生物技術制藥第二版總結

1、生物技術制藥第一章 緒論要求：1、熟悉生物技術制藥的基本概念2、熟悉生物技術藥物的特點3、了解生物技術領域及生物制藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀1、生物技術制藥:就是利用基因工程、細胞工程、發(fā)酵工程、酶工程、蛋白質工程技術、等來研究和開發(fā)藥物，用來診斷、治療和預防疾病的發(fā)生。2、生物技術藥物（biopharmaceutics）是利用生物體、生物組織、細胞或其他組分，綜合應用生物學與醫(yī)學、生物化學與分子生物學、微生物學與免疫學、物理化學與工程學和藥學的基本原理與方法加工制造而成的一大類用于預防、診斷、治療和康復保健的制品。特性 藥理學特性1、藥理活性高2、治療的針對性強，治療的生理、生化機制合理，療效可靠3、

2、毒副作用小，營養(yǎng)價值高4、生理副作用常有發(fā)生理化與生物學特性1、生物材料中含量低，雜質多，分離提取工藝復雜2、生物活性物質結構復雜、穩(wěn)定性差3、生物材料易染菌、腐敗4、生物技術藥物制劑有特殊要求3、傳統(tǒng)生物技術的技術特征是釀造技術4、近代生物技術的技術特點是微生物發(fā)酵技術5、現(xiàn)代生物技術的技術特征是以基因工程為首要標志6、生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的特點：生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)投資大、風險高、周期長。收益高第二章 基因工程制藥基因工程的概念?；蚬こ痰脑砗图夹g。基因工程制藥6大步驟掌握：基因工程、載體的概念；基因工程的原理；常用載體和表達系統(tǒng)的類型。2、熟悉：基因工程制藥的基本流程；目的基因制備、鏈接的方法；重組基

3、因導入宿主的方法；重組子篩選和鑒定的方法；質粒不穩(wěn)定的原因、分析方法和提高穩(wěn)定性的方法。3、了解：生物技術藥物的下游分離和純化技術。復習1. 基因工程藥物制備的一般過程。2. 基因工程常用的載體有哪些？各有什么特點？3. 獲得目的基因常用的四種方法是（ ）、 （ ）、 （ ）和（ ）。ü 1、基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用與工程設計十分類似的方法，按照人類的需要進行設計，然后按設計方案創(chuàng)建出具有某種新的性狀的生物新品系，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代ü 2、原理：1、提高外源基因的劑量分子遺傳學原理2、篩選修飾重組基因表達的轉錄調控元件，

4、如：啟動子、增強子、操作子、終止子、上游調控序列等分子生物學原理 3、修飾構建蛋白質生物合成的翻譯調控元件，如：SD序列、mRNA非編碼區(qū)、密碼子等分子生物學原理 4、基因工程菌（微型生物反應器）的增殖及穩(wěn)定生產(chǎn)生化工程學原理 3、理論方面的三個重要的發(fā)現(xiàn)1、生物遺傳物質DNA的發(fā)現(xiàn) 2、DNA雙螺旋結構和半保留復制機理的建立 3、遺傳信息傳遞方式的確立4、技術上三個重要成果1、基因工程的工具酶 DNA連接酶 限制性內切酶 逆轉錄酶思考：被同一種限制酶切斷的幾個DNA是否具有相同的黏性末端？一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切點上切割DNA分子。逆轉錄酶是以RNA為模板指導三磷

5、酸脫氧核苷酸合成互補DNA（cDNA）的酶特點：逆轉錄酶是一個多功能性酶，至少具有以下3種酶活性： 以單鏈RNA為模板， 催化合成cDNA單鏈 具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA雜交鏈中的 RNA 以DNA為模板，催化合成cDNA雙鏈。2.基因工程載體3.基因的體外重組技術5、重組子轉化的成功標志著基因工程的誕生。 6、基因工程的操作流程1、分：分離目的基因2、切：對目的基因和載體適當切割3、接：目的基因與載體連接4、轉：重組DNA轉入受體細胞5、篩：篩選出含有重組體的受體細胞6、表：目的基因在受體細胞中表達，受體細胞成長為基因改造生物l 7、 基因工程制藥的基本過程獲得目的基因

6、構建運輸載體 組建表達系統(tǒng) 表達系統(tǒng)培養(yǎng) 產(chǎn)物分離純化l 8、目的基因的獲得（一）從基因組中直接分離目的基因 1、密度梯度離心法2、單鏈酶法3、分子雜交法4、酶切法直接分離目的基因（二）PCR直接擴增目的基因 聚合酶鏈式反應 高溫變性 低溫退火 適溫延伸（三）反轉錄法合成目的基因 構建cDNA文庫 調取基因（四）化學合成目的基因 從反應機理上分為：1、磷酸二酯法2、磷酸三酯法3、亞磷酸三酯法4、自動化合成法9、運載體的構建ü 載體（Vector）:將外源目的DNA導入受體細胞，并能自我復制和增殖的工具。ü 常用載體來源分類：1、質粒載體 質粒（plasmid）:是附加到細胞

7、中的非細胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復制的較小的DNA分子。人工質粒載體必須包括三部分：一個DNA復制起始區(qū)，兩個遺傳標記基因和一些限制性內切酶位點。 2、噬菌體載體 噬菌體：（1）噬菌體宿主為E.coli 2）有溶原、溶菌兩種生活方式： 溶原方式：DNA整合到宿主DNA進行復制； 溶菌方式：可釋放出DNA進行殼蛋白包裝增殖。 優(yōu)點 1）對外源基因的容量較大（可達20多個kb）（2）重組體DNA可在體外包裹成噬菌體顆粒，具有更高的侵染宿主能力，要比質粒轉化細菌的效率高得多，所以噬菌體載體常用于構建cDNA文庫或基因組文庫。（3）宿主范圍窄，更安全（4）可利用包裝限制性（對DNA分子大小

8、的限制）對重組子分子進行正選擇，利于重組子的篩選3、病毒載體4、人工染色體載體用途分類：1、克隆載體 能使插入的外源DNA序列被復制、擴增而不能表達，這樣的載體為克隆載體。常見:質粒、噬菌體2、 表達載體 使插入的外源DNA序列轉錄翻譯，表達出多肽鏈，這樣的載體稱為表達載體。具有復制子，篩選標記，位于多克隆位點的上下游具有轉錄效率較高的啟動子，起始密碼子和核糖體結合位點，轉錄終止子結構 3、 穿梭載體 這類載體中含有來源不同的復制子結構，既具備原核細胞復制所需的序列結構，又具有能使外源片段在真核細胞表達所需的結構元件和相應的選擇標記基因,故能在兩種受體細胞中復制并檢測，克隆的外源基因在此類載體

9、直接從一種受體轉入另一種受體中進行復制和表達10、基因表達載體的構建1、用一定的_限制酶_切割質粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出_黏性末端2. 用_同一種限制酶_切斷目的基因，使其產(chǎn)生_相同的黏性末端3. .將切下的目的基因片段插入質粒的_切口_處，再加入適量DNA連接酶_，形成了一個重組DNA分子（重組質粒） 11、 重組工程菌的構建、篩選與鑒定l 1、目的基因與載體DNA的鏈接1）黏性末端連接法2）鈍性末端連接法3）鈍性末端連接人工合成的接頭4）同聚物末端連接法l 2、將重組體導入宿主細胞（1）轉化2）轉導3）轉染l 3、重組子的篩選與鑒定（1）抗藥性檢測篩選法（2）顯色檢測 異丙基硫代半乳糖苷

10、（IPTG）可誘導LacZ基因片段編碼-半乳糖苷酶氨基端片段,與宿主細胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內互補，又稱互補。當培養(yǎng)基中有IPTG時，使含此質粒的菌在X-gal培養(yǎng)基上形成藍色菌落。（3）限制酶切圖譜檢測（4）PCR擴增檢測（5）原位雜交檢測（6）外源蛋白質功能檢測12、表達系統(tǒng)的構建與基因表達1、最佳的基因表達體系：生物活性高、表達產(chǎn)量高、表達產(chǎn)物穩(wěn)定、表達產(chǎn)物容易分離純化。2、宿主細胞常用兩大類： 原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等； 真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。ü 質粒的不穩(wěn)定性原因1）分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質

11、粒的子代菌的現(xiàn)象。（2）結構不穩(wěn)定：指外源基因從質粒上丟失或堿基重排、缺失而導致工程菌性能的改變。ü 質粒穩(wěn)定性的分析方法1）將工程菌培養(yǎng)液樣品適當稀釋，均勻涂于不含抗生素標記的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10-12小時，統(tǒng)計所長出的菌落數(shù)A；（2）然后隨機挑選100個菌落，接種到含有抗生素標記的平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10-12小時，統(tǒng)計所長出的菌落數(shù)B；（3）計算出B/A的比值。該比值能夠反映出質粒的穩(wěn)定性。提高質粒穩(wěn)定性的方法1）分階段培養(yǎng)法（2）在培養(yǎng)基中加入抗生素，形成選擇性壓力（3）通過溫度、PH值、培養(yǎng)基組分、溶解氧的綜合調節(jié)措施第三章 動物細胞工程制藥1、動物細胞培養(yǎng)技術 培養(yǎng)方法和

12、培養(yǎng)條件 細胞的凍存與復蘇2、動物細胞融合技術 動物細胞融合的過程和方法3、單克隆抗體技術 單克隆抗體的概念；單抗制備的原理和方法4、 動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)1、培養(yǎng)的方法1、原代培養(yǎng)2、傳代培養(yǎng)2、營養(yǎng)條件 1、動物細胞的培養(yǎng)基的種類和組成 ：培養(yǎng)基的基本要求 促生長因子 激素 營養(yǎng)成分滲透壓pH 無毒、無污染 培養(yǎng)基的基本要求 1）營養(yǎng)成分：  氨基酸 單糖 維生素 無機離子與微量元素2）促生長因子及激素各種激素、生長因子的功能：維持細胞的功能保持細胞的狀態(tài)（分化或未分化） 3） 滲透壓 4）pH大多數(shù)細胞適宜 pH為7.27.4，培養(yǎng)基應具一定的緩沖能力 5）無毒、無污

13、染 3、血清的主要成分和作用 主要成分 ：血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等 主要作用：  1、 提供基本營養(yǎng)物質 2、提供激素和各種生長因子 3、提供結合蛋白4、對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用4、動物細胞合成培養(yǎng)基種類：1、MEM ： 僅含12 種必需氨基酸、谷氨酰胺，8 種維生素及必要的無機鹽，由于成分簡單，易于添加某種特殊成分適于某些特殊細胞培養(yǎng)。2、DMEM： 在 MEM 培養(yǎng)基的基礎上研制的。 與 MEM 比較增加了各種成分用量，分高糖型（低于4500g/L）和低糖型（低于1000g/L） 高糖型有利于

14、細胞停泊于一個位置生長，適于生長較快、附著較困難低腫瘤細胞。3、IMDM： 含有 42 種成分，與 DMEM 比較增加了許多非必須氨基酸及一些維生素，增加了羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES），葡萄糖含量為高糖型。 適合細胞密度較低、細胞生長困難的情況，如細胞融合之后雜交細胞的篩選培養(yǎng)，DNA 轉染后轉化細胞的篩選培養(yǎng)。   4、 RPMI1640： 其組分較為簡單，適合許多種細胞生長，如腫瘤細胞、正常細胞、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。是目前應用最為廣泛的培養(yǎng)基之一。5、動物細胞的種質保存 細胞的凍存與復蘇 冷凍速率、復溫速率、冷凍保護劑，冷凍保存溫度。 1. 細胞凍存 2

15、.細胞復蘇 ：在體外培養(yǎng)工作中，常要將體外培養(yǎng)物進行冷凍保存，在需要時再復溫融解進行體外培養(yǎng)（復蘇）ü 凍存和復蘇的原則：慢凍快融 原因： 當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶，冰晶導致細胞損傷甚至死亡。 甘油或二甲基亞砜可使冰點降低，在緩慢凍結條件下，可使細胞內水分逐步透出，避免大的冰晶；相反，結晶就大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。 復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。融化速度快，還可使迅速通過最易受損的-50度冷凍速率：慢凍（？）復蘇速率：快融（？）冷凍保護劑：515甘油或二甲基亞砜（D

16、MSO） （？）冷凍保存溫度：196 （液氮）l 為什么要加冷凍保護劑對大多數(shù)有核哺乳類動物細胞來說，在不加冷凍保護劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活的凍存物。 目前冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類。 具有滲透性的冷凍保護劑可以滲透到細胞內，一般是一些小分子的物質，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等，。 非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉等。 6、動物細胞融合技術基本過程 1）細胞準備，分貼壁和懸浮細胞兩種。前者可直接將兩親本細胞混合培養(yǎng)，后者需制成一定濃度的細胞懸浮液。（2）細胞融

17、合，加促融因子于將行融合的細胞之中，誘導融合。（3）雜種細胞選擇，利用選擇性培養(yǎng)基等，使親本細胞死亡，而讓雜種細胞存活。（4）雜種細胞克隆，對選出的雜種細胞進行克?。ㄟx擇與純化），經(jīng)過培養(yǎng)，就能獲得所需要的無性繁殖系。促融劑：1、病毒誘導：某些病毒如：仙臺病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介導病毒同宿主細胞融合，2、PEG誘導3、物理學方法電誘導細胞融合7、單克隆抗體（monoclonal Antibody，McAb）通過B細胞雜交瘤技術， 獲得特異性針對某一種抗原決定簇的細胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體。單克隆抗體的大量制備：（1）體外培養(yǎng)法：（2

18、）動物體內誘生法：單克隆抗體的特性：1、高度均一性：純度很高的均一性抗體 2、高度專一性： 只對抗原分子上某一抗原決定簇起反應 3、大量產(chǎn)生及穩(wěn)定性： 雜交瘤細胞能在體內外無限繁殖傳代8、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)：懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、假懸浮培養(yǎng)（微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)）等第四章 植物細胞工程制藥基本概念：植物細胞工程；植物細胞的全能性；細胞融合植物細胞培養(yǎng)技術：培養(yǎng)材料、培養(yǎng)方法；植物細胞培養(yǎng)的影響因素植物原生質體培養(yǎng)技術：原生質體獲得、純化和培養(yǎng)的方法植物細胞融合技術：細胞融合的過程、方法和雜種細胞的篩選1、植物細胞工程：以植物細胞為基本單位，應用細胞生物學、分子生物學等理論和技術，在離休條件下進

19、行培養(yǎng)、繁殖或人為的精細操作，使細胞的某些生物學特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而改良品種、制造新品種，加速繁育植物個體或獲得有用物質的一門科學或技術。2、植物細胞的全能性：植物體中任何一個具有完整細胞核（完整染色體組）的細胞，在一定條件下都有直接發(fā)育成一個完整植株的能力。3、全能性最早在植物細胞中發(fā)現(xiàn)。4、植物細胞培養(yǎng)技術：植物細胞培養(yǎng)從植物組織培養(yǎng)而來，植物組織培養(yǎng)主要用于形成組織和再生成植株植物細胞培養(yǎng)主要生成次生代謝產(chǎn)物 基本技術：1、植物材料的準備2、培養(yǎng)基制備3、培養(yǎng)方法的選擇5、植物細胞的獲得（1）外植體直接分離法:機械切割、組織破碎直接從植物外植體中分離外植體：如根、莖、葉、花、花

20、粉等（2）原生質體再生法：纖維素和果膠酶混合處理外植體或愈傷組織，分離原生質體，再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)，原生質體細胞壁再生獲得植物細胞。3）愈傷組織分離法：從愈傷組織制備小細胞團或單細胞懸液愈傷組織：在一定條件下，從外植體的切口部位長出的脫分化的薄壁細胞團。6、常用培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基是目前應用最多最普遍的培養(yǎng)基。無機鹽的濃度較高，KM-8p主要用于原生質體培養(yǎng)，其特點是有機成分較復雜White的無機鹽含量較低，適于生根培養(yǎng)7、生長素：用來誘導細胞的分裂、愈傷組織形成和根的分化8、組織培養(yǎng)中常用的有：吲哚乙酸 (IAA)：第一個被發(fā)現(xiàn)和人工合成的的激素二氯苯氧乙酸 (2,4-D)；萘乙酸 (NAA)；吲

21、哚-3-丁酸 (IBA)；萘氧乙酸 (NOA)；對氯苯氧乙酸 (P-CPA)NAA、IAA、IBA易引起生根，2,4-D有利于愈傷組織的誘導和生長培養(yǎng)影響9、植物細胞生長代謝特點：（1）需大量無機鹽（2）需多種維生素和植物生長激素（3）無機氮源，硝酸鹽、銨鹽為主（4）以蔗糖為碳源10、無機元素的功能： 參與調節(jié)胞內外的pH、滲透壓、氧化還原電位等 參與多種酶的輔酶和激活因子的合成 P是DNA、RNA、ATP等生物活性物質的組成部分，也影響多種次級代謝產(chǎn)物的合成11、植物生長物質 1、植物生長調節(jié)劑 2、植物生長激素：生長素，細胞分裂素，赤霉素，脫落酸，乙烯。借生長激素調控生長分化，以及細胞培養(yǎng)

22、時，獲得最大量的次生代謝產(chǎn)物12、植物培養(yǎng)物的生長取決于生長素和分裂素的比例：高濃度生長素和低濃度分裂素刺激細胞分裂 ，低濃度生長素和高濃度分裂素刺激細胞生長13、誘導子：刺激植物細胞合成防御性次生代謝產(chǎn)物的物質, 可以通過改變次生代謝途徑中催化酶的酶活力,引起代謝通量和反應速率的改變, 提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。 非生物誘導子：水楊酸，茉莉酸等,稀土及重金屬鹽類生物誘導子：微生物類，如真菌孢子，菌絲體、 真菌培養(yǎng)物濾液等14、碳源：細胞培養(yǎng)過程中不進行光合作用，需提供糖做碳源（2-5%）。15、維生素：肌醇（胚狀體和芽的生長），B族維生素（B1根的生長）16、有機物：甘氨酸或水解絡蛋白，酵母提

23、取物等。17、植物細胞的培養(yǎng)方法1.單細胞的培養(yǎng)：（1）看護培養(yǎng)法：2）微室培養(yǎng)法 3）平板培養(yǎng)法 4）條件培養(yǎng)法條件培養(yǎng)基指培養(yǎng)過細胞的培養(yǎng)基上清，有植物生長激素等殘留，用于制備成固體培養(yǎng)基2. 單倍體細胞的培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）指將植物單倍體細胞培養(yǎng)成單倍體植株的過程。一般采取花藥作為單倍體細胞的培養(yǎng)對象3.愈傷組織培養(yǎng)4.毛狀根誘導和培養(yǎng) 毛狀根具有如下特點：激素自養(yǎng)，不必加外源激素；次級代謝產(chǎn)物含量高且穩(wěn)定；增殖速度快。18、植物原生質體培養(yǎng)技術除去植物細胞壁的裸露細胞，稱為原生質體。1、原生質體材料來源： 1、植物葉片取材容易比較容易用酶解法分離2、 植物根尖組織可由各種植物的種子萌發(fā)后取

24、得3、 植物花粉產(chǎn)生單倍體原生質體4、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細胞細胞壁容易解離2、分離1、機械法先將細胞放在高滲溶液中預處理，待細胞發(fā)生輕微質壁分離，原體質體收縮成球形，再用機械法磨碎細胞，從傷口處可以釋放出完整的原生質體。2、酶解法細胞壁降解酶種類：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、果酸酶等3、純化 1） 離心沉淀法原理：原生質體的比重比較大，離心后原生質體沉于底部。2）漂浮法原理：利用比重大于原生質體的高滲蔗糖溶液，離心后使原生質體漂浮其上，殘渣碎屑沉到管底。3）界面法原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液密度大于原生質體的密度，另一種溶液小于原生質體的密度，形成不連續(xù)密度梯度，通過離心使

25、原生質體和破損細胞處于不同液相中。4、培養(yǎng)1）液體淺層培養(yǎng) 將含有原生質體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進行培養(yǎng)。2） 液體固體雙層培養(yǎng) 在培養(yǎng)皿的底部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面。3）固體平板培養(yǎng)瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點的瓊脂糖可在約30融化與原生質體混合而不影響原生質體的生命活動?；旌虾蠛性|體的培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進行培養(yǎng)。4）瓊脂糖珠培養(yǎng) 將含有原生質體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50ul一滴的量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后向其中添加3ml液體培養(yǎng)基并于搖床上低速旋轉培養(yǎng)。 培養(yǎng)過程中，通過調整液體培養(yǎng)基的滲透壓來調節(jié)培養(yǎng)物的滲透

26、壓以利于其進一步的生長和發(fā)育。19、植物細胞融合技術細胞融合(cell fusion)概念：又稱細胞雜交：離體條件下用人工的方法把不同的細胞通過無性方式融合成一個雜合細胞的技術。1、融合的程序：1、原生質體分離的分離、純化2、融合方法選擇3、雜種細胞的篩選4、愈傷組織形成器官分化植株再生5、雜種植物的鑒定2、融合的方法：1、鹽類融合法2、高Ca2+和高pH值融合3、 聚乙二醇（PEG）融合法4、 PEG與高Ca2+和高pH值結合融合法5、 電融合法3、原生質體的融合過程包括3個主要階段：1)兩個或多個原生質體的質膜彼此靠近；2)局部區(qū)域質膜緊密粘連，彼此融合；3)融合完成，形成球形的異核體或同

27、核體。20、雜種細胞的選擇和鑒定1） 融合體的類型自體融合：發(fā)生在親本原生質體自身異體融合：1、諧和的細胞雜種：具有雙親全套染色體組的異源兩倍體2、部分諧和的細胞雜種：雙親的染色體經(jīng)逐步排斥，便發(fā)生少量染色體的重組，然后進入同步分裂，最后形成帶有部分重組染色體的植株3、異胞質體細胞雜種：胞質是雙親的，一親本細胞核被排斥4、嵌合細胞雜種：不同種的雙親原生質體，發(fā)生了膜融合和胞質融合，尚未發(fā)生核融合。雙親的細胞核各自發(fā)生核分裂，接著形成細胞壁，最終形成嵌合體植物2、選擇的方法1、互補選擇法(遺傳或抗性)2、可見標記法3、生長特性選擇法4、物理特性選擇法5、其他方法6、熒光染料法：異硫氰酸熒光素（F

28、ITC）和異硫氰酸羅丹明（RITC）分別發(fā)出綠色和紅色3）細胞雜種的鑒定：雜種植物形態(tài)特征、特性鑒定雜種植物的核型分析同工酶分析分子標記鑒定第五章 發(fā)酵工程制藥發(fā)酵工程的概念2、菌種的獲得與選育3、發(fā)酵的基本過程和工藝控制發(fā)酵工程的概念 菌種及其選育、自然育種、誘變育種、原生質體融合、基因工程育種 發(fā)酵的基本過程、發(fā)酵的工藝控制、發(fā)酵產(chǎn)物的提取1、發(fā)酵工程(fermentation engineering)： 微生物工程利用微生物制造工業(yè)原料與工業(yè)產(chǎn)品并提供服務的技術，是生物技術的基礎工程。2、生產(chǎn)菌種的選育：1、自然選育：自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機率為10-810-9 2、自發(fā)突變與

29、定向育種 3、誘變育種：用各種物理、化學的因素人工誘發(fā)基因突變進行的篩選，稱為誘變育種。物理誘變劑：紫外線 化學誘變劑 使用最多、最有效的是烷化劑。 4、原生質體融合 5、DNA重組3、發(fā)酵產(chǎn)物提取的方法：1、吸附法2、沉淀法 3、溶劑萃取法4、離子交換法4、菌種保藏1、斜面低溫法：短期保存2、石蠟油封存法：中期保存3、沙土管：產(chǎn)孢子和芽孢的4、麩皮保存法：產(chǎn)孢子的霉菌和放線菌，工廠用5、甘油懸液法：基因工程菌6、凍干保藏 ：最廣泛使用的方法。大部分菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久。且經(jīng)凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸7、液氮法：最為有效，保藏15年以上，8、宿主保藏法：活細胞內寄生的

30、微生物5、 發(fā)酵過程的影響因素及控制一）菌體濃度的影響及控制 菌體濃度反應菌體細胞數(shù)和勝利特性結構越復雜的生物，分裂所需時間越長發(fā)酵中菌液需控制在合理濃度中，過高，營養(yǎng)消耗過快，有毒廢物積累，改變菌體代謝途徑，影響溶氧；過低，產(chǎn)率下降二） 培養(yǎng)基的影響及其控制1.碳源：葡萄糖速效碳源，生長菌體，淀粉等遲效碳源，發(fā)酵次級代謝產(chǎn)物2.氮源：氨基酸，玉米漿等速效氮源，生長菌體，豆餅等遲效氮源，發(fā)酵次級代謝產(chǎn)物氮源太多會促使菌體大量生長。有些產(chǎn)物合成受到過量銨離子的抑制，因此必須控制適量的氮。3.磷酸鹽和微量元素：微生物體內磷含量較高，培養(yǎng)基中以磷酸鹽為主，發(fā)酵中用來計算磷含量的是磷酸根抗生素對磷酸鹽

31、濃度很敏感，生長濃度：0.32-300 mol/L，生產(chǎn)濃度：1.0 mol/L4.補料：補基質和前體，中途補料，豐富培養(yǎng)基，避免菌體過早衰老，控制PH，改善通氣等通常在生長旺盛期后期，發(fā)酵液泡沫位下降，這時耗氧大，溶氧水平接近臨界點，補料少量多次6、影響發(fā)酵溫度變化的因素(1)生物熱：微生物進行有氧呼吸產(chǎn)生的熱比厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的熱多。(2)攪拌熱(3)蒸發(fā)熱：通氣時，引起發(fā)酵液的水分蒸發(fā)，水分蒸發(fā)所需的熱量叫蒸發(fā)熱(4)輻射熱：發(fā)酵罐內溫度與環(huán)境溫度不同，發(fā)酵液中有部分熱通過罐體向外輻射。7、.溫度的選擇與控制(1)最適溫度的選擇：嗜冷菌適應于026生長，嗜溫菌適應于1543 生長，嗜熱菌適應

32、于3765 生長，嗜高溫菌適應于65 以上生長最適生長溫度，最適生產(chǎn)（發(fā)酵）溫度發(fā)酵前期 要盡快達到大量的菌體，取稍高的溫度中期菌量 已達到合成產(chǎn)物的最適量，發(fā)酵需要延長中期，從而提高產(chǎn)量，因此中期溫度要稍低一些，發(fā)酵后期， 產(chǎn)物合成能力降低，提高溫度，刺激產(chǎn)物合成到放罐。8、pH的影響及其控制菌體自溶，pH上升，發(fā)酵后期，pH上升9、發(fā)酵過程pH變化的原因 1）糖代謝：特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是補料的標志之一（2）氮代謝：當氨基酸中的-NH2被利用后pH會下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，當碳源不足時氮源當碳源利用pH上升

33、。（3）生理酸堿性物質利用后pH會上升或下降10、發(fā)酵過程pH的調節(jié)1、調節(jié)好基礎料的pH?；A料中若含有玉米漿，pH呈酸性，必須調節(jié)pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要調到6.56.8.在基礎料中加入維持pH的物質，如CaCO3 ，或具有緩沖能力的試劑，如磷酸緩沖液等.通過補料調節(jié)pH .當補料與調pH發(fā)生矛盾時，加酸堿調pH 11、溶氧的影響及其控制溶氧(DO)是需氧微生物生長所必需。在發(fā)酵過程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成為控制因素。供氧不足，代謝異常，通氣，攪拌 12、發(fā)酵過程的溶氧變化發(fā)酵初期，生產(chǎn)菌大量繁殖，需氧，溶氧下降過了生長階段，需氧減少，溶氧上升發(fā)酵中后

34、期，分批發(fā)酵的溶氧不變生產(chǎn)后期，菌體衰老，溶氧上升13、CO2的影響及控制：降低通氣攪拌，則增加CO2在發(fā)酵液中溶解度14、發(fā)酵過程泡沫的形成與控制發(fā)酵過程起泡的利弊：氣體分散、增加氣液接觸面積，但過多的泡沫是有害的消泡：機械消泡，消泡劑消泡：天然油脂，聚醚類消泡劑，高碳醇，硅酮類15、染菌的防治發(fā)酵前期最易染菌，且危害最大。原因 ： 發(fā)酵前期菌量不很多，與雜菌沒有競爭優(yōu)勢；且還未合成產(chǎn)物（抗生素）或產(chǎn)生很少，抵御雜菌能力弱。染菌措施 ： 可以用降低培養(yǎng)溫度，調整補料量，用酸堿調pH值，縮短培養(yǎng)周期等措施予以補救。如果前期染菌，且培養(yǎng)基養(yǎng)料消耗不多，可以重新滅菌，補加一些營養(yǎng)，重新接種再用。第

35、六章 酶工程制藥酶與酶工程的概念固定化酶和細胞的制備酶工程技術 酶分子的定點改造 、 酶分子的定向進化 、 酶的化學修飾 、 抗體酶技術1、酶工程是酶學和工程學相互滲透結合、發(fā)展而形成的一門新的技術學科。它是從應用的目的出發(fā)研究酶、應用酶的特異催化性能，并通過工程化將相應原料轉化成有用物質的技術。酶是生物細胞產(chǎn)生的、具有催化能力的生物催化劑。2、固定化酶（immobilized enzyme）的定義:指限制或固定于特定空間位置的酶。具體講是指經(jīng)物理或化學方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是純化的酶，

36、也可以是結合在菌體（死細胞）或細胞碎片上的酶或酶系3、固定化酶的特點（1）可以多次使用，酶的穩(wěn)定性提高；（2）反應后，酶與底物和產(chǎn)物易于分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化。（3）反應條件易于控制，可實現(xiàn)轉化反應的連續(xù)化和自動控制；（4）酶的利用率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量少；（5）比水溶性酶更適合于多酶反應。4、固定化酶的制備原則：（1）不改變酶的性質（2）酶結合牢固，性質穩(wěn)定，易于與底物分離（3）能夠實現(xiàn)生產(chǎn)的自動化，成本合理5、固定化酶載體材料：A.高分子載體 .天然高分子材料 殼聚糖，海藻酸鈉 合成有機高分子材 聚苯乙烯B.無機載體 玻璃，硅凝膠，鋁等C.復合載體：磁性高分子微球:內

37、部含有磁性金屬或金屬氧化物的超細粉末。6、固定化方法的選擇固定化酶應用的安全性 固定化酶在操作中的穩(wěn)定性 固定化的成本7、新型的酶固定化方法：光偶聯(lián)法， 等離子體法， 無載體固定化酶8、固定化細胞的方法：將細胞限制或定位于特定空間位置的方法.9、固定化酶的性質1）酶活力的變化：酶經(jīng)過固定化之后活力大都下降。2）酶穩(wěn)定性的變化：包括對溫度、pH、蛋白酶變性劑和抑制劑的耐受程度。固定化后，穩(wěn)定性提高，有效壽命延長。熱穩(wěn)定性提高：熱穩(wěn)定性越高，工業(yè)化意義越大。熱穩(wěn)定性高可以提高反應溫度和反應速度，提高效率。對有機試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高PH，蛋白酶等穩(wěn)定性提高 3）酶學特性的變化：A、底物專一性：

38、對底物的專一性下降。 B、最適pH：最適pH可能變大，也可能變??；pH-酶活曲線可能發(fā)生變化，其變化與酶蛋白和載體的帶電性質有關。 C、最適溫度：一般升高。原因是固定化后空間結構更為穩(wěn)定。 D、米氏常數(shù)(Km) ：Km值均發(fā)生變化，有的增加很小，有的增加很大，但不會變小。 E、最大反應速度（Vm）：變化很小或不變。10、酶工程研究新技術一、酶分子的定點改造：有目的的改變酶的特定活性位點或基因，產(chǎn)生具有新性狀的酶。定點突變是酶分子定點改造的常規(guī)手段，廣泛用于改善酶的性能。定點突變是有目的的在已知DNA序列中取代、插入或刪除特定的核苷酸。定點突變的方法：（1）引物介導的定點突變（2）PCR介導的定

39、點突變（3）盒式突變二、酶分子的定向進化酶分子的定向進化（directed evolution）：模擬自然進化過程（隨機突變和自然選擇），在體外進行酶基因的人工隨機突變，建立突變基因文庫，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術過程。特點：適應面廣；目的性強；效果顯著。定向進化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進化=隨機突變+定向選擇。三、酶的化學修飾： 通過主鏈的切割、剪接和側鏈基團的化學修飾對酶蛋白進行分子改造，以改變其理化性質及生物活性。目的： 提高酶的生物活性 增強在不良環(huán)境中的穩(wěn)定性 降低或消除其免疫原性方法：（1）酶的表面化學修飾 ： 可降

40、低酶的免疫原性，提高酶的穩(wěn)定性；或使酶固定到某一載體上。（2） 酶分子內部修飾（3）結合定點突變的化學修飾 ：制備化學修飾突變酶，從而得到一些新穎的酶制劑。修飾酶的特性：熱穩(wěn)定性提高 抗各類失活因子能力提高 抗原性消除 體內半衰期延長 最適pH改變 酶學性質變化（Vmax不變，Km變大 對組織分布能力改變11、抗體酶技術：能與過渡態(tài)結合的抗體也具有酶的性質抗體酶是酶還是抗體 ？抗體是B細胞識別抗原后增殖分化為漿細胞所產(chǎn)生的一種蛋白質，主要存在于血清等體液中,能與相應抗原特異性地結合，具有免疫功能。其本質是一類免疫球蛋白?？贵w酶是酶的高效催化能力和抗體的高度選擇性巧妙結的產(chǎn)物，本質上是一類具有催

41、化活力的免疫球蛋（Ig）其實抗體酶是一種特殊的抗體，它有著催化特性，可謂是酶和抗體性質的兼得。所以又被稱為催化抗體?？贵w酶的制備：誘導法， 基因工程法， 拷貝法，化學修飾法 酶傳感器：它將活性物質酶覆蓋在電極表面,酶與被測的有機物或無機物反應,形成一種能被電極響應的物質第7章 藥物生物技術新進展新產(chǎn)品新疫苗1、多肽疫苗2、基因疫苗核酸藥物1.核酶2.反義核酸藥物3.RNAi藥物1、抗體工程制藥 主體：細胞工程技術和基因工程技術2、理想的抗體藥物的性質：1、高特異性和高親和力2、對人沒有免疫原性，不誘導機體對抗體的排斥反應游離抗體不激活補體3、一旦結合到靶抗原上，能誘導效應功能細胞系穩(wěn)定，適合在

42、無血清培養(yǎng)基中進行大規(guī)模培養(yǎng)4、抗體符合生物制品標準3、抗體治療存在的問題：1、異源蛋白導致產(chǎn)生抗抗體，影響靶向性和效果2、靶部位攝取的量太低3、效應功能弱4、在體內被清除速度快4、基因工程抗體的概念：利用DNA重組技術和蛋白質工程技術對編碼抗體分子的基因按照不同需要進行加工改造和重新裝配，再轉染到合適的受體細胞中所表達的抗體分子。特點：1、減少或消除排斥反應2、分子小，穿透力強，易到達病灶核心部位3、抗體功能多樣化4、可采用多種表達系統(tǒng)，成本低 研究內容 抗體人源化：構建抗體庫從中篩選新的單抗 種類：1 人一鼠嵌合抗體：一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)(V區(qū)）與人抗體的恒定區(qū)（C區(qū)）融合而得

43、到的抗體。第一代2 鼠單抗可變區(qū)的人源化改型抗體第二代3 小分子抗體 1)Fab 完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。2)Fv 或 ScFv Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。 單鏈抗體（ScFv）的構建在已知親本DNA序列時可用完全人工合成法;如果從雜交瘤細胞系構建單鏈抗體，可用PCR方法擴增可變區(qū)基因，再組裝到適當?shù)谋磉_載體上。單鏈抗體最常用的表達體系是大腸桿菌 3)單域抗體 即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結構域構成，故稱單域抗體。 4)最小識別單位 約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構成，它也保持著抗體的特異性。4 雙特異抗體和多價抗體

44、雙鏈抗體 （Diabody）乃是一種小分子的雙價雙特異性抗體片段。 特異性抗體(bispecific antibody,BSAb)是指能同時識別2種抗原的抗體。1種為對應腫瘤相關抗原。另1種為對應效應成分。即能結合靶腫瘤細胞又能結合高細胞毒性的效應細胞,抗體融合蛋白主要分兩種形式： Fc融合蛋白 抗原結合融合蛋白1) 免疫粘附素2、免疫毒素噬菌體抗體庫技術定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉染工程細菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。特點 模擬天然全套抗體庫 避開了人工免疫和雜交瘤技術 可獲得高親和力的人源化抗體轉基因技術制藥轉基因動物（transgenic

45、animal）是指借助基因工程技術將外源基因導入受體動物染色體內，外源基因與動物基因整合后隨細胞的分裂而擴增，在體內表達并能穩(wěn)定地遺傳給后代的動物。培育1 目標基因克隆和體外重組 2 外源基因的導入3 外源DNA整合、轉錄及表達的分子檢測 4 轉基因動物品系或品種的建立 轉基因動物技術路線 ：1、外源目的基因的制備2、外源目的基因有效導入生殖細胞或胚胎干細胞3、選擇獲得攜有目的基因的細胞4、選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物4、轉基因細胞胚胎發(fā)育及鑒定5、篩選所得的轉基因動物品系外源基因的轉移：1、顯微注射法2、逆轉錄病毒載體感染3、胚胎干細胞介導法4、精子載體介導法5、YAC介導的基因轉移6、

46、細胞核移植 胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）是從早期胚胎內細胞團（ICM）分離出來的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多能干細胞。精子與外源DNA結合的機理： 精子直接與外源DNA混合培養(yǎng)，外源基因可以直接進入精子頭部，受精后就可發(fā)育成轉基因動物。后來Rottman對此方法進行了改進，將外源DNA在與精子共孵育之前用脂質體包埋，使脂質體與DNA相互作用形成脂質體DNA復合物。這種復合體比較容易和精子細胞融合，從而進入細胞內。 轉基因動物的應用：1）生物制藥(乳腺生物反應器)；（2）建立人類疾病的動物模型；（3）生產(chǎn)可移植用的動物器官。動物乳腺生物反應器一般把目的片段在器

47、官或組織中表達的轉基因動物叫動物生物反應器（bioreactor），幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過人為馴化為生物反應器,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動物乳腺生物反應器,動物血液生物反應器和動物膀胱生物反應器等。其中，轉基因動物乳腺生物反應器的研究最為引人注目。基因芯片基因芯片(gene chip)又稱DNA芯片(DNA chip)或DNA微陣列(DNA micro-array)?；蚴禽d有生物體遺傳信息的基本單位，存在于細胞的染色體上；將大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上，稱之為基因芯

48、片。原理：基因芯片技術是建立在基因探針和雜交測序技術上的一種高效、快速的核酸序列分析手段?；蛐酒夹g主要包括四個主要步驟：芯片制備、樣品制備、雜交反應和信號檢測以及結果分析。1、芯片制備1）合成探針2）探針在載體表面的固定 探針在載體表面的固定可分為兩大類方法：合成后點樣，多用于大片段DNA，有時也用于寡核苷酸，甚至mRNA。原位合成（即在支持物表面原位合成寡核苷酸探針），適用于寡核苷酸。原位合成（在片合成）有三種途徑：，原位光刻合成，點樣法，分子印章原位合成法（東南大學發(fā)明）。 3、雜交反應 雜交反應是熒光標記的樣品與芯片上的探針進行的反應產(chǎn)生一系列信息的過程。 蛋白質芯片（protein

49、 chip），又稱蛋白質微陣列(protein microarray)，是用于蛋白質功能研究及相互作用分析的生物芯片，采用原位合成、機械點樣或共價結合的等方法將多肽、蛋白、酶、抗原、抗體固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝膠、尼龍膜等固相介質上形成的生物分子點陣。芯片實驗室是將樣品制備、生化反應和檢測分析的全過程集約化，并縮微到一張芯片上自動完成，形成的所謂微型全分析系統(tǒng)（micro total analysis systen,-TAS）,或稱“縮微芯片實驗室”（lab-on-a-chip）。生物芯片的應用：1、尋找和發(fā)現(xiàn)新基因2、基因表達分析3、DNA序列測定與序列間比較4、突變體和多態(tài)性的檢測基

50、因治療 基因治療：指應用DNA重組技術，將外源正?；驅氚屑毎?，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達到治療的目的。基因療法：1、重建基因調控系統(tǒng)2、替代異常基因3、封閉致病基因4、剪去致病基因5、修復受損基因6、增強基因效能基因干預基因干預(gene interference)：指采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因而使之不表達，以達到治療疾病的目的?；蚋深A的種類：1核酶： 裂解特異的靶mRNA 2反義RNA： 封閉基因表達 3 RNA干涉技術腫瘤治療中基因的選擇：1. 能改變腫瘤細胞的惡性表型的基因    腫瘤細胞主要有癌基因的突變

51、、擴增、過度表達，對此可采用反義核酸或核酶；抑癌基因的突變、失活等，可采用野生型的正常基因作為治療基因，用正?；蛱蕹蛱鎿Q缺陷基因。2.能提高腫瘤細胞的免疫原性的基因3.腫瘤藥物增敏基因 常用的自殺基因有單純皰疹病毒胸苷激酶（HSK-TK）基因,基因載體的選擇 ：有病毒載體和非病毒體兩類，多用病毒載體，如逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒載體。基因治療中體細胞的選擇：1、免疫細胞2、骨骼肌細胞 3、血管平滑肌細胞1、成纖維細胞：    成纖維細胞位于全身并具有較強的自我更新能力。優(yōu)點有：易于獲得；容易體外培養(yǎng)和擴增；分裂中的成纖維細胞易與逆轉錄病毒一起穩(wěn)定轉導，并能

52、較穩(wěn)定的表達外源目的基因；攜帶外源基因后能穩(wěn)定地回植體內并進行表達等。主要缺點是在體內由于細胞凋亡而引起的基因表達失活。 2、造血干細胞    造血干細胞是基因治療遺傳病、自身免疫性疾病及癌癥常用的靶細胞。理想載體應具備下列條件：安全無毒害；不引起免疫反應；高濃度或高滴度；能高效轉移外源基因 ,持續(xù)有效表達外源基因；可靶向特定組織細胞；可調控；容納外源基因可大可??；可供體內注射（包括全身性靜脈注射）；便于規(guī)模生產(chǎn)供臨床應用，可惜目前所應用的載體尚沒有一個能符合上述全部的條件。這是今后努力研究的方向?；蚪M學與新藥研究基因組（genome）：生物體單倍體細胞所有基因的總和。基因組學（genomics）：DNA測序、基因及非編碼區(qū)定位及繪圖。人類基因組計劃（human genome project）人類基因組測序、基因定位、破譯人類全部遺傳信息。20 世紀90年代初期, 美國生物學家提出并實施了人類基因組計劃( human genome project, HGP),2003年4月14日,美國人類基因組研究項目首席科學家Collins F 博士在華盛頓隆重宣布: 人類基因組序列圖繪制成功