人骨肉瘤耐阿霉素細(xì)胞模型的建立及其生物學(xué)特性

1、中國組織工程研究與臨床康復(fù) 第 15卷 第 37期 2011 09 10出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research September 10, 2011 Vol.15, No.37 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 6913 1Department of Orthopedics, Ninth Peoples Hospital of Chongqing,Chongqing 400700, China; 2Department of Orthopedics,Sec

2、ond Affiliated Hospital ofChongqing Medical University,Chongqing 40010, ChinaChen Yu , Doctor, Attending physician, Department of Orthopedics, Ninth Peoples Hospital of Chongqing,Chongqing 400700, Chinachenyu Correspondence to: Deng Zhong-liang, Doctor, Professor, Department of Orthopedics, Second A

3、ffiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 40010, Chinadeng7586gmail. comSupported by: the National NaturalScience Foundation of China, No.30772211*Received: 2011-06-10 Accepted: 2011-07-30人骨肉瘤耐阿霉素細(xì)胞模型的建立及其生物學(xué)特性 *陳 渝 1,王大勇 1,翁 政 1,鄧忠良 2Establishment of adriamycin-resistant human os

4、teosarcoma cell line and research on its biological characteristicsChen Yu1, Wang Da-yong1, Weng Zheng1, Deng Zhong-liang2AbstractBACKGROUND: Multidrug resistance is a major factor leading to the failure of chemotherapy for human osteosarcoma. However,the precise mechanism remains poorly understood.

5、OBJECTIVE: To establish adriamycin-resistant human osteosarcoma cell line 143B/ADM and to analyze its biological characteristics.METHODS: Increasing concentrations of adriamycin (ADM were applied for 45 days to establish 143B/ADM resistant strain. Thehalf of inhibiting concentrations (IC50 and resis

6、tance indexs (RI of different antitumor drugs were measured by CCK assay, andthe cell cycle was analyzed by flow cytometry. The cellular efflux capacity was estimated by rhodamine test. After the cell lineswere treated by ADM, intracellular ADM concentration was detected by fluorospectrophotometer,

7、and the apoptosis wasobserved by laser scanning confocal microscope and flow cytometry. Meanwhile, the expression of multidrug resistance 1(MDR-1, multidrug resistance-associated protein 1 (MRP-1 and lung resistance protein (LRP were detected by western blotanalysis.RESULTS AND CONCLUSION: After ind

8、uction for 45 days, the RI of 143B/ADM cells to ADM was 15.7, and the 143B/ADM cellsshowed various resistances to cisplatin, methotrexate, isophosphamide, vincristine and taxinol. Compared with 143B/WT cell line,there were less cells in G2/M phase and more cells in G1 and S phases, markedly decrease

9、d intracellular rho123 and ADM in143B/ADM cell line (P 0.01. Flow cytometry and confocal laser microscopy analysis showed that at 72 hours after treatmentwith ADM (10 mg/L, cell apoptosis in 143B/ADM cells was less than that in 143B/WT cells. Furthermore, compared with143B/WT, the MDR-1 expression o

10、f 143B/ADM was increased significantly with no difference of MRP-1 and LRP expressionamong both cell lines. Multidrug resistance of 143B/ADM cells is related to MDR-1, and has no relationship with MRP-1 and LRP.Chen Y, Wang DY, Weng Z, Deng ZL.Establishment of adriamycin-resistant human osteosarcoma

11、 cell line and research on itsbiological characteristics. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(37: 6913-6918. 摘要背景:多藥耐藥是骨肉瘤化療失敗的重要原因,目前其耐藥機(jī)制不明。目的:誘導(dǎo)建立耐阿霉素的人骨肉瘤細(xì)胞株并觀察多藥耐藥蛋白 1、多藥耐藥相關(guān)蛋白 1和肺耐藥蛋白的表達(dá)。方法:采用逐步遞增阿霉素濃度間歇作用的方法誘導(dǎo) 143B/WT細(xì)胞株建立 143B/阿霉素耐藥細(xì)胞株。結(jié)果與結(jié)論:經(jīng)阿霉素誘導(dǎo) 45 d建立了 143B/阿霉素細(xì)胞

12、株,其對(duì)阿霉素高度耐藥,對(duì)順鉑、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿和紫杉醇亦產(chǎn)生不同程度交叉耐藥;流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示與 143B 野生型細(xì)胞相比, 143B/阿霉素細(xì)胞周期中 G 1和 S 期所占比例增加,而 G 2/M期所占比例明顯減少;羅丹明外排實(shí)驗(yàn)顯示, 143B/阿霉素細(xì)胞藥物外排能力顯著高于143B/WT細(xì)胞 (P 0.01;流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn), 143B/阿霉素細(xì)胞阿霉素相關(guān)性細(xì)胞凋亡率顯著低于 143B/WT(P 0.01; Western blot檢測(cè)顯示 143B/阿霉素細(xì)胞多藥耐藥蛋白 1表達(dá)水平較 143B/WT顯著升高 (P 0.05。提示 143B/阿霉

13、素細(xì)胞多藥耐藥的產(chǎn)生與多藥耐藥蛋白 1表達(dá)升高相關(guān)。關(guān)鍵詞:骨肉瘤;阿霉素;多藥耐藥;多藥耐藥蛋白 1;細(xì)胞模型陳渝,王大勇,翁政,鄧忠良 . 人骨肉瘤耐阿霉素細(xì)胞模型的建立及其生物學(xué)特性 J.中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2011, 15(37:6913-6918. 0 引言多藥耐藥現(xiàn)象是由一種化療藥物誘發(fā),腫 瘤組織對(duì)該藥產(chǎn)生耐藥的同時(shí)對(duì)其他結(jié)構(gòu)和功 能無關(guān)的化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。多藥 耐藥的發(fā)生是影響腫瘤患者化療效果、預(yù)后的 主 要 因 素 之 一 1-2。 多 藥 耐 藥 (multidrug resistance, MDR蛋白 1(MDR

14、-1、多藥耐藥相 關(guān) 蛋 白 1(multidrug resistance-associated protein 1, MRP-1和 肺 耐 藥 蛋 白 (lung resistance protein, LRP是多藥耐藥基因編碼 的主要產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn), MRP-1、 LRP 和 MDR-1在多種耐藥性腫瘤中表達(dá)升高,其表達(dá)水平與 腫瘤耐藥性密切相關(guān) 3-5。實(shí)驗(yàn)擬采取阿霉素 (doxorubicin, ADM為 誘導(dǎo)藥物,以人骨肉瘤細(xì)胞株 143B 為研究對(duì) 象,采用逐步遞增 ADM 濃度間歇作用方法建立 人骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞株,并初步探討其耐藥 機(jī)制。萬方數(shù)據(jù)陳渝,等 . 人骨肉瘤耐阿霉素

15、細(xì)胞模型的建立及其生物學(xué)特性6914www. CRTER .org1重慶市第九人民 醫(yī)院骨科,重慶市 400700; 2重慶醫(yī) 科大學(xué)附屬第二 醫(yī)院骨科,重慶市 400010陳渝,男, 1977年生,四川省資陽 市人,漢族, 2011年重慶醫(yī)科大學(xué) 畢業(yè),博士,主治 醫(yī)師,主要從事骨 腫瘤耐藥機(jī)制的 研究。中圖分類號(hào) :R318 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :B文章編號(hào) :1673-8225 (201137-06913-06收稿日期:2011-06-10修回日期:2011-07-30 (20110610016/WLM S1 材料和方法設(shè)計(jì):隨機(jī)對(duì)照細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。時(shí)間和地點(diǎn):于 2009-03/07在重慶醫(yī)科大

16、學(xué)生物化學(xué)與分子藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。材料:細(xì)胞株:人骨肉瘤細(xì)胞株 143B 由芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心分子腫瘤實(shí)驗(yàn)室保存。主要試劑和儀器:方法:人骨肉瘤 143B/WT細(xì)胞的原代培養(yǎng):人骨肉瘤143B/WT細(xì)胞在 37 、體積分?jǐn)?shù) 5%CO2條件 下 , 培 養(yǎng) 于 含 體 積 分 數(shù) 10%胎 牛 血 清 、 1105U/L青霉素和 100 mg/L鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)液中。 1 g/L胰蛋白酶消化傳代。耐藥細(xì)胞的誘導(dǎo):采用逐步遞增 ADM 濃度、間歇作用的方法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥 6。取穩(wěn)定 傳代 20代的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 143B/WT細(xì)胞接種至 含 ADM 的 DMEM 培養(yǎng)液中,從 0.01 mg

17、/L ADM開始,作用 48 h后棄去含藥培養(yǎng)液,加入新鮮 培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),待其恢復(fù)正常生長(zhǎng),消化 傳代后復(fù)用 0.1 mg/L ADM處理 48 h,如此反復(fù) 換液、傳代,逐步提高 ADM 濃度間歇誘導(dǎo),得 到 能 耐 受 1 mg/L ADM的 細(xì) 胞 株 , 命 名 為 143B/ADM, 并 將 其 維 持 培 養(yǎng) 在 含 0.1 mg/L ADM 的完全培養(yǎng)液中。耐藥誘導(dǎo)歷時(shí) 45 d。 CCK-8法檢測(cè) 143B/ADM細(xì)胞株對(duì)化療藥物的敏感性:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng) 1.25 g/L胰酶消化后離心,用 DMEM 培養(yǎng)液制備成濃度 5108L-1的單細(xì)胞懸液,分別接種于 96孔

18、板, 200 L/孔。培養(yǎng) 72 h后分別加入不同質(zhì)量濃度(0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1 000 mg/L的化療 藥物 (ADM、順鉑、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺、紫 杉醇和長(zhǎng)春新堿 ,并設(shè) 5個(gè)復(fù)孔, 37 ,體積 分?jǐn)?shù) 5%CO2條件下培養(yǎng) 72 h。每孔加入 20 L的 CCK-8, 37 下繼續(xù)培養(yǎng) 2 h ,酶標(biāo)儀檢測(cè) 波長(zhǎng) 450 nm處每孔的吸光度 (A 450 值。以藥物 濃度為橫軸,抑制率 抑制率 =(1-實(shí)驗(yàn)孔 A 450/對(duì) 照孔 A 450100%為縱軸繪制濃度-效應(yīng)曲線, 確定半數(shù)抑制濃度 (IC50 ,計(jì)算耐藥指數(shù)。耐藥 指數(shù) =耐藥細(xì)胞 IC 50/

19、親代細(xì)胞 IC 50。熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) ADM 濃度:骨肉瘤細(xì)胞以 105/孔接種于 12孔板, 10 mg/L ADM 處 理 1 h 后棄培養(yǎng)基,以冰 PBS 洗滌 3次,加入無 ADM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 2 h后棄培養(yǎng)基,冰 PBS 洗 滌 3次 , 加 含 體 積 分 數(shù) 1%Triton-X的 PBS 0.5 mL裂解細(xì)胞, BCA 法測(cè)細(xì)胞裂解液總蛋白 濃度 7。另取 200 L細(xì)胞裂解液,熒光分光光 度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長(zhǎng) 478 nm,發(fā)射波 長(zhǎng) 594 nm,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞內(nèi) ADM 濃 度,并以總蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡:將對(duì)數(shù)生

20、長(zhǎng)期細(xì)胞接種于 6孔板中常規(guī)培養(yǎng) 24 h使其同步化后,換含正?；蚝?10 mg/L ADM的 細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 72 h,消化收集細(xì)胞。離 心沉淀后用 0.3 mL含體積分?jǐn)?shù) 5%小牛血清的 PBS 懸浮,移入 1.5 mL EP管中,加入 0.7 mL無水乙醇,置-20 固定 24 h。 3 000 r/min離 心 30 s,棄上清,用 1 mL PBS重懸細(xì)胞,再離 心 洗 滌 細(xì) 胞 1次 , 沉 淀 細(xì) 胞 用 100 L 1 g/LRNase A懸 浮 , 37 消化 30 min,再加入 400 L 50 mg/L碘化丙啶,置暗處 10 min檢測(cè)。 以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

21、及細(xì)胞凋亡率。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡:以 10 mg/L的 ADM 處理 143B/WT和 143B/ADM細(xì) 胞 72 h后, PBS 洗滌貼壁細(xì)胞 1次 , 并 消 化 細(xì) 胞 , 1 000 g 離心 5 min收集細(xì)胞, PBS 重懸細(xì)胞。 取 (510104個(gè)細(xì)胞重懸, 1 000 g 離心 5 min, 棄上清,加入 195 L Annexin V-FITC 結(jié)合液 (1重懸細(xì)胞。加入 5 L Annexin V-FITC ,輕 輕混勻。室溫避光孵育 10 min。 1 000 g 離心 5 min,棄上清,加入 190 L Annexin V-FITC 結(jié)合液 (1重懸細(xì)胞

22、,再加入 10 L 碘化丙啶染 色液,輕輕混勻。于激光共聚焦顯微鏡下雙色 濾光片觀察細(xì)胞凋亡情況。Western blot檢測(cè) MDR-1, MRP-1和 LRP 的表 達(dá):143B 或 143B/ADM細(xì)胞棄去培養(yǎng)基后, PBS洗 3次,加入預(yù)冷的 20 mmol/L的細(xì)胞裂解液,試劑及儀器 來源ADM(批號(hào):73L017-E 甲氨喋啶 (批號(hào):080607A 長(zhǎng)春新堿 (批號(hào):0803E1 紫杉醇 (批號(hào):080509 羅丹明 123 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 8 流式 AnnexinV-FITC/PI凋亡 檢測(cè)試劑盒 MDR-1, MRP-1, LRP 和 -actin 單克隆抗體 激光共聚焦顯微

23、鏡 流式細(xì)胞儀 Model 550酶標(biāo)儀 Lumat LB 9507熒光分光光度計(jì) 意大利法瑪西亞制藥廠上海華聯(lián)制藥廠 深圳萬樂藥業(yè)有限公司 南京德寶生化公司美國 Sigma 公司江蘇南京碧云天公司 江蘇南京凱基生物 美國 Chemicon 公司德國 LEICA 公司 美國 BD 公司 美國 Bio-Rad 公司德國 EG&GBERTHOLD 公司萬方數(shù)據(jù)陳渝,等 . 人骨肉瘤耐阿霉素細(xì)胞模型的建立及其生物學(xué)特性 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH6915www. CRTER.org冰上孵育 30 min后,用細(xì)胞刮刮起細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至 EP 管 中

24、,超聲破碎, 4 , 12 000 g 離心 10 min,收集上清。 取上清, BCA 法蛋白定量,把樣品調(diào)成相同濃度備用。 取蛋白樣品行 SDS-PAGE 電泳,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 上。 5%脫脂奶粉封閉 2 h,按 1 200的濃度加入一抗, 37 孵育 2 h,洗 3次,每次 5 min。 1 5 000的濃度加 入二抗, 37 孵育 1 h,洗膜 5次,每次 5 min?；瘜W(xué)發(fā) 光試劑反應(yīng) 2 min,凝膠成像系統(tǒng)攝像,采用 Quantity One 圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。以 MDR-1、 MRP-1和 LRP 吸光度值與 -actin 吸光度值比值表示蛋白表達(dá) 水平。比值越大

25、,則蛋白表達(dá)越高。細(xì)胞內(nèi)羅丹明積蓄實(shí)驗(yàn):羅丹明攝入實(shí)驗(yàn):取 1109 L-1單細(xì)胞懸液加 Rh123至終濃度為 1 mg/L, 37 孵育 1 h,離心后 PBS 洗 3次, 4 ,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) Rh123熒光強(qiáng)度。羅丹明滲出實(shí)驗(yàn):取 1109 L-1單細(xì)胞懸液加 Rh123至終濃度為 1 mg/L, 37 孵育 1 h,離心后 PBS 洗 3次, 重懸于不含 Rh123的培養(yǎng)基中 2 h, PBS 洗滌 3次, 4 , 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) Rh123熒光強(qiáng)度。主要觀察指標(biāo):143B/ADM細(xì)胞的耐藥性,細(xì)胞周 期的變化,藥物的外排能力、凋亡情況及 MRP -1、 LRP 和 MDR

26、-1的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果用 x _s 表示,采用 SPSS 12.0統(tǒng) 計(jì) 軟 件 包 進(jìn) 行 單 因 素 方 差 分 析 , 組 間 比 較 用 LSD-t 檢驗(yàn), P 0.05為差異有顯著性意義。2 結(jié)果2.1 人骨肉瘤 143B/ADM細(xì)胞藥物敏感性與多藥耐藥 特性 CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明, 143B/ADM細(xì)胞對(duì) ADM 高 度耐藥,對(duì)順鉑、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺、紫杉醇和長(zhǎng) 春新堿亦存在不同程度交叉耐藥,見表 1。2.2 熒 光 分 光 光 度 計(jì) 測(cè) 得 的 細(xì) 胞 內(nèi) ADM 濃 度 結(jié) 果 143B/WT細(xì)胞內(nèi) ADM 濃度為 (1 151.35125.77 mg/g

27、, 143B/ADM細(xì)胞內(nèi) ADM 濃度為 (317.0943.24 mg/g, 顯著低于 143B/WT細(xì)胞 (P 0.05。2.3 ADM對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 通過激光共聚焦顯微鏡 觀察 ADM 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,用 Annexin V-FITC 和碘化 丙啶染色后,正?；罴?xì)胞不會(huì)被 Annexin V-FITC 和碘化 丙啶染色;凋亡早期的細(xì)胞僅被 Annexin V-FITC 染色, 而碘化丙啶染色呈陰性;而死細(xì)胞和凋亡晚期的細(xì)胞可 同時(shí)被 Annexin V-FITC和碘化丙啶染色。 實(shí)驗(yàn)顯示, ADM 處理 72 h后, 143B/WT細(xì)胞凋亡明顯高于 143BADM 細(xì) 胞,見圖 1

28、。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:143B/WT細(xì)胞凋亡率為 (79.810.6%, 143B/ADM細(xì)胞凋亡率為 (28.67.3%, 顯著低于 143B/WT細(xì)胞 (P 0.01,見圖 2。Green was Annexin V; red was PI; yellow was overlayFigure 1 Effect of adriamycin (ADM on cell apoptosismeasured by fluorescence microscope 圖 1 熒光顯微鏡檢測(cè)阿霉素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響143B/WT143B/ADMFigure 2 Effect of adriamycin (

29、ADM on cell apoptosismeasured by flow cytometry圖 2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)阿霉素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響a: 143B/WT b: 143B/ADMc: 143B/WT+10 mol/L ADM d: 143B/ADM+10 mol/L ADMGreen Red Yellow萬方數(shù)據(jù)陳渝,等 . 人骨肉瘤耐阿霉素細(xì)胞模型的建立及其生物學(xué)特性 6916www. CRTER .org2.4 143B/ADM細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果 與 143B/WT細(xì)胞 相比, 143B/ADM細(xì)胞中處于 G 1期的細(xì)胞比例增加, G 2/M期細(xì)胞比例減少 (P 0.05,見表 2,圖

30、3。2.5 各 細(xì) 胞 株 中 MDR-1, MRP-1和 LRP 的 表 達(dá) 與 143B/WT細(xì)胞相比, 143B/ADM細(xì)胞 MDR-1表達(dá)顯著升 高 (P 0.05,見圖 4,表 3。2.6 ADM誘導(dǎo)耐藥對(duì)細(xì)胞內(nèi)羅丹明蓄積水平的影響 143B/ADM細(xì)胞 Rho123攝入量與 143B/WT細(xì)胞比較差 異無顯著意義,但其滲出后細(xì)胞內(nèi)殘留 Rho123顯著低 于 143B/WT細(xì)胞 (P 15,對(duì)其他化療 藥物如順鉑、甲氨蝶呤、異環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿和紫杉 醇等也產(chǎn)生了明顯耐藥,表明該耐藥細(xì)胞株建立成功。 與 143B/WT野生型細(xì)胞相比, 143B/ADM細(xì)胞生長(zhǎng)緩 慢 , 細(xì)胞群體倍

31、增時(shí)間延長(zhǎng), 細(xì)胞克隆形成率明顯增加, 細(xì)胞周期中 G 1和 S 期所占比例增加,而 G 2/M期所占比例 明顯減少,細(xì)胞存活率增加。該耐藥細(xì)胞株的成功建立 為后續(xù)骨肉瘤耐藥機(jī)制研究提供了理想的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模 型。人類 MDR 基因?qū)儆谝唤M大的 ATP 結(jié)合盒式載體超 家族,主要包括 MDR-1及 MDR-2基因。 MDR-1基因定 位于染色體 7q21.1上,編碼 P-gp 糖蛋白; MDR-2基因的 表達(dá)產(chǎn)物主要在肝膽小管內(nèi),發(fā)揮耐藥作用的只有 P-gp 糖蛋白。該蛋白為典型的 ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成 員,具有通道蛋白性質(zhì),可與多種藥物結(jié)合,利用 ATP 水解釋放的能量將疏水親脂性藥物

32、轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外,從而 使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低而產(chǎn)生耐藥性18-20。 MRP 蛋白也屬于 ATP 結(jié)合超家族,其中研究較多的是 MRP -1,其編 碼基因位于 16p13.1染色體上。與 MDR-1蛋白不同, MRP-1的作用機(jī)制主要與細(xì)胞內(nèi) MRP-1的藥物泵作用 有關(guān),它能識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)與谷胱甘肽耦合的底物,從而降 低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,因此又被稱為谷胱甘肽-S 共軛物轉(zhuǎn)運(yùn)泵。此外, MRP-1蛋白還可通過改變細(xì)胞內(nèi)藥物的分 布引起耐藥21-22。除以上兩者外, LRP 在腫瘤耐藥中的作用研究也越來越多,其編碼基因定位于 16號(hào)染色體, 與 MRP 基因位置接近。 LRP 蛋白控制著多種底物的核質(zhì) 轉(zhuǎn)

33、運(yùn),可阻止以胞核為靶點(diǎn)的藥物通過核孔進(jìn)入胞核, 還可使胞質(zhì)內(nèi)藥物進(jìn)入囊泡,然后通過胞吐機(jī)制將其排 出細(xì)胞,從而產(chǎn)生耐藥 23-24。以上 3種耐藥相關(guān)蛋白在骨肉瘤中均有關(guān)于其過表達(dá)的報(bào)道6, 25-26, 再鑒于以上 3種常見耐藥蛋白在腫瘤耐藥中的重要性,為探求其是否在 143B/ADM耐藥細(xì)胞株 耐藥過程中也發(fā)揮著重要作用,實(shí)驗(yàn)中 Rho123外排實(shí) 驗(yàn)顯示, 143B/ADM對(duì) Rho123的蓄積比野生型細(xì)胞少; 熒光分光光度計(jì)檢測(cè)不同 143B 細(xì)胞接受 ADM 處理后細(xì) 胞內(nèi) ADM 濃度,也發(fā)現(xiàn) 143B/WT細(xì)胞內(nèi) ADM 濃度明顯 高于 143B/ADM細(xì)胞,以上實(shí)驗(yàn)提示很有可能

34、是細(xì)胞轉(zhuǎn) 運(yùn)蛋白通過其藥物泵作用將化療藥物排出,導(dǎo)致了耐 藥。隨后通過 Western blot的方法對(duì)以上 MDR 相關(guān)蛋白 的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明, 143B/ADM耐藥細(xì)胞株 中 MDR-1蛋白表達(dá)顯著增加, 但 MRP-1和 LRP 蛋白無明 顯變化。這說明,實(shí)驗(yàn)中建立的 143B/ADM耐藥模型產(chǎn) 生的耐藥現(xiàn)象很可能是由過表達(dá)的 MDR-1蛋白外排藥 物引起的。綜上所述,實(shí)驗(yàn)?zāi)M體外化療間歇給藥的方式, 以 ADM 為誘導(dǎo)劑成功構(gòu)建了人骨肉瘤多藥耐藥體外細(xì)胞 系 143B/ADM細(xì)胞系。初步研究表明, 143B/ADM細(xì)胞 多藥耐藥性與 MDR1表達(dá)水平關(guān)系密切,與 MRP1和

35、LRP 表達(dá)無明確聯(lián)系。4 參考文獻(xiàn)1Ullah MF. Cancer multidrug resistance (MDR: a majorimpediment to effective chemotherapy. Asian Pac J Cancer Prev. 2008;9:1-6.2 Coburger C, Lage H, Molnar J, et al. Impact of novel MDRmodulators on human cancer cells: reversal activities and induction studies. Pharm Res. 2009;26:18

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50、133 對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化 的調(diào)控及機(jī)制研究。 作者貢獻(xiàn)： 陳渝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)實(shí)施為陳渝、翁政， 實(shí)驗(yàn)評(píng)估為王大勇，資料收集為陳渝，陳渝成文，鄧忠良審 校，陳渝、鄧忠良對(duì)文章負(fù)責(zé)。 利益沖突： 課題未涉及任何廠家及相關(guān)雇主或其他經(jīng)濟(jì) 組織直接或間接的經(jīng)濟(jì)或利益的贊助。 本文創(chuàng)新性： 提供證據(jù)：檢索 Pubmed 數(shù)據(jù)庫，檢索時(shí)間：建庫至 2011 07 ， 檢 索 式 ：“ osteosarcoma and 143B and adriamycin and MDR and MRP and LRP”，未見相同文章。 創(chuàng)新點(diǎn)說明：實(shí)驗(yàn)將阿霉素濃度遞增法與間歇誘導(dǎo)法結(jié) 合，采用逐步遞增阿霉素

51、濃度間歇作用的方法，來建立骨肉 瘤耐藥細(xì)胞模型，具有一定的方法創(chuàng)新性；骨肉瘤耐藥機(jī)制 不明，進(jìn)行相關(guān)研究需要有效的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?shí)驗(yàn)為此建立模 型，具有一定的理論創(chuàng)新性。 16 17 18 19 20 21 22 23 24 6918 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 萬方數(shù)據(jù) 人骨肉瘤耐阿霉素細(xì)胞模型的建立及其生物學(xué)特性 作者： 作者單位： 刊名： 英文刊名： 年，卷(期： 陳渝， 王大勇， 翁政， 鄧忠良， Chen Yu， Wang Da-yong， Weng Zheng， Deng Zhong-liang 陳渝,王大勇,翁政,Chen Yu,Wang Da-yo

52、ng,Weng Zheng(重慶市第九人民醫(yī)院骨科,重慶市,400700， 鄧忠良 ,Deng Zhong-liang(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科,重慶市,400010 中國組織工程研究與臨床康復(fù) JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH 2011,15(37 參考文獻(xiàn)(26條 1.Ullah MF Cancer multidrug resistance (MDR:a major impediment to effective chemotherapy 2008 2.Coburger C;Lage H;Mol

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