環(huán)境工程微生物學一微生物細胞數(shù)的計數(shù)

1、環(huán)境工程微生物學實驗實驗六： 細菌的簡單染色與革蘭氏染色適用范圍：環(huán)境工程專業(yè)適用范圍：環(huán)境工程專業(yè)實驗教師：李寧實驗教師：李寧 顧彥顧彥一、目的一、目的（1）了解細菌的涂片及染色在微生物學實驗中的重要性。（2）學會細菌染色的基本技術(shù)，從而掌握微生物的一般染色法和革蘭氏染色法。二、染色原理二、染色原理 由于微生物細胞含有大量水分，對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大,機體是無色透明的，與周圍背景沒有明顯的反差,在普通光學顯微鏡下不易識別，必須對它們進行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。 微生物細胞是由蛋白質(zhì)、核酸等兩性電解質(zhì)及其他化合物組成。所以，微

2、生物細胞表現(xiàn)出兩性電解質(zhì)的性質(zhì)。兩性電解質(zhì)兼有堿性基和酸性基，在酸性溶液中離解出堿性基呈堿性帶正電。在堿性溶液中離解出酸性基呈酸性帶負電。 經(jīng)測定，細菌等電點pH在2-5之間，故在中性、堿性或偏酸性溶液中，細菌的等電點均低于上述溶液的pH值，所以細菌帶負電荷，容易與帶正電荷的堿性染料結(jié)合，故用堿性染料染色的較多。微生物體內(nèi)各結(jié)構(gòu)與染料結(jié)合力不同，故可用各種染料分別染微生物的各結(jié)構(gòu)以便觀察。 ( (一一) )簡單染色法簡單染色法 簡單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細菌染上顏色，如果僅為了在顯微鏡下看清細菌的形態(tài)，用簡單染色即可。三、染色方法三、染色方法(二二)復(fù)復(fù)染色法染色法 用兩種或多

3、種染料染細菌，目的是為了鑒別不同性質(zhì)的細菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性革蘭氏染色法和抗酸性染色法。染色法。 革蘭氏染色法：革蘭氏染色法：不僅能觀察到細菌的形態(tài)，而且還可將所有細菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌革蘭氏陽性細菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細菌革蘭氏陰性細菌，用G-表示。細菌對革蘭氏染色的不同反應(yīng)，是由于它們細胞壁的細胞壁的成分和結(jié)構(gòu)成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。三、染色方法三、染色方法三、染色方法三、染色方法四四、實驗器材、試劑、材料、實驗器材、試劑、材料1. 材料：材料： 枯草桿菌、大腸桿菌。2. 器材：器材

4、： 廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡3. 試劑：試劑： 草酸銨結(jié)晶紫染液 革蘭氏碘液 體積分數(shù)為95%酒精 質(zhì)量濃度為5g/L蕃紅（沙黃）染色液1涂片涂片 取干凈的載玻片于實驗臺上，在載玻片的中央滴一滴無菌蒸餾水，將接種環(huán)在火焰上燒紅，待冷卻后從斜面挑取少量菌種少量菌種(玻片上的水滴混勻后，在載玻片上涂布成一均勻的薄層，涂布面不宜過大涂布面不宜過大。2干燥（固定）干燥（固定） 室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可手持載玻片的一端，標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過23次，共約23秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過不覺過燙為宜（不超過6

5、0）,放置待冷后，放置待冷后，進行染色。切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。標本烤枯而變形。 五、實驗內(nèi)容與步驟五、實驗內(nèi)容與步驟( (一一) )細菌的簡單染色細菌的簡單染色 涂片涂片干燥（固定）干燥（固定）染色染色水洗水洗干燥干燥鏡檢鏡檢3染色染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸復(fù)紅、草酸銨結(jié)晶紫或美藍任選一種)一滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。4水洗水洗 斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈洗下的水呈無色為止無色為止。5干燥干燥 用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠，置于室溫下自然干燥或微熱烘干。用吸水紙時切勿將菌體擦掉。切勿將菌

6、體擦掉。 6鏡檢鏡檢 先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當?shù)囊曇昂螅瑢⒏弑剁R轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細調(diào)焦觀察細菌的形態(tài)。( (一一) )細菌的簡單染色細菌的簡單染色 涂片涂片干燥干燥（固定）（固定） 染色染色水洗水洗干燥干燥鏡檢鏡檢( (二二) )細菌的革蘭氏染色細菌的革蘭氏染色步驟步驟 涂片涂片干燥干燥固定固定初染初染水洗水洗媒染媒染水洗水洗脫色脫色水水洗洗復(fù)染復(fù)染水洗水洗干燥干燥觀察觀察五、實驗內(nèi)容與步驟五、實驗內(nèi)容與步驟1. 涂片、固定涂片、固定染色約1min同簡單染色法。2. 初染初染滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液1-2滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1-2min，水洗。3

7、. 媒染媒染滴加革蘭氏碘液，染色約1-2min，水洗。( (二二) )細菌的革蘭氏染色細菌的革蘭氏染色步驟步驟 涂片涂片干燥干燥固定固定初染初染水洗水洗媒染媒染水洗水洗脫色脫色水水洗洗復(fù)染復(fù)染水洗水洗干燥干燥觀察觀察4. 脫色脫色滴加體積分數(shù)為95%乙醇，約20-30S后即水洗，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止；或滴加體積分數(shù)為95%乙醇后將玻片搖晃幾下即傾去乙醇，如此重復(fù)2-3次后即水洗。5. 復(fù)染復(fù)染滴加沙黃染液（番紅）1-2滴，使染色液覆蓋涂片，染色約2-3min，水洗并使之干燥。6. 鏡檢鏡檢同簡單染色，并根據(jù)呈現(xiàn)的顏色判斷該菌屬是G+細菌還是G-細菌，紫色紫色的是革蘭氏陽性菌，紅色紅色的是革蘭氏陰性菌。革蘭氏染色紫色紫色的是革蘭氏陽性菌，的是革蘭氏陽性菌，紅色紅色的是革蘭氏陰性菌。的是革蘭氏陰性菌。六、注意事項1革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時間，如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認為革蘭氏陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被誤認為是革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規(guī)定。2.染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。3.選用幼齡的