測序,發(fā)現(xiàn)PTEN突變在間變性 星形細胞瘤中發(fā)生率為23%,在GBM中發(fā)生率為 36%,而在19例低度惡性膠質(zhì)瘤中,沒有發(fā)現(xiàn)PTEN 基因的改變。這種只發(fā)生在高侵襲膠質(zhì)瘤中的 PTEN突變,提示PTEN可能與膠質(zhì)瘤的惡性進展過 程有關(guān),可以作為判斷膠質(zhì)瘤預后的重要指標。2.2存活素存活素(survivin是一種凋亡抑制基因,在人胚 胎組織和多種腫瘤組織中高表達,而在分化成熟的正 常組織中則不表達或低表達。目前已發(fā)現(xiàn)存活素在 人類

15、很多惡性腫瘤中表達,并與腫瘤的增殖、凋亡、血 管生成、預后和耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)¨引。Uematsu 等1酬發(fā)現(xiàn)有存活素表達的膠質(zhì)瘤患者總生存期明顯 縮短,提示存活素表達在腦膠質(zhì)瘤中有明確的預后價 值。Jiao等¨刊的實驗發(fā)現(xiàn)存活素表達的強度和程度 與腫瘤的分級有相關(guān)性,在多形性膠質(zhì)母細胞瘤中表 達最強,而在纖維狀星形膠質(zhì)細胞瘤和多形性黃色星 形細胞瘤中的陽性表達較弱。Pan等u引采用免疫組 織化學方法證明survivin在膠質(zhì)瘤細胞漿中有表達, 但其表達與膠質(zhì)瘤的預后無關(guān),而Survivin細胞核表 達與膠質(zhì)瘤的病理學分級呈正相關(guān),是膠質(zhì)瘤預后的 不利因素,可以作為膠質(zhì)瘤

16、預后評估的生物標記。 2.3血管內(nèi)皮細胞生長因子血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial cellgrowth factor,VEGF是主要促進血管再生的生長因 子,可促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移,增加局部毛細血管通 透陛,支持并誘導毛細血管長入,在正常及良性增生 的組織中不表達。目前多數(shù)文獻認為VEGF的表達 主要與Ras癌基因突變有關(guān),但在膠質(zhì)瘤中Ras的表 達水平并不高,VEGF的高水平表達可能是由于EGF 基因的過表達而刺激VEGF過度表達。另外,由于瘤 體內(nèi)缺氧,反向激活增強因子刺激VEGF的mRNA 所致¨9【。研究進一步發(fā)現(xiàn)】,膠質(zhì)瘤中的壞死區(qū)有 大量V

17、EGF表達,VEGF的酪氨酸激酶受體(VEGFR 則出現(xiàn)在腫瘤內(nèi)皮細胞中,在正常的成人腦內(nèi)皮細胞 中則不表達?？梢娙祟惿窠?jīng)膠質(zhì)瘤的腫瘤血管生成 是由VEGF及其受體VEGFR共同參與調(diào)節(jié)的,由于 VEFG在惡性膠質(zhì)瘤內(nèi)的高表達,因此可用做惡性膠 質(zhì)瘤的輔助診斷、監(jiān)狽4腫瘤復發(fā)等常用的生物標記 物。2.4神經(jīng)節(jié)苷脂神經(jīng)節(jié)苷脂(Gangliosides,GGs是一種小分子量 的糖脂類復合物質(zhì),能穿過血腦屏障進入大腦,鑲嵌 在受損的神經(jīng)細胞膜上,修復受損的神經(jīng)。GGs有害 的變異與腫瘤的進展及侵襲有關(guān),被認為是腫瘤的生 物標記和治療的靶標。Vukelie等拉¨使用蛋白組學 分析技術(shù),用薄層

18、分析系統(tǒng)分析GGs在神經(jīng)膠質(zhì)肉 瘤與正常腦組織中的組成特性。結(jié)合質(zhì)譜分析能夠 同時對73個不同GGs種類的結(jié)構(gòu)進行分析。根據(jù) 質(zhì)譜分析的方法對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的幾乎全部的GGs組 成杼陛檢測,能夠提供一個與鞘糖脂相關(guān)的在腦腫瘤 生物學、特定診斷、預測和新的治療理念的基本結(jié)構(gòu) 信息。這是一個高靈敏度和高精確度的檢測手段,需 要更多的研究來驗證。2.5類肝素酶類肝素酶(Heparanase,HPSE是近年來發(fā)現(xiàn)的 體內(nèi)唯一能夠降解主動脈內(nèi)膜的重要組成成分(硫 酸乙酰肝素蛋白多糖的一種內(nèi)切糖苷酶,破壞基底 膜和細胞外基質(zhì)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu),促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn) 移,除此以外,HPSE還參與腫瘤血管的生成。Ueno

19、等口21通過檢測發(fā)現(xiàn)類肝素酶mRNA在GBM病人體 內(nèi)不能檢測到,而在轉(zhuǎn)移性腦腫瘤患者的組織中卻有 表達,尤其是侵入到血管的腫瘤細胞表現(xiàn)為強的類肝 素酶免疫活性;體外類肝素酶表達在兩種高侵襲性的 膠質(zhì)瘤細胞株(U87MG和U251MG中,而在皮下或 大腦內(nèi)的實驗性膠質(zhì)瘤中檢測不到。這些結(jié)果提示 類肝素酶在GBM體內(nèi)表達下調(diào),是GBM很少轉(zhuǎn)移到 中樞神經(jīng)系統(tǒng)外的遠隔器官的原因。SinnappahKang 等舊1通過對成神經(jīng)管細胞瘤(MB樣本中HPSE一1基因與蛋白表達情況檢測,發(fā)現(xiàn)76%的3歲以上兒 童的MB組織中有顯著的HPSE一1表達。由此可見, 類肝素酶對GBM與腦內(nèi)轉(zhuǎn)移陛腫瘤的鑒別可起到

20、一萬方數(shù)據(jù)第6期 郭素紅,等.生物標記檢測在神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷中的研究進展定的輔助作用,同時對MB的診斷有幫助。2.6端粒酶端粒酶(Telomerase是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄合成 酶,廣泛存在于多種生物細胞內(nèi),能以自身為模板逆 轉(zhuǎn)錄來補充染色體端粒末端,它使細胞在增殖過程中 保持端粒長度不變而具有無限分裂潛力,維護細胞 “永生化”。Vietor等口。通過實驗發(fā)現(xiàn)12種惡性膠 質(zhì)瘤細胞株中均有端粒酶的陽性表達。端粒酶的活性 在細胞分裂周期中不受bcl-2或p53調(diào)節(jié),與bc.2和 p53家族蛋白表達不相關(guān)。Shervington等舊副研究端 粒酶及其亞單位(TEPl、Tankyrase、Dyskerin

21、、hTERT 表達情況發(fā)現(xiàn)除對照組的腦組織外,TEPI在所有的 膠質(zhì)瘤細胞株中及70%的惡性膠質(zhì)瘤組織中均有表 達;除在對照組織中表達外,Tankyrase在85%的惡性 膠質(zhì)瘤中表達,但在復發(fā)性室管膜瘤組織和對照細胞 株中表達下調(diào);除U87一MG和NHA以及復發(fā)的室管 膜瘤組織外,Iyskerin在所有的細胞株中均有表達; hTERT在所有膠質(zhì)瘤細胞株和組織中均有表達,但 在對照細胞和組織中不表達;IPDDC.A2細胞以及 57%的惡性膠質(zhì)瘤組織中缺乏端粒酶活性。這些結(jié) 果提示,hTERT表達但沒有端粒酶活性可能作為一 種簡單和可靠的生物學診斷工具。3蛋白質(zhì)組分析圖譜蛋白質(zhì)組是指某一個細胞或

22、者某一個組織當中 所有表達出來的蛋白質(zhì)的一個集合,雖然同一個個體 不同的細胞它的基因組是一樣的,但不同的細胞它的 蛋白質(zhì)組是不一樣的。通常臨床對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診 斷主觀的歸于腫瘤的異質(zhì)性、浸潤性并依賴于神經(jīng)病 理學家。目前研究人員采用蛋白質(zhì)組分析來更精確 預測腦腫瘤病人的預后,而避免了這種主觀的方法。 Schwartz等瞄1將輔助基質(zhì)激光解吸電離質(zhì)譜分 析法應(yīng)用到各種等級的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織,來檢測神經(jīng) 膠質(zhì)瘤特異性蛋白,即直接分析組織樣品中的蛋白 譜。通過應(yīng)用統(tǒng)計學結(jié)合腫瘤組織切片鑒定的蛋白 質(zhì)圖譜,發(fā)現(xiàn)這種新的監(jiān)測神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分子學方法 能提供給臨床關(guān)于惡性腫瘤的相關(guān)信息,適合大批量 的對膠質(zhì)瘤

23、預后的臨床篩查。另有研究表明疾病時 蛋白標記的出現(xiàn),將直接影響相關(guān)疾病的細胞蛋白補 體的比例,這將提供一個獨特的數(shù)據(jù)集為更有效的診 斷、預測和治療效果監(jiān)測提供幫助嵋7。除以上出現(xiàn)在各型神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的生物標記外, 還出現(xiàn)了一些跨學科的診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生物標記, 比如磁共振成像(MRI術(shù)結(jié)合生物標記在小兒科腦 瘤診斷中的聯(lián)合運用28l,提供了一個非侵襲性的預 測小兒腦瘤臨床等級的體內(nèi)生物學標記,提高了4,JL 腦瘤臨床等級診斷的準確性,為尋找預測4,JL腦瘤等 級的生物標記提供了又一思路。4結(jié)語與展望通過以上對神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的血液、腦脊液及組 織等標本中特征性生物標記物的檢測,可以看出依靠 免疫組

24、化或原位雜交等方法從組織中檢測的生物標 記相對比較成熟,數(shù)量也多,但檢測所用的組織標本 需要通過有損傷的手術(shù)獲取。雖然從血液或腦脊液 中檢測的生物標記數(shù)量還少,相對不太成熟,而且其 檢測的靈敏度取決于膠質(zhì)瘤細胞分泌或壞死釋放的 生物標記量的多少。但相對于組織取材,血液和腦脊 液標本的獲取更方便、損傷更小、更容易被患者接受, 同時也就更便于對膠質(zhì)瘤的早期診斷、療效的跟蹤觀 察及預后的判斷,這也是未來臨床檢驗發(fā)展的方向。 然而,目前對神經(jīng)膠質(zhì)瘤這些生物標記的研究還 存在特異性不強、靈敏度不高、研究不系統(tǒng)等不足。 況且以上所列舉的血液、腦脊液以及組織中所出現(xiàn)的 生物標記也不是絕對的,隨著分子生物學的

25、發(fā)展、檢 測方法靈敏度的提高,以前曾只能在組織中檢測到的 生物標記也可能在血液或腦脊液中被檢測到。目前 的研究證實,癌癥是多基因、多因素綜合作用的結(jié)果, 一種生物標記可存在于不同類型的癌癥中,同時一種 癌癥可表達多種不同的生物標記。因此,篩選膠質(zhì)瘤 相對特異的生物標記,特別是篩選對神經(jīng)膠質(zhì)瘤進行 風險預測、早期診斷、療效觀察和預后判斷方面特異 生物標記,同時采用多種生物標記聯(lián)合檢測神經(jīng)膠質(zhì) 瘤患者的血液、腦脊液中的特異性生物標記是未來醫(yī) 學研究者的方向。參考文獻:1bsere M N,Johnson K R,Boers M,et a1.DeGnitions and validation cri

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