六鄰體利用親和生物素的相互作用特定修飾聚乙二醇化腺病毒載體

1、Hexon-specific PEGylated adenovirus vectors utilizing avidin-biotin interaction 六鄰體特異性 聚乙二醇 腺病毒 載體 利用 親和生物素 相互作用六鄰體利用親和生物素的相互作用特定修飾聚乙二醇化腺病毒載體摘要：聚乙二醇化重組腺病毒（AD）載體不僅使腺病毒抗體避免被中和和被吞噬細(xì)胞吸收，而且對于全身給藥后腺病毒載體血液保存時(shí)間的延長，都成為一種可能。然而，傳統(tǒng)的聚乙二醇化導(dǎo)致的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)活性顯著降低，可能是因?yàn)榫垡叶挤翘禺愋越Y(jié)合到腺病毒衣殼蛋白，從而抑制了腺病毒載體結(jié)合的主要受體柯薩奇病毒受體（CAR）。為了使聚

2、二乙醇化的腺病體載體在傳遞活動中沒有顯著減少，生物素結(jié)合肽（BAP）插入到六鄰體的高變區(qū)5（HVR），這個(gè)不參與結(jié)合CAR，而且聚乙二醇通過親和生物素的相互作用具體結(jié)合到病毒六鄰體HVR5上。體外轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明，六鄰體特有的聚乙二醇并不會造成腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)率的明顯減少，相對于傳統(tǒng)的腺病毒載體，在抗腺病毒血清缺少的情況下，盡管生物素結(jié)合肽進(jìn)入HVR5本身，但使得轉(zhuǎn)導(dǎo)效率減少了50倍。在抗血清病毒的存在下，六鄰體HVR5中生物素結(jié)合肽和腺病毒載體的傳導(dǎo)明顯受阻；然而，抗血清病毒只是略微的抑制血清與六鄰體特異聚乙二醇化腺病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)(Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2)。Ad-BAP

3、/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的靜脈注射導(dǎo)致延長血液滯留，在肝臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)顯著減少，并在腫瘤積累；然而，出乎意料的是，Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2在腫瘤的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率幾乎在本底水平。關(guān)鍵詞：基因療法，藥物釋放，基因表達(dá)，表面改性，聚乙烯1、 簡介重組腺病毒（Ad）載體是最有前途的基因載體，由于其優(yōu)越的傳導(dǎo)能力，被廣泛用于臨床試驗(yàn)中。雖然在大多數(shù)臨床試驗(yàn)中使用腺病毒載體，腺病毒載體直接管理靶器官(e.g., tumors) 1,2，發(fā)展一種將腺病毒載體系統(tǒng)傳送到靶器官的方法是可行的。然而，在實(shí)現(xiàn)腺病毒載體系統(tǒng)傳送之前，一些問題必須得到解決。首先，腺病毒載體具有較強(qiáng)的向肝性：

4、超過九成的腺病毒載體劑量靜脈注射后積累在肝臟3。當(dāng)肝臟作為靶器官時(shí)，此屬性看起來是有利的，但是，當(dāng)其它器官是靶器官時(shí)，肝中的腺病毒載體積累應(yīng)減少，而且，腺病毒載體在血液循環(huán)的時(shí)間應(yīng)延長，以使系統(tǒng)傳遞到靶器官。另外，抗腺病毒抗體在成年人中的高感染率已經(jīng)報(bào)道4,5，并且在全身用藥后中和抗腺病毒抗體明顯抑制住腺病毒載體在體內(nèi)的傳導(dǎo)6。經(jīng)中和抗腺病毒抗體的腺病毒載體應(yīng)避免調(diào)解具有抗腺病毒抗體患者的有效傳導(dǎo)。為了解決上述問題，共價(jià)鍵共軛聚乙二醇（PEG）（PEGylation）的腺病毒載體已經(jīng)進(jìn)行7-12。聚乙二醇是一種親水性聚合物，通常用于改善蛋白質(zhì)和納米粒子的藥動力學(xué)特性13,14。聚乙二醇化蛋白質(zhì)

5、和脂質(zhì)已經(jīng)投入市場。結(jié)果在共軛的聚乙二醇化劑周圍形成了水化領(lǐng)域，它從吞噬細(xì)胞和血清蛋白的相互作用中屏蔽了聚乙二醇化劑 ，包括中和抗體。此外，聚乙二醇介導(dǎo)從吞噬細(xì)胞和血清蛋白中逃逸，結(jié)果使含聚乙二醇化劑的血液的半衰期延長。血液的半衰期延長也可以引起通透性的增強(qiáng)和保留（EPR）的效果，其中由于在腫瘤血管滲透，聚乙二醇化藥物傳遞到腫瘤效率加強(qiáng)15。以往的研究已經(jīng)表明，聚乙二醇化腺病毒載體隨著血液循環(huán)時(shí)間的延長而延長，在肝臟的攝取減少，從中和的抗腺病毒抗體中逃逸，并在腫瘤中增加其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率7-9.11,12。此外，先天性免疫不僅是由腺病毒載體引起的，聚乙二醇化腺病毒載體也使其提高9。但是，聚乙二醇化腺病

6、毒載體的主要缺陷是，傳統(tǒng)的聚乙二醇化大大降低了腺病毒載體的傳導(dǎo)效率7,9。在幾乎所有的聚乙二醇化腺病毒載體的研究中，聚乙二醇已經(jīng)共價(jià)偶聯(lián)結(jié)合酰胺的腺病毒衣殼蛋白的賴氨酸殘基，這就導(dǎo)致了對聚乙二醇可能與六鄰體或者是腺病毒載體的纖維蛋白隨機(jī)進(jìn)行共軛。聚乙二醇的纖維蛋白，它與主要受體結(jié)合（柯薩奇病毒腺病毒受體，CAR），顯著抑制柯薩奇病毒腺病毒受體的附件，結(jié)果使其的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性顯著減少。在腺病毒衣殼蛋白中聚乙二醇化網(wǎng)絡(luò)無法通過傳統(tǒng)的聚乙二醇進(jìn)行控制。為了使聚乙二醇與腺病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不受到干擾，聚乙二醇應(yīng)該有選擇性的與六鄰體共價(jià)結(jié)合，這不包含柯薩奇病毒的相互作用。在這項(xiàng)研究中，為了使聚乙二醇有選擇性的

7、結(jié)合到六鄰體，我們把生物素結(jié)合肽加入到六鄰體高變區(qū)（HVR）5，而且，聚乙二醇通過親和素復(fù)合物的形成于六鄰體HVR5進(jìn)行特殊結(jié)合。2、 材料與方法2、1 小鼠和細(xì)胞雌性BALB/c小鼠，年齡：5-6周，日本SLC（濱松，日本）。A549細(xì)胞（人肺腺癌細(xì)胞源性肺癌）在含有10%小牛血清和抗生素的鷹的最小培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。甲基-A細(xì)胞（鼠標(biāo)纖維肉瘤細(xì)胞株）通過腹腔移植維持到同基因品系小鼠體內(nèi)（BALB/c）。2、2 質(zhì)粒和腺病毒載體 在這項(xiàng)研究中的腺病毒載體用外體連接構(gòu)建了一個(gè)完善的方法16-18。腺病毒載體質(zhì)粒，pAdHM62-BAP-L2，構(gòu)造如下：pAdHM6219，其中包含了在病毒六鄰體H

8、VR5編碼區(qū)的獨(dú)特的Xbal位點(diǎn)，被Xbal消化和寡聚糖編碼的生物素結(jié)合肽結(jié)扎20，創(chuàng)建pAdHM62-BAP。隨后，pAdHM62-BAP被I-Ceul/PI-Scel消化和I-CeuI/PI-SceI-設(shè)計(jì)的Pcmvl1a21結(jié)扎，其中包含了CMV啟動子驅(qū)動的螢火蟲熒光素酶基因表達(dá)盒，在pAdHM62-BAP-L2中產(chǎn)生。寡核苷酸編碼的生物素結(jié)合肽的序列如下： 5-CTAGGGGCAGCGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATCGAGTGGCACGAGGGCAGCC-3， 5-CTAGGGCTGCCCTCGTGCCACTCGATCTTCTGGGCCTCGAAGATG

9、TCGTTCAGGCCGCTGCCC-3。要生成含有生物素結(jié)合肽的腺病毒載體，pAdHM62-BAP-L2被PacI消化，并且根據(jù)制造商的指示，用SuperFect轉(zhuǎn)染試劑（Qiagen, Valencia, CA）把293個(gè)細(xì)胞植入到60mm的讀盤中。Ad-L2，以熒光素酶表達(dá)的腺病毒載體包含了野生型的腺病毒衣殼，在以前就造成了21。所有的腺病毒載體在293個(gè)細(xì)胞中增殖，用兩輪氯化銫梯度離心進(jìn)行純化，透析，并儲藏在-80。矢量粒子（VP）的效價(jià)用分光光度法進(jìn)行測定22。對于腺病毒載體生物素來說，在病毒六鄰體(Ad-BAP-L2) (2x1011VP)HVR5中，往含生物素結(jié)合肽在內(nèi)的腺病毒載

10、體中加入100mm的ATP、100mmMgoAc和50mm的D-生物素組成的緩沖液，隨后在30用7ml的生物素蛋白連接酶(BirA500; Avidity, LLC, Aurora, CO)處理40min。然后，腺病毒載體在4收獲和過夜透析，并除去蛋白連接酶，生產(chǎn)處生物素腺病毒載體（Ad-BAP/Bio-L2）。生物素腺病毒載體可以被免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）證實(shí)。對于六鄰體特異修飾的聚乙二醇化腺病毒載體來說，Ad-BAP/Bio-L2在(六鄰體生物素:抗生素蛋白:MPEG-生物素-5000)摩爾比為1:1:3的比例下用生物素蛋白和MPEG-生物素-5000在室溫培下養(yǎng)20min

11、，生產(chǎn)出Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2。未結(jié)合的抗生素蛋白和mPEG-生物素-5000在本實(shí)驗(yàn)中不能從混合物中除去。2、3 免疫印跡法每一個(gè)腺病毒載體（1x109 VP）在一個(gè)含有4%的-巰基乙醇的緩沖液中，在95的溫度下加熱5min，然后在電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜后，把樣品在5-20%的SDS-PAGE凝膠下分離。在被免疫阻斷劑(Dainippon Pharmaceutical Co., Osaka, Japan)阻斷后，該膜在辣根過氧化酶（HRP）-抗生物素抗體共軛（1:10000：矢量實(shí)驗(yàn)室，Burlingame，CA）的情況下在4培育一整晚。洗滌后，膜就會與ECL加免疫

12、印跡檢測試劑反應(yīng)(Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)。通過使用LAS3000成像系統(tǒng)檢測信號(Fujifilm, Tokyo, Japan)。2、4 血液清除和聚乙二醇化腺病毒載體的組織分布甲基-A細(xì)胞（2x106細(xì)胞/鼠）是在BALB/c小鼠的腹部接種表達(dá)。一星期之后，當(dāng)腫瘤直徑超過5-8毫米，Ad-L2，Ad-BAP-L2，Ad-BAP/Bio-L2，或者是Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2在劑量為1x1010VP/ 鼠時(shí)通過靜脈注射到冰毒河流小鼠，并在指定時(shí)間點(diǎn)通過眼窩出血采集血液樣本?？偟腄NA，包括腺病毒載體DNA在內(nèi)，利用DNA

13、組織和血液迷你試劑盒（Qiagen）從全部血液中分離。接種腺病毒載體48小時(shí)后，腫瘤和主要器官的累積和均質(zhì)如前所述23?？偟腄NA，包括腺病毒載體DNA在內(nèi)，從腫瘤或各個(gè)器官中使用自動分離核酸純化系統(tǒng)分離(NA-20000;Kurabo, Osaka, Japan)。分離后，對總的DNA濃度進(jìn)行測定，并且如前面所說的，對腺病毒載體基因組用TaqMan熒光檢測系統(tǒng)(ABI Prism 7700 sequence detector; Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA)拷貝數(shù)量24。2、5 腺病毒載體在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)為了評估腺病毒載體在

14、體內(nèi)的傳導(dǎo)性能，甲基-A軸承小鼠經(jīng)靜脈注射每一種腺病毒載體1x1010VP。腫瘤和主要的器官在注射后48個(gè)小時(shí)收獲，如前面所述，熒光素酶的生產(chǎn)確定使用熒光素酶檢測系統(tǒng)23。蛋白質(zhì)含量的測定時(shí)使用Bio-Rad檢測試劑盒，這個(gè)試劑盒是用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)衡量的。3、 結(jié)果3、1 六鄰體特異結(jié)合的聚乙二醇化腺病毒載體的生成把PEG（聚乙二醇）用特定的異己酮、通過抗生素蛋白-維生素的相互作用的方法結(jié)合到腺病毒載體上，我們得到了Ad-BAP-L2，而BAP這種肽，包含異己酮循環(huán)中的HVR5（表1）。異己酮不包括腺病毒載體與主要受體結(jié)合之后的捆綁物。異己酮的HVR5為插入外源的肽提供專門的結(jié)合位點(diǎn)，因

15、為HVR5允許外源肽的插入對它作為轉(zhuǎn)基因腺病毒的功能沒有影響19,25。BAP通過維生素-蛋白質(zhì)連接酶（BirA）連接之后是很有效地生物素。進(jìn)一步，為了把生物素連接到BAP上，Ad-BAP-L2用BirA在30處理40分鐘，結(jié)果是Ad-BAP/Bio-L2（表2）BirA把維生素綁定到BAP的賴氨酸殘?jiān)?；其次，為了把生物素化的PEG連接到HVR5的BAP上，Ad-BAP/Bio-L2是由抗生素蛋白和乙二醇生物素-5000混合而成。因?yàn)榭股氐鞍缀伤膫€(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)的四聚體26，異己酮允許特定的聚乙二醇化的聚合物的相互作用。被標(biāo)記的異己酮、抗生素蛋白和mPEG-bitoin-5000的比例是

16、1:1:3。我們選擇這個(gè)比例的原因是我們認(rèn)為mPEG-bitoin-5000應(yīng)該屬于異己酮?？傊?，mPEGbiotin-5000的量減少，腺病毒載體的幾部分主要的成分的形成更加容易（數(shù)據(jù)沒有顯示）。我們分析生物素是不是處理異己酮的特定物質(zhì)用蛋白質(zhì)分子印記法進(jìn)行分析（表3A）。Ad-BAP/Bio-L2的異己酮的蛋白質(zhì)通過抗生素蛋白標(biāo)記法檢查。在結(jié)果中沒有發(fā)現(xiàn)其他的帶。這些結(jié)果都表明Ad-BAP/Bio-L2的異己酮與抗生素的偶聯(lián)是特定的。3.2 用Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)首先，為了證明BAP是否轉(zhuǎn)移到腺病毒載體的HVR5里起到了作用，我們把它與未轉(zhuǎn)移的腺病毒

17、載體進(jìn)行比較，分別標(biāo)記為Ad-L2和 Ad-BAL-L2。最近研究已經(jīng)證明血清和異己酮處理的HVR5結(jié)合，在細(xì)胞表面對磷酸素起到橋梁的作用。27，28。本研究中，Ad-BAP-L2比Ad-L2的轉(zhuǎn)染效應(yīng)降低了大約50倍（表3B）。但現(xiàn)在還不明白這種結(jié)果的原因。 再次，為了證明在體外Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的傳導(dǎo)能力，在A549細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入沒有血清或存在抗血清的腺病毒載體。眾所周知，聚乙二醇修飾物保護(hù)腺病毒載體被其抗體識別。一方面，一般的聚乙二醇修飾物，能降低腺病毒載體的轉(zhuǎn)移能力。在沒有抗血清腺病毒載體存在下，Ad-BAP/Bio-L2和Ad-BAP/Bio/Avi/Bi

18、o-PEG-L2的轉(zhuǎn)移能力比Ad-BAP-L2降低約10倍，然而，Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的轉(zhuǎn)移能力與Ad-BAP/Bio-L2,相比，證明聚乙二醇修飾物沒有降低腺病毒載體的轉(zhuǎn)移能力（表4）。另一方面，在抗血腺病毒載體存在的情況下，Ad-BAP-L2,Ad-BAP/Bio-L2, 和 Ad-BAP/Bio/Avi-L2的轉(zhuǎn)移能力隨著抗血清腺病毒載體濃度的增加而減小更多。在血液中觀察到的Ad-BAP-L2 and Ad-BAP/Bio-L2是Ad-L2的100多倍。另外，在血液中，經(jīng)處理30分鐘后，Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的基因組染色組殘留數(shù)比

19、Ad-L2高10倍。出乎意外的是，經(jīng)15分鐘處理之后，Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2和Ad-L2表現(xiàn)出相似的血液清除曲線。進(jìn)一步，Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的轉(zhuǎn)移效率沒有降低血清的濃度。所以我們確定，把mPEG-Biotin-5000轉(zhuǎn)移到Ad-BAP/Bio-L2，沒有消除抗腺病毒載體血清的作用（數(shù)據(jù)沒有給出）。這些結(jié)果都表明腺病毒載體介導(dǎo)的導(dǎo)入沒有被特定的異己酮的聚乙二醇的修飾物抑制。3.3 靜脈注射后，特定異己酮的聚乙二醇修飾物的腺病毒載體的血液清除率 為了證明全身給藥后腺病毒載體的血液清除率是否能夠延長特定異己酮的聚乙二醇修飾物，腺病毒載體通

20、過靜脈注射注射到老鼠體內(nèi)，在血液中腺病毒載體染色體組數(shù)用實(shí)時(shí)PCR儀檢測。在以前的研究中3,29，一般的Ad-L2從血液循環(huán)中很容易發(fā)現(xiàn)（表5）。低腺病毒載體可能會導(dǎo)致Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的清除數(shù)量。這些結(jié)果都表明特定異己酮的聚乙二醇修飾物的腺病毒載體，在全身給藥后，腺病毒載體會延長血液的保留時(shí)間。3.4 全身給藥后，特定的異己酮的聚乙二醇修飾物的腺病毒載體在組織中的積累 為了證明靜脈注射后，Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2在腫瘤和主要組織器官中的分布，把腺病毒載體通過靜脈注射到老鼠體內(nèi)，在組織、肝、脾中的腺病毒載體的染色體組數(shù)用實(shí)時(shí)PCR儀檢測

21、。眾所周知，Ad-L2的全身給藥會在肝中有很大的積累3，事實(shí)如此，Ad-L2在肝臟中有最大的積累量（表6A）。而檢測到的Ad-BAP-L2在肝的積累中減少了大約15倍可能是因?yàn)锽AP的插入而封鎖了異己酮HVR5和外源血清的相互作用。進(jìn)一步說，Ad-BAP/Bio-L2 and Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的肝積累水平比Ad-BAP-L2低，但在腺病毒載體染色體組的數(shù)目在肝臟中沒有很大的不同（表6B）。在脾臟中，Ad-BAP-L2的染色體組數(shù)是Ad-L2的90倍，而在脾臟的積累Ad-BAP/Bio-L2 and Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2比Ad-L2

22、低。 腺病毒在組織中的積累與在肝臟和在脾臟中的積累不同（表6C）。在組織中，Ad-BAP-L2的積累比Ad-L2的積累高倍Ad-BAP/Bio-L2 和 Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的積累比Ad-L2高40倍。Ad-BAP/Bio-L2 和 Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的積累沒有明顯的差別。所以結(jié)果表明，Ad-BAP/Bio-L2 and Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2在肝臟中的積累的減少可能會導(dǎo)致在組織中的積累的增加。3.5 在體內(nèi)特定的異己酮的聚乙二醇的修飾物的腺病毒載體的轉(zhuǎn)移效率 為了證明Ad-BAP/Bio/Avi/Bio

23、-PEG-L2在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移效率，我們對經(jīng)過靜脈注射后的老鼠的組織和主要器官的轉(zhuǎn)移效率進(jìn)行評估（表7）。就像以前的研究3，在肝臟中，Ad-L2的轉(zhuǎn)移效率最高，然后是脾臟和心臟。在所有的器官中，Ad-BAP-L2的轉(zhuǎn)移效率比Ad-L2降低了10倍。進(jìn)一步說，除在心臟中，Ad-BAP/Bio-L2的轉(zhuǎn)移效率在其它器官中比Ad-BAP-L2低28倍。在所有器官中，轉(zhuǎn)移效率最低的是Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2。在所有的器官中，Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2的轉(zhuǎn)移效率和Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2 與Ad-BAP-L2相似。尤其是Ad-BAP

24、/Bio/Avi/Bio-PEG-L2在組織中的轉(zhuǎn)移效率，盡管發(fā)現(xiàn)Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2在組織中的染色體組數(shù)比Ad-L2高很多。這些結(jié)果都表明，特定異己酮的聚乙二醇的修飾物能明顯的降低腺病毒載體的轉(zhuǎn)移效率。4、 討論 這項(xiàng)研究的目的是制造一個(gè)特定共軛聚乙二醇化腺病毒載體，與柯薩奇病毒腺病毒受體結(jié)合無關(guān)，為了不降低聚乙二醇化腺病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)或率。為了這個(gè)目標(biāo)，我們把生物素結(jié)合肽納入六鄰體HVR5，這不參與結(jié)合柯薩奇病毒受體，并隨后通過親和生物素的相互作用把聚乙二醇共軛結(jié)合到六鄰體上。本研究的數(shù)據(jù)表明，病毒六鄰體特異結(jié)合聚乙二醇不能從實(shí)質(zhì)上抑制體外腺病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，

25、盡管把生物素結(jié)合肽結(jié)合到病毒六鄰體HVR5上可以減少50倍的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。另一方面，對在腫瘤中病毒六鄰體特異修飾的聚乙二醇化腺病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率明顯的比全身用藥后腺病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，盡管，相對于傳統(tǒng)的腺病毒載體，腫瘤中六鄰體特異聚乙二醇化腺病毒載體的積累顯著增強(qiáng)。聚乙二醇分子量的大小是聚乙二醇化腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)輪廓的關(guān)鍵因素。在以前的研究中，聚乙二醇分子大小是隨著肝中轉(zhuǎn)導(dǎo)率的日益減少和腺病毒載體在血液中停留時(shí)間的延長而增加的9,30。Yao等人表明，在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)共軛的PEG-20000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比較低，而且在肝臟中更低，而在全身用藥后和PEG-5000共軛的腺病毒載體相比，與PEG-2000

26、0共軛的腺病毒載體顯示較長的血液停留時(shí)間9。Doronin等表明，PEG-20000共軛的的腺病毒載體在肝臟中比PEG-5000共軛的腺病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低30。在本研究中，我們使用PEG-5000是因?yàn)榫哂写蠓肿恿康木垡叶伎赡芡耆采w纖維旋鈕和抑制纖維和柯薩奇病毒受體的相互作用。PEG-5000的長度估計(jì)約為34nm，而腺病毒5型纖維長度已經(jīng)確定為37nm。這些數(shù)據(jù)表明，纖維旋鈕將從PEG-5000外層凸出來，從而使Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2在體外產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。PEG-5000共軛的腺病毒載體在肝臟中阻斷腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率，相對于和上述分子量大的PEG共軛來說較低

27、9,12；但是，不僅Ad-BAP/Bio/Avi/Bio-PEG-L2而且Ad-BAP/Bio-L2都在調(diào)解肝臟中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的本底水平，盡管在這個(gè)研究中使用了PEG-5000。Ad-BAP-L2在肝臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也明顯低于Ad-L2。這很可能是把生物素結(jié)合肽插入到病毒六鄰體HVR5上抑制了FX和病毒六鄰體之間的相互作用，導(dǎo)致與生物素結(jié)合肽連接的腺病毒載體在體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著減少。最近，除了通過柯薩奇病毒受體-纖維扭轉(zhuǎn)相互作用傳播和RGD（丙氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）序列的整合互動，而且涉及病毒六鄰體的腺病毒感染途徑也被證明27,28。在血清中的FX結(jié)合病毒六鄰體中高變區(qū)5和7，作為硫酸肝素對肝細(xì)胞的

28、作用橋梁。Vigant等表明，把肽插入到腺病毒六鄰體的HVR5可以使肝臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率減少33。此外，和Ad-BAP-L2相比，Ad-BAP/Bio-L2中發(fā)現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)化約減少10倍。生物素結(jié)合到六鄰體的HVR5上可能造成空間位阻，從而進(jìn)一步抑制FX與六鄰體之間的相互作用。 不僅體內(nèi)器官而且連體外Ad-BAP-L2的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率都低于Ad-L2各自的價(jià)值，盡管柯薩奇病毒受體對A549細(xì)胞有很強(qiáng)的表達(dá)。現(xiàn)在還不清楚為什么Ad-BAP-L2介導(dǎo)在體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低于Ad-L2；但是，把生物素結(jié)合肽插入到HVR5可能影響到腺病毒與核膜的連接，或者是在進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后，影響腺病毒基因組DNA導(dǎo)入細(xì)胞核。Trotman等表明，腺病毒六鄰體蛋白涉及到與核包封結(jié)合和導(dǎo)入腺病毒基因組蛋白34。腺病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要障礙之一就是在成年人中抗腺病毒抗體的高感染率。超過80%的成年人具有抗腺病毒抗體4,5?？瓜俨《究贵w不僅抑制腺病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且增加腺病毒載體的誘導(dǎo)毒性35，這表明對抗腺病毒抗體的識別應(yīng)避免腺病毒載體的安全和有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)。中和抗腺病毒抗體的主要是六鄰體36，這表明六鄰體特異結(jié)合的聚乙二醇提供了一個(gè)有效的方式來規(guī)避對抗腺病毒抗體介導(dǎo)的抑制。在這項(xiàng)研